In vitro koşullarında üretilen koyun embriyolarının kalitelerinin iyileştirilmesi olanakları

Ruminantlara uygulanan süperovülasyon, suni tohumlama, embriyo transferi ve in vitro fertilizasyon (IVF) gibi yardımcı üreme teknolojileri, bu türlerde genetik ilerlemeyi hızlandırmak için faydalı araçlar olmuştur. Bu, çiftlik hayvanı ırklarının insan tüketimi için genetik olarak iyileştirilmesini sağlar ve sürdürülebilirliğe giden bir yol oluşturur. 2050 yılına kadar dünya nüfusunun 7,6 milyardan 9,8 milyara çıkması, kişi başına et ve süt tüketimindeki artışın ise %20 artması beklenmektedir. Küçük ve büyük ruminantlarda IVF sonuçlarını iyileştirme çabalarına rağmen bu türlerde in vitro embriyo oluşum oranları %50'nin altındadır. Ayrıca, in vitro üretilen embriyoların dişi üreme kanalında doğal olarak elde edilenlere göre düşük kalitede olması, postnatal gelişim sırasında sağlıklı, hastalıksız bireyler elde etmek için in vitro embriyoların kalitesinin artırılması içinde önem taşımaktadır. Koyun in vitro embriyo üretimindeki (IVEP) ana dezavantajlar sitoplazmik olgunlaşma, anormal döllenme ve düşük embriyo gelişim yüzdeleri, düşük blastosist, düşük gebelik ve yavru oranlarının nedenleri listenin başında yer almaktadır. Bu sorunlar koyun IVEP etkinliğini %30'un altına düşürmektedir. Bu teknolojilerin daha fazla optimizasyonu, potansiyel olarak ruminant hayvan yetiştirme programlarında yaygın uygulamalara yol açacaktır. Bu çalışmanın ana hipotezi, IVEP süreçleri sırasında gametlerin karşılaştığı stres faktörlerinin ortadan kaldırılması ve oosit ile sperm seçim prosedürlerinin arttırılmasının yanı sıra, IVF ve embriyo için yüksek embriyo gelişim oranlarını garanti eden ve yüksek kaliteli embriyolar elde edilen embriyo üretimine yönelik optimal kültür ortamı ve protokollerinin tasarlanmasını önermektedir. Bu temelde altı deney yapılmıştır. İlk deneyde, dört farklı sıcaklıkta beş farklı yumurtalık taşıma ortamının blastosist oranı ve kalitesi üzerindeki etkisini değerlendirme amaçlanmıştır. Bu deneyin ikinci kısmında, ovaryumlar farklı taşıma ortamları ile nakledildikten sonra, dokuları sabitlenip, ovaryum dokusu içinde mevcut olan yapısal bütünlüğün morfolojisini araştırmak için standart histolojik değerlendirme gerçekleştirilmiştir. Sonuçlar, farklı sıcaklıkların ve taşıma ortamlarının embriyonik gelişimde kritik roller oynadığını göstermiştir. Ek olarak, yeni bir taşıma ortamı (AUZ1) IVF ve bölünme oranlarını önemli ölçüde artırmıştır ve taşıma ortamına (AUZ1) melatonin eklenmesi, antral folikül morfolojisini önemli ölçüde korumuştur. Ayrıca, graaf folikülleri AUZ1'de diğer taşıma ortamlarına göre daha iyi korunmuştur. İkinci deney, koç spermini in vitro aç bırakarak yeni kapasite stratejileri tasarlamayı ve kaliteye etkilerini tahmin etmeyi amaçlanmıştır. Elde edilen sonuçlara göre, açlık ve ardından glikoz eklenerek spermin yeniden aktivasyonunu içeren uygulamada sperm hiperaktif bulunmuş ve oositleri dölleme yeteneğinde önemli bir artış gözlemlenmiş, yüksek oranda zigot üretimine yol açmış ve bu uygulamanın etkileri döllenme sonrasına kadar devam etmiştir. Üçüncü deneyde, sperm kapasitasyon ve IVF ortamına sisteamin ve melatonin eklenmesinin IVF ve embriyonik gelişim üzerindeki etkileri; ayrıca sperm kapasitasyon ortamında C ve E vitamini gibi geleneksel antioksidanların kullanımının etkileri incelenmiştir. Genel olarak, bu deneyin sonuçları, IVF için sperm hazırlama protokolüne melatonin eklenmesinin, sperm dölleme yeteneğini ve in vitro embriyo gelişimini arttırdığını göstermiştir. Melatonin, döllenmeyi takiben embriyonik gelişim üzerinde faydalı bir etkiye sahip bulunmuş, Melatonin + IVF grubu, Cys+IVF grubuna kıyasla blastosist gelişiminde önemli bir gelişme ile kültürün 7. gününe kadar pozitif bir eğilim oluşturmaya devam etmiştir. Dördüncü deneyde, IVF uygulanan oositlerin spermle birlikte fertilizasyon süresinin kısaltılmasından ve diploid fertilizasyon oranının düşürülmesinden fayda sağlanıp sağlamadığının belirlenmesi amaçlanmıştır. Ayrıca, oositlerin in vitro fertilizasyonu için gereken süreyi belirlemeye yönelik spermin oosite ne zaman nüfuz ettiği ve oosit sitoplazmasında erkek pronükleusunun (MPN) oluştuğu belirlenmeye çalışılmıştır. Sonuçlar, gametlerin sadece 6 saat boyunca IVF'e maruz bırakılması, gametlerin 12 saat ve 18 saat birlikte inkübasyonuna kıyasla daha yüksek bir döllenme oranı ve embriyo gelişiminin kalitesinde bir iyileşme ile sonuçlandığını göstermiştir. Ayrıca bu deney, fertilizasyon başladıktan sonra 110 dakika içinde spermin zona pellucida yüzeyine ulaşabildiğini ve IVF sürecine başladıktan sonra 4.5 saat içinde döllenmenin gerçekleştiğini göstermiştir. Beşinci deneyde, farklı kültür ortamlarının in vitro döllenmiş koyun oositlerinin in vitro embriyo gelişimi üzerindeki etkisinin karşılaştırılması amaçlanmıştır. Deneyde bu amaçla M199, SOF, BO, BH ve SAGE olmak üzere beş kültür ortamı kullanılmıştır. İn vitro döllenmiş oositler, embriyonun gelişimi (IVD) için en iyi kültür ortamını seçmek üzere 6-8 gün boyunca her bir ortamda ayrı ayrı inkübe edilmiştir. Sonuç olarak, SAGE ortamında, döllenmiş oositlerin %60'ından fazlası, diğer ortamlara kıyasla istatistik olarak önemli farklılıklar gösterip (p<0.05) blastosist aşamasına ulaşmıştır. Son olarak, altıncı deneyde, oositlerin alındığı ırkın embriyonik gelişime etkisi incelenmiştir. Irkların, embriyonik gelişim üzerindeki etkileri arasındaki fark istatistik olarak önemli bulunmamıştır (p>0.05).