565
Archived Theses
0
DOIs Assigned
0%
DOI Rate
Discipline
Biyobenzer ve hibrit kalıplar kullanarak piezodirençli sensör üretimi
Giyilebilir elektronik son yıllarda esneklik, dayanıklılık ve işlevsel çeşitlilik gibi özellikleri kapsayan kolay üretim yöntemleriyle sensör teknolojisindeki araştırma konularının başında gelmektedir. Giyilebilir elektronik, insan vücudunda gerçekleşen hareketleri; elektronik giyim eşyaları, GPS tabanlı takip cihazları ve kişisel video kayıt cihazları vb. yardımıyla izleyebilmektedir. Akıllı giyilebilir elektronikler yaygınlaştıkça, elektronikle kolayca uyum sağlayan ve uzun süre kullanıldığında kullanıcıların ihtiyaçlarını karşılayan esnek, dayanıklı ve nefes alabilen elektrotlara yönelik gereksinimler de gittikçe artmaktadır. Biyobenzetim bilimi; doğada bulunan organizmaların özelliklerini anlamak, bu özellikleri taklit etmek ve uygulama alanlarına entegre etmek üzerine çalışır. Biyobenzetim çalışmaları; yapay sinir ağları, biyolojik algılama sistemleri, biyolojik materyallerin sentezi, biyoyakıt üretimi, biyolojik veri işleme ve biyolojik sistemlerin optimize edilmesi gibi alanlarda gerçekleştirilebilir. Bu çalışmalar, doğadaki etkili ve verimli süreçlerin anlaşılmasını sağlayarak çeşitli endüstriyel, çevresel veya tıbbi uygulamalar için yenilikçi çözümler sunabilir. Bu tez çalışmasında biyobenzetim uygulamaları alanına katkı sağlaması amacıyla sazan balığı (Cyprinus carpio) pulunun desenleri PDMS ile kalıplanıp taklit edilmiş ve sensör aktif katmanı için kullanılabilirliği araştırılmıştır. PEDOT: PSS polimeri, Ultrasonik Sprey Piroliz (USP) yöntemiyle bu desenler üzerine kaplanarak elektriksel iletkenlikleri sağlanmış ve piezodirençli sensörler üretilerek karakterizasyon işlemleri gerçekleştirilmiştir. Sazan balığı pulunun desenleri ilk defa bu çalışmada PDMS polimeri ile başarılı bir şekilde kalıplanmıştır. Basit üretim basamakları içeren, maliyet etkin bir ince film kaplama yöntemi olan USP kullanılarak PEDOT: PSS polimeri balık pulu desenli PDMS kalıbı üzerinde biriktirilmiştir. Balık pulu desenli PDMS'ler PEDOT: PSS ile kaplandıktan sonra gümüş pasta ile kontak alınarak aktif yüzeyler birbirine temas edecek şekilde ayarlanmış ve farklı gerilim değerleri altında akım geçirgenliği ölçülmüştür. Eniyileştirilmiş biyobenzer ve inorganik desenlenmiş sensörlerden elde edilen yanıt ve toparlanma süreleri 100 ms'nin altında olup literatür ile uyum içerisindedir. Hızlı yanıt ve toparlanma sürelerinin yanında dayanım testleri de yapılan sensörlerin 50 MPa basınçların üzerinde çalışabilirliği gösterilmiştir. Mekanik aktüatör, kalp atım sinyali ve ses dalgaları gibi çok geniş aralıktaki kuvvetlere karşı tepkileri test edilen sensörler başarılı bir şekilde çalışmıştır. Üretim kolaylığı, maliyeti ve uygun yanıt ve tepki süreleri ile bu biyobenzer piezodirençli sensörler giyilebilir elektronik ve IoT uygulamalarında kolayca yer bulabilir. Anahtar Kelimeler: Biyobenzetim, Piezodirençli Sensör, Giyilebilir Elektronik, Ultrasonik Sprey Piroliz.
