Poli laktik-ko-glikolik asit nanopartikülleri kullanarak hedefli hücrelerde RNA interferans ile gen susturma yöntemi geliştirilmesi

Pankreas kanseri hem dünyada hem de Türkiye'de mortalite insidans oranı en yüksek kanser türleri arasında sayılmaktadır. Bu veri var olan tedavi stratejilerinin yeterince etkili olmadığını göstermektedir. Modern yöntemlere rağmen henüz etkili bir ilaç tedavisi geliştirilememiştir. Ayrıca tedavi amaçlı kullanılan kemoterapi ilaçlarının tümörü hedef alamaması ve sağlıklı dokular üzerinde etkili olması; tedavi amaçlı kullanılan radyoterapinin ise radyasyona maruz kalan sağlıklı dokuda fonksiyon kaybı oluşturması gibi bu yöntemlerin çeşitli dezavantajları vardır. Kanser tedavisinde geleneksel tedavi yöntemlerinin yerini, tümöre özgü hedeflenmiş yeni nesil tedaviler almaktadır. Hedefe yönelik tedaviler sağlıklı hücrelere zarar vermediği ve yüksek seçiciliğe sahip oldukları için oldukça ilgi görmektedir. RNA interferans (RNAi) tekniği, çekirdekte DNA tarafından kodlanan çift iplikli mi-RNA'nın tek sarmalının sitoplazmada komplementeri olan spesifik mRNA moleküllerini yıkıma uğratması sonucu, gen ekspresyonunun inhibe edildiği doğal, biyolojik bir süreçtir. Antisense etki gösteren moleküllerin hedef mRNA'ya bağlanması, genin eksprese olmasını engellemektedir. RNAi mekanizmasında, antisens etki gösteren mikroRNA (miRNA), küçük engelleyici RNA (siRNA) gibi çeşitli moleküller kullanılmaktadır. Poli (laktik-ko-glikolik asit) (PLGA) nanopartiküller; biyobozunurluk, yüksek biyouyumluluk, düşük toksisite gibi özellikleriyle kanser teşhis ve tedavisinde kullanılmaktadır. PLGA nanopartiküllerin içerisine yüklenen siRNA ile mRNA düzeyinde etkili gen susturulması mümkündür. GPR87 (G-protein bağımlı reseptör 87) geni, GPCR (G protein-bağlantılı hücre yüzeyi reseptörleri) ailesine dahil hücre yüzey reseptörünü kodlayan gendir. Pankreas kanserinde aşırı eksprese olan GPR87 geni hücrelerin canlılığını devam ettirmede önemli rol oynamaktadır. GPR87 geni, siRNA yüklü PLGA nanopartikülleri kullanılarak genin susturulması hücrelerin yaşam süresini önemli derecede etkilemektedir. Bu çalışmada farklı hücrelerde GPR87 geni PLGA nanopartikülleriyle hedeflenerek, genin RNAi mekanizmasıyla post transkipsiyonel susturulması hedeflenmiştir. Bu amaçla ilk olarak GPR87 geni HEK293T hücre hattından izole edilmiş, izole edilen gene özgü tasarlanan primerler ile genin polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) amplifikasyonu gerçekleştirilmiştir. PCR ürünü ve psiCHECK™-2 vektörü XhoI ile kesilerek ligasyonu gerçekleştirilmiştir. GPR87-psiCHECK™-2 rekombinant vektörü E. coli One Shot® Mach1™-T1R hücrelerine transforme edilmiştir. Transformasyon kontrolü PCR, agaroz jel elektroforezi ve biyoinformatik araçlarla kontrol edilmiştir. Daha sonra GPR87 gen dizisine özgü siRNA üretimi gerçekleştirilmiştir. siRNA üretimi ilk önce oligonükleotit template tasarımı gerçekleştirilmiştir. Tasarlanan bu template T7 promoter primer ile hibridizasyonu sağlandıktan sonra Klenow DNA polimeraz ile polimerizasyonu gerçekleştirilerek dsRNA elde edilmiştir. Tezin ikinci aşamasında PLGA nanopartiküllerinin sentezlenmesi, karakterizasyonu, optimum salım süresi ve toksisitesi tespit edilmiştir. Bu amaçla ilk önce water-oil-water (W1/O/W2) çift emülsiyon çözücü buharlaştırılması yöntemiyle PLGA nanopartikülleri hazırlanmıştır. Üç farklı formülasyonda nanopartiküller hazırlanmış ve bu nanopartiküllere siRNA yüklenmiştir. Elde edilen siRNA-PLGA nanopartiküllerinin karakterizasyonları gerçekleştirilmiş, enkapsülasyon veriminin (%EE) ve yükleme veriminin (LE) hesaplanmıştır. Ayrıca oluşturulan nanopartiküllerin in vitro salım süreci optimize edilmiş ve sitotoksisitesi ölçülmüştür. Son aşamada ise üretilen nanopartiküller insan embriyonik böbrek hücre hattı HEK293T ve pankreas hücre hattı 1.1B4 hücrelerinde gen susturma oranları lusiferaz aktivitesi ile tespit edilmiştir. Üç farklı protokol kullanarak hazırlanan siRNA-PLGA nannopartiküllerin gen susturma oranlarının farklı olduğu, yüksek enkapsülasyon ve yükleme verimliliğine sahip olduğu, in vitro salım süresinin istenilen düzeyde olduğu ve ayrıca hazrılanan siRNA-PLGA nanopartiküllerinin genin post transkripsiyonel susturulmasını sağlayarak hücre ölümüne neden olduğu belirlenmiştir.