Nükleer manyetik rezonans ve kütle spektroskopisi ile biyotinidaz enzim aktivite ölçüm yönteminin geliştirilmesi

Biyotinidaz (BTD) (EC 3.5.1.12), glikoprotein yapısında yaklaşık 80 kDa ağırlığında karaciğer ve beyin başta olmak üzere birçok dokuda bulunan bir enzimdir. Biyotinidaz enzimi diyetle alınan biyotinil peptitlerden ve biyositinden biyotin vitaminini kopararak serbest bırakır. Bu sayede karboksilaz enzimlerinin kofaktörü olan serbest biyotin sağlanmış olur. Otozomal resesif geçişli bir rahatsızlık olan biyotinidaz eksikliği serbest biyotin döngüsünün bozulmasıyla karakterizedir. Şayet biyotinidaz eksikliğine bağlı olarak metabolizmada serbest biyotin sağlanamaz ise biyotin bağımlı karboksilazlarda (asetil CoA karboksilaz, propiyonil CoA karboksilaz, pirüvat karboksilaz, β-metilkrotonil CoA karboksilaz) aktivite kaybı olur. Bunun sonucunda aminoasit katabolizması, glukoneojenez ve yağ asit sentezi gibi önemli metabolik yolaklarda homeostaz bozulur ve başta nörolojik bozukluklar olmak üzere gelişme gerilikleri, deri hastalıkları gibi birçok hastalık gelişir. Doğal substratı biyositin ve biyotinilpeptidler olan biyotinidaz biyotin ile farklı moleküller arasındaki amid bağlarını parçalayabilir. Biyotinidazın bu özelliğinden faydalanarak enzim aktivitesini ölçmek için Biyotinil-p-aminobenzoat (B-PABA) ve biyotinil-6-aminokinolin gibi yapay substratlar geliştirilerek spektrofotometrik ve florometrik yöntemler ile enzim aktivitesi tespit yöntemleri geliştirilmiştir. Türkiye dahil dünyanın birçok ülkesinde yenidoğan tarama programlarında biyotinidaz enzim eksikliği tanısı için spektrofotometrik ve florometrik yöntemler kullanılmaktadır. Fakat bu yöntemlerin dezavantajı yanlış sonuç verme oranlarının yüksek olmasıdır. Teknolojinin gelişmesi ile birlikte Nükleer manyetik rezonans (NMR), Sıvı kromatografisi tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) gibi yüksek hassasiyetli ileri teknoloji analiz cihazlarının laboratuvarlarda kullanılma oranı artmıştır. Bu tez çalışmasında NMR ve LC-MS/MS cihazlarını kullanarak yüksek hassasiyetli, düşük hata oranına sahip, tekrarlanabilir biyotinidaz enzim aktivitesi ölçüm metodu geliştirilmiştir. Çalışma esnasında yerli üretim Biyotinil Aminoantipirin (BAA) ve en sık kullanılan ticari B-PABA molekülleri substrat olarak kullanılmıştır. Biyotinidaz enzim aktivitesi reaksiyon sonucu ortaya çıkan biyotin miktarının konsantrasyon artışının LC-MS/MS ve NMR cihazı ile tespitine dayanır. Bu bağlamda ilk olarak LC-MS/MS ile biyotine özel parmak izi niteliğinde olana ana ve fragman iyonlar belirlenmiştir. 5 dk lık bu metotta ana iyonun 245 m/z ve fragman iyonun ise 227 m/z biyotine karakterize pikler verdiği tespit edilmiştir. Optimizasyon çalışmaları neticesinde biyotinidaz enziminin 100 mM, pH 6 fosfat tamponu içerisinde, substrat varlığında 37 0C de en yüksek aktiviteyi verdiği belirlenmiştir. Oluşturulan yeni metotta BAA substratı ile istenilen seviyede aktivite alınamamıştır. Substrat olarak B-PABA nın kullanıldığı metotta önceden enzim aktivite değerlerini bildiğimiz numuneler ile korele sonuçlar elde edilmiştir. Metot validasyonu çalışması kapsamında iki farklı numunede 20 tekrarlı ölçüm çalışması sonucunda Y=0,7818 C+0,0662, ve korelasyon katsayısı R2=0.9877 sonucuna ulaşılmıştır. Bir ay süren stabilite çalışmaları neticesinde +4 0C de bekletilen numunelerde aktivite kaybının %15, ve- 20 0C de bekletilen numunelerde ise kaybın sadece %5 olduğu belirlendi. 25 numuneden 3 tekrar ile yapılan ölçüm ve raporlama değerleri çalışması sonucunda standart sapmanın 0.094, Kantitasyon sınırı (LOQ) 0.939 ve Tespit sınırı (LOD) 0.282 IU olduğu belirlenmiştir. Geliştirilen bu yeni LC-MS/MS yöntem ile halen uygulamada olan birçok biyotinidaz aktivitesi ölçüm metodundan daha hassas, daha kesin sonuçlar alınabilmiştir. Protein çöktürme işlemi gerçekleştikten sonra bu yöntem kullanılarak sadece 5 dk içinde hızlı ve güvenilir sonuç alınabilir. Talep edildiğinde, uygun saklama koşullarında muhafaza edilen örneklerin 30 gün sonra dahi tekrar hassas ölçümlerini elde etmek mümkündür.