Opuntia ficus-ındica (hint inciri-Hİ) bitkisi ekstraksiyonu ve kitosan (KS) katkılı biyokompozit üretimi ve biyomedikal uygulamalarda kullanım potansiyelinin araştırılması
Bu tez çalışmasında Opuntia-Ficus İndica (Hİ) bitkisi ekstraktı kullanarak Kitosan (KS) katkılı biyokompozit elde edildi. Hİ/KS biyokompozitinin biyomedikal alanlarda kullanım potansiyellerinin belirlenmesi için antibakteriyel ve karakterizasyon analizleri yapıldı. Çalışmada bitkiden ekstraksiyon işlemi ile elde edilen Hİ ekstratı kurutularak %0,25, %0,50 ve %1'lik oranlarda KS çözeltisine eklendi ve biyokompozitler hazırlandı. Hazırlanan biyokompozitlere döküm işlemi ardından antibakteriyel analiz olarak Shake Flask metodu uygulandı ve uv-vis spektrofotometresi ile absorbans değerleri ölçüldü. Numuneler karakterizasyon ve morfolojik analiz için SEM (Scanning Electron Microscopy) ve FTIR (Fourier Transform Infrared Spectroscopy) testlerine tabii tutuldu. Çalışmada sonucunda %1 Hİ içeren Hİ/KS biyokompoziti yüksek elastikiyet sergilemesi ve antibakteriyel özellik göstermesi sebebiyle ilaç kaplama, yara örtü materyali ve bukkal uygulamalarda kullanılabileceği gözlemlenmiştir. Bu durumun biyokompozitteki Hİ miktarına bağlı olarak değiştiği ortaya konmuştur.
Nanofabrikasyon yöntemi ile tarantula cubensis venomutheranekron, kitosan ve hyaluronik asit kaplanan yara örtü materyalinin in vivo uygulanması
Bu tezin amacı, hücre kültürü çalışmalarında proliferatif etkisi ispatlanan ve bir tarantula türü olan tarantula cubensis venomu olan theranekron (T) farklı dozlarını içeren çok tabakalı kaplama yöntemi (LbL) ile kaplanan yara örtü materyalleri üretmek ve bu materyallerin iyileşme üzerine olan etkisini yara modeli içeren in vivo deneyler ile göstermektir. Tezin in vitro yara örtü materyali üretiminde 2X2 cm boyutlarında kesilen kumaşlar, çok tabakalı kaplama işlemi için gerekli hyaluronik asit (HA) ve kitosan (K) içeriğine farklı konsantrasyonlarda T eklenerek oluşturulan çözeltiler LbL ile kaplandı ve kurumaya bırakıldı. Hazırlanan materyallerin bir kısmına karakterizasyon işlemi için taramalı elektron mikroskopisi (SEM), enerji dispersiv spektrumu (EDS) ve fourier dönüşümlü kızılötesi spektroskopisi (FTIR) analizleri uygulandı. Diğer kısımları ise in vivo deneylerde 16 hayvanın her birinin sırtında açılan 1 cm çaplı dörder adet dairesel şekilli yaralarda kontrol, HA+K, T10, T20, T50, T100, T200, T500 olmak üzere toplam 8 grupta kullanıldı. İki gün arayla pansuman ve fotoğraf çekimleri yapılarak 8. günde sakrifiye edilen sıçanlardan alınan deri dokularının yarısında histopatolojik olarak hematoksilen eozin, masson trikrom ve picrosirius boyama yapıldı. Diğer yarılarında ise büyüme faktörleri olan fibroblast büyüme faktörü (FGF), platelet kaynaklı büyüme faktörü (PDGF), epidermal büyüme faktörü (EGF) ve dönüştürücü büyüme faktörü- β (TGF-β) ekspresyonlarına bakıldı. Kaplama işlemi öncesi yapılan polietilenimin (PEI) ile gerçekleştirilen ön işlemin sonucunda pamuk liflerinin yüzeyinde katyonik yükler oluşturulup yapılan SEM-EDS analizlerinde de işlem görmemiş pamuklu kumaş elementel analiz içeriği %54 C, %46 O olarak bulunmuşken, ön işlem sonucunda elementer analizde % 44.79 C, % 48.56 O, % 6.19 N ve % 0.46 Ca elementleri bulunmuş olup, bu sonuçlar ön işlemin başarılı olduğunu kanıtlamaktadır. Özellikle HA-K kaplanan liflerde kristal formda kitosan partiküller lif yüzeyinde homojen dağılmış şekilde net olarak görülmektedir. 6 farklı dozda T emdirilen kumaşlarda da T doz miktarı arttıkça kitosanın kristalin yapıları SEM görüntülerinde görülememiştir. Yara alanı ölçümlerinde T20 ve T50 gruplarında iylileşme hızının anlamlı bir şekilde artmaya devam ettiği ve yara yüzey alanının hızlıca küçüldüğü görülmekte olup 1 ve 7. günler arasındaki iylileşmenin değişimi yaklaşık sırasıyla %41.32 ve %44.59'dur. T100, T200 ve T500 gruplarında azalan yara yüzey alanları dikkat çekici olup 1 ve 7. günler arasındaki iylileşmenin değişimi yaklaşık olarak sırasıyla %16.12, %15.63 ve %13.43 olarak saptanmıştır. Histopatolojik boyamalarda T10, T20 ve T50 gruplarında iyileşmenin doza bağlı olarak belirginleştiği, neovaskülarizasyonun, kolajen üretiminin ve granülasyon dokusu oluşumunun arttığı gözlenirken T100, T200 ve T500 gruplarında iyileşme olumsuz etkilenerek defekt kapanma miktarı ile neovaskülarizasyon, kollajen üretimi ve bağ doku gelişimi azalmış, hiperemik ve nekrotik alan oluşumları saptanmıştır. PCR ile değerlendirilen EGF gen ekspresyonu düzeyleri özellikle T10, T20 ve T50 gruplarında yüksek saptanırken en yüksek seviyeler T20 grubuna aittir. T100, T200 ve T500 gruplarında ise büyüme faktörü ekspresyonları oldukça az saptanmıştır. Sonuç olarak Theranekron+HA+K içeren yara örtü materyalinin in vivo ve in vitro aşamaları yapıldı ve en ideal yara iyileştiştirici dozun 20 mcg olduğu kanısına varıldı. Bu sonuçların daha detaylı araştırmalar ile de desteklenmesi gerekmektedir.
Kan beyin bariyeri geçirgenliğine yüksek frekanslı elektromanyetik alanın etkisi
Kan beyin bariyeri (KBB) geçirgenliğinin isteğe bağlı olarak ve kontrollü bir şekilde artırılmasının klinik kullanımda sedatif etki ile geç sürede yanıt veren antidepresan etkisinin hızlandırılması gibi bazı avantajlı durumlara yol açabilir. Bu çalışmamızda, farklı sürelerde uygulanan 27,12 MHz radyofrekans elektromanyetik alanın (RF-EMA) KBB'ne zarar vermeden geçirgenliğini arttırıcı etkisi ile uygun süre belirlenmesi hedeflenmektedir. Ayrıca enzim ve proteinlerin bu süreçteki etkileri ve rollleri araştırılmıştır. Çalışmada kullandığımız non invaziv bir tedavi yöntemi olan 27,12 MHz'lik RF-EMA'nın etkileri üzerine yapılan çalışmalarda özellikle dokuların oksijenlenmesini sağlayarak doku rejenerasyonunu hızlandırdığı gösterilmiştir. Yirmi dört yetişkin Wistar Albino dişi ratın kullanıldığı çalışmamızda ratlar 4 gruba ayrılmıştır. Gruplar, Kontrol, 30 dakika, 180 dakika ve 360 dakika'lık RF EMA'ya maruz kalacak şekilde düzenlenmiş ve 10 V/m'lik RF-EMA maruziyeti olacak şeklilde tasarlanan çalışma düzeneğinde uygulamalar yapılmıştır. Uygulamalar sonrası beyin ile beyincik dokuları genel anestezi altında çıkarılmıştır ve beyincik ile beyin dokularından bir kısmı boyama ve immunohistokimyasal (CD31, Haptoglobulin) analiz için toplanmıştır. Diğer kısımları ise Toplam Antioksidan Kapasitesi (TAS), Toplam Oksidan Kapasitesi (TOS), Oksidatif Stres İndeksi (OSI) Biyokimyasal Analizleri ve İnterleukin-6 (IL 6), Hipoksi İndükleyici Faktör-1 Alfa (HIF-1α), Endotel Nitrik Oksit Sentaz (eNOS), Claudin-5 Ve Okludin genetik analizleri için saklanmıştır. Beyin ve beyinciklerin mikroskobik incelemesi yapıldığında kontrol grubunda lezyon bulunmazken, diğer gruplarda uygulama süresine bağlı hafif hiperemi ve ödem gözlenmiştir. Haptoglobulin immün boyalı kesitlerin incelenmesinde sadece 180 dakika ve 360 dakika süreyle maruz kalan gruplarda beyinciklerde hafif ifadeler tespit edilmiştir. HIF-1α düzeyleri 360 dakika uygulanan grupta 30 dakika gruba göre daha fazla artmıştır, ancak eNOS ekspresyonları RF-EMA 30 dakika grubunda en yüksek bulunmuştur. Claudin-5 ifadeleri RF-EMA 180 dakika ve 360 dakika gruplarında anlamlı olarak azalmışken, Okludin tüm üç grupta anlamlı düzeyde azalmıştır. iv Bu çalışma, 27,12 MHz RF-EMA uygulamalarının, farklı sürelerde uygulandığında KBB geçirgenliğini artırabileceğini ve bu etkinin eNOS yoluyla gerçekleştiğini göstermektedir. Uygulama süresinin kısa tutulmasının, KBB yapısına zarar vermeden geçirgenliğini artırmada potansiyel bir avantaj sağlayabileceği sonucuna varılmıştır.
Su mikro-drenaj sistemlerinin bitki kökleri örnek alınarak tasarlanması
Bitki köklerinin su ve mineral maddeleri almak için kullandıkları mekanizma yüz yıllardır araştırılmaktadır. Hâlâ yeni verilerin ortaya çıkıyor olması bitki köklerinin ne kadar eşsiz olduğunun bir kanıtıdır. Giderek artan su problemlerinin yeni geliştirilecek, doğadan ilham alan, kanıtlanmış, çözüm modellerine ihtiyacı vardır. Geçtiğimiz yıllarda birçok biyomimetik çalışma su toplama, suyu arıtma veya yeraltından su çıkarma modelleri gibi projelerde kullanılmıştır. Bu tez kapsamında yaşam alanlarına göre seçilen 10 bitkinin kök ve gövde anatomisi incelenmiştir. İncelenen bitkilerin kesitleri ışık mikroskobu ve SEM elektron mikroskobu ile tarandıktan sonra elde edilen datadan kapiller su taşınmasında kullanılmak üzere bir mikro drenaj malzemesi tasarlanmıştır. Önerilen tasarı Hesaplamalı Akışkanlar Dinamiği (HAD) programında simüle edilmiştir. Tez kapsamında su bitkileri olan Nasturtium officinale (su teresi), Egeria densa (Elodea), Hydrocotyle leucocephala, Hygrophila corymbosa, Hygrophila polysperma; hava köklerini incelemek amacıyla epifit bir bitki olan Phalaenopsis cultivars (orkide); kurak ve yarı kurak bölge bitkileri olan Ferocactus glaucescens (kaktüs) ve Salvia officinalis (adaçayı); ilkel damarlı bitkiler olan Polypodium vulgare (benli eğrelti otu), ve Davallia denticulata (tavşan ayağı eğreltisi) incelenmiştir. Önerilen bu mikro boyuttaki su iletim modülünün tasarımında orkide köklerinde yer alan velamen radikum tabakasının gözenekliliğinden, kaktüs köklerinin kaspari şeritli endodermis tabakasının kalınlığından, eğreltilerin ve su bitkilerinin kapiller basıncı iyi yöneten ksilem anatomik özelliklerinden faydalanılmıştır. Malzemenin modellemesi ve akışkan dinağiminin hesaplanması ileri mühendislik programı olan ANSYS Fluent ile yapılmıştır. iv Hesaplamalar için tasarlanan katmanlı modül iki bölüm halinde ele alınmıştır. Önce suyun mikrofilrosyon yapılarak içeri alındığı porlu tabakadan suyun geçişi hesaplanamıştır. Daha sonra eldilen veriler suyun taşınmasında görevli olan ksilem benzeri kanalda akışkan dinamaği hesaplamak için kullanılmıştır. Yapılan simülasyona göre ksilem kanal geçitlerinin geometrik özellikleri suyun boru içine girerken meydana getirdiği türbülans kinetik enerjisini artırmıştır. Malzeme tasarımında önerilen biyobenzer kılcallığın muhtemelen kavitasyonu azaltması sebebiyle çıkışta akışkan hızının arttığı gözlenmiştir. Sonuç olarak bitki su taşıma sistemlerinden ilham alan bu çeşit bir su iletim malzemesinin mikro boyutta su transferi için enerji tasarrufu sağladığı söylenebilir.
Lactobacillus plantarum bakterilerinden ekstraselüler vezikül (EV) izolasyonu ve cilt üzerine kullanım potansiyeli
Ekstraselüler veziküller (EV) boyutları genellikle 50- 200 nm arasında değişen ve tüm hücrelerden salgılanabilen hücre dışı veziküller olarak tanımlanmaktadır. Bu veziküller tüm ökaryotik hücreler tarafından salgılanır ve tüm vücut sıvılarından izolasyonu mümkündür. Yakın zamanda yapılan çalışmalar ekstraselüler veziküllerin yalnızca hücresel atık olmadığını ve hücreler arası iletişim ve korunmada önemli potansiyelleri olduğunu ortaya koymuştur. Hastalıkların tanı ve tedavisinde kullanımına yönelik çalışmalar olumlu sonuçlar vermiştir. Ekstraselüler veziküllerin hücrelerden salgılanmasının devamında bakteriyel olarak da salgılanabildikleri ve hücrelerden salgılanan ekstraselüler veziküllerle benzer özellikler gösterdikleri keşfedilmiştir. Bu bakteriyel ekstraselüler veziküllerin (BEV) kullanım potansiyelleri, boyutsal olarak membran yapılarından geçerek hedef hücreye ulaşabilme gibi özellikleri sayesinde birçok yenilikçi çalışmaya katkı sağlamış ve sağlamaya devam etmektedir. Probiyotik bakteriler gram pozitif ve simbiyotik ilişkili bakteriler olarak tanımlanırlar. Bu faydalı bakterilerden izole edilen ekstraselüler veziküllerin, vücudun en dış katmanı olan ve dış faktörlere en fazla maruz kalan organı cilt üzerindeki etkilerinin araştırmaları yapılmıştır. Yaşlanmaya bağlı renk değişimleri, kırışıklık gibi olumsuz değişimlere karşı da olumlu etkileri literatür araştırmalarıyla desteklenmiştir. Bu çalışma kapsamında probiyotik özellikler gösteren Lactobacillus türü bakterilerden literatür araştırmaları sonucunda cilt üzerindeki dış faktörlere karşı iyileştirici etki gösteren Lactobacillus plantarum bakterisi kullanılmıştır. Çiğ inek sütünden izole edilen Lactobacillus plantarum bakterileri kültüre edilerek BEV oluşumu sağlanmıştır. Ultrafiltrasyon ve filtreleme yöntemi ile saflaştırılan BEV'ler boyutsal ve konsantrasyon analizleri için Nanopartikül İzleme Analizi (NTA) ile analiz edilmiş ve antibakteriyel özelliklerini belirlemek amacıyla patojen suşlar (Salmonella typhimureum, Escherichia coli, Staphylococcus aureus) kullanılarak Shake Flask Metodu uygulanmıştır. BEV'lerin boyutsal analizleri sonucunda boyutları ortalama 170 nm olarak tespit edilmiştir. Cilt üzerindeki etkilerini belirlemek amacıyla yapılan in vitro çalışmada patojen özellik gösteren bakteriler kullanılarak antibakteriyel özellik gösterdiği doğrulanmıştır.
Kanser tedavi̇si̇ i̇çi̇n modi̇fi̇ye nano/mi̇kromotor bazlı kontrollü i̇laç salım si̇stemleri̇ni̇n geli̇şti̇ri̇lmesi̇
Tez çalışması, kanser tedavisinde geleneksel yöntemlerin sınırlamalarını aşmayı hedefleyen nano/mikro boyutlardaki sentetik motorların geliştirilmesi ve ilaç taşıyıcı sistem olarak kullanımını kapsamaktadır. Sentetik nano/mikromotorlar, kanser hücrelerine yönlendirilebilme ve hassas ilaç salımı yapabilme yeteneklerine sahiptir. Manyetik olarak yönlendirilebilen sentetik nano/mikromotorlar tümör mikroçevresine yönlendirilebilme ve ilaç taşıma yeteneğine sahiptirler. Sentetik nano/mikromotorların sentezlendiği bileşene bağlı olarak yakın kızılötesi (NIR) ışığa duyarlı nano/mikromotorlar kullanılarak ilaçların hassas taşınması ve salınması sağlanmaktadır. Tez çalışması kapsamında, kanser tedavisi için altın (Au) ve manyetik özellik taşıyan nikel (Ni) kullanılarak sentezlenen mikromotorlar, optik ve floresan mikroskobu, taramalı elektron mikroskobu (SEM), Zeta potansiyel ölçümü ve döngüsel voltametri analizi olmak üzere çeşitli metotlar kullanılarak karakterize edilmiştir. Karakterize edilen nano/mikromotorlar farklı bileşenler varlığında fonksiyonelleştirilmiştir. Bu fonksiyonelleştirme işlemi neticesinde dört farklı ilaç konsantrasyonu motorlara yüklenmiş olup, her aşamada motorların hızları ve floresan şiddetleri ölçülerek kaydedilmiştir. Son aşamada DOX yüklü manyetik motorların NIR varlığında ve NIR'sız ortamda farklı pH'larda ilaç salım profili incelenmiş ve motorların ilaç salım profili çift faktörlü doğrulama ile değerlendirilmiştir. In vitro analizler yapılarak elde edilen sonuçların tutarlılığı değerlendirilmiştir. Tez çalışmasının kanser tedavisinde daha yüksek bir tedavi potansiyeli, daha az yan etki ve kişiselleştirilmiş bir tedavi yöntemi sunma yolunda büyük umut vaat ettiği sonucuna erişilmiştir.
Kozmetotekstil uygulamalar için lipozom teknolojisi ile yeni nesil yüz maskelerin üretilmesi
Bu tez çalışmasında, özellikle yaşlanma karşıtı ve UV koruyucu özellikler olmak üzere fonksiyonel özelliklere sahip kozmetotekstil maske geliştirilmiştir. Bitkisel aktif maddelerin tekstil materyallerinden ve cilt gibi diğer substratlara daha kolay transfer davranışını tahmin etmeyi sağlayan Çok Tabakalı Kaplama (LbL) ve lipozom metodolojilerinin birlikte uygulanabilirliği gösterilmiştir. Lipozom vezikülleri çift çözücü yer değiştirmesi (DSD) yöntemi kullanılarak hazırlanmıştır. Lipzomların partikül boyutu, polidispersite ve zeta potansiyeli ölçümleri DLS yöntemine göre karakterize edilmiştir. Dokusuz yüzey pamuklu kumaşlar, LbL yöntemi ile daha önce hazırlanan deve dikeni özütleri içeren lipozomal nanopartiküllerle kaplanmıştır. Kaplama sürecinde kitosan, elektrostatik LbL'nin kendiliğinden birleşmesi için gereken pozitif yükü sağlamak üzere biyouyumlu ve biyolojik olarak parçalanabilir bir polimer görevi görmüştür. Çok tabakalı kaplama işlemlerinden sonra, kumaşların yüzey morfolojisi ve elementel bileşimi, enerji dağılımlı X-ışını spektrometrisi (SEM-EDX) donanımlı taramalı elektron mikroskobu ile incelenmiştir. Biriken nanotabakaların varlığı, zayıflatılmış toplam yansıma Fourier dönüşümlü kızılötesi spektroskopisi (ATR-FTIR) kullanılarak araştırılmıştır. Lipozomal deve dikeni özütleriyle kaplanmış kumaşların antioksidan etkinliği CUPRAC (bakır iyon azaltıcı antioksidan kapasitesi) ve DPPH (1,1-difenil-2-pikril-hidrazil) analizleri ile ölçülmüştür. Ayrıca, deve dikeni özütleri ve lipozomal deve dikeni özütleri ile kaplanmış kumaşların tirozinaz enzimi üzerindeki inhibitör etkisi substrat olarak L-DOPA kullanılarak araştırılmıştır. Dahası, mevcut tez çalışması lipozomal deve dikeni özütleri ile kaplanmış çok tabakalı kumaşların UPF üzerindeki etkisine odaklanmıştır. Ek olarak, anti-tirozinaz etki mekanizmasını açıklamak için, deve dikeni özütlerinde tanımlanan ana bileşenler olan silibinin ve klorojenik asidin hedef protein 3NM8'e moleküler olarak yerleştirilmesi gerçekleştirilmiştir. Bulgular, lipozomal popülasyonun ortalama partikül boyutunun ~223 nm olduğunu, 0.398'lik düşük bir polidispersite indeksine sahip olduğunu ve bunun yüksek partikül homojenliğine işaret etiğini göstermiştir. Ek olarak, lipozomların ve kitosanın zeta potansiyellerinin sırasıyla 28 ve + 68.23 mV olduğu belirlenmiştir. SEM-EDX bulguları, lipozomların elemanlarının kumaşta birleştirilmiş tabakaların artmasıyla değiştiğini ortaya koyarken, ATR-FTIR, lipozomların dokusuz yüzey pamuklu kumaşa başarıyla depolandığına dair kanıt sağlamıştır. Bulgular, kitosanla zenginleştirilmiş deve dikeni fenolikleriyle kaplanmış kumaşlarda önemli seviyelerde tirozinaz inhibitör aktivitesi ve antioksidan yeteneği olduğuna işaret etmiştir. Ayrıca, işlem görmemiş ve ön işlem görmüş kumaşlarla karşılaştırıldığında, özütlerle kaplanmış kumaşın 30.55'lik bir UPF değeriyle çok iyi güneş koruma yeteneği sergilediği bulunmuştur.
Sıçan modelinde polikromatik ışık ve yağ dokusu kökenli mezenkimal kök hücre uygulamasının kornea yara iyileşmesi üzerine etkisi
Sunulan tez çalışmasının amacı kornea yara iyileşmesinde sıçan kornea opasite modeli kullanılarak subkonjonktival enjeksiyon yoluyla adipoz doku kökenli mezenkimal kök hücre (AdMKH) uygulaması ve 600-1200 nm dalga boyu aralığındaki polikromatik ışık kaynağı ile fotobiyomodülasyon (FBM) tedavilerinin tek başına ve birlikte uygulamasının kornea saydamlığı, enflamasyonu ve hücre dışı matriks organizasyonu üzerindeki terapötik etkinliğini ve güvenirliğini değerlendirmektir. Tez çalışmasının ilk aşamasında sıçan AdMKH'lerin izolasyonu, kültürü ve karakterizasyonu yapılmış ve uygulanacak FBM tedavisinin süresi ve enerji dozu için optimizasyon çalışmaları yapılarak tedavi parametreleri oluşturulmuştur. İkinci aşamada, sıçan kornealarına elmas uçlu tur ile mekanik debridman yapılarak kornea opasite modeli oluşturulmuştur. Kornea skarı oluşturulan sıçanlar 4 tedavi grubuna ayrılmıştır: negatif kontrol (NK), AdMKH tedavisi, FBM tedavisi ve AdMKH + FBM tedavisi (n=12). Son aşamada, yaralanmayı takip eden 10. ve 30. günde kornea opasite skoru (KOS) ve neovaskülarizasyon derecesi (NVD) yarıklı lamba muayenesi ile değerlendirilmiş ve merkezi kornea kalınlığı (MKK) ön segment optik koherens tomografi ile ölçülmüştür. Yaralanma sonrası 30. günde kornealar eksize edilerek geçirimli elektron mikroskopi (TEM), hematoksilen ve eozin (H&E), immünohistokimyasal (İHK) boyama ve gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ile analiz edilmiştir. Yaralanmayı takip eden 30. günde, tüm tedavi gruplarında KOS ve MKK değeri NK grubuna göre anlamlı olarak azalmıştır. Neovaskülarizasyon derecesi AdMKH ve FBM + AdMKH gruplarında anlamlı azalırken, FBM grubundaki değişim NK grubuna benzer bulunmuştur. Geçirimli elektron mikroskopi ve H&E boyamada, FBM ve AdMKH tedavilerinin tek başına uygulanmasına kıyasla FBM + AdMKH grubu en iyi yara iyileşme yanıtını göstermiştir. Hasar sonrası artan kolajen tip 1 (COL1) ve kollajen tip 3 (COL3) sentezi FBM + AdMKH grubunda NK grubuna göre anlamlı azalmıştır. Negatif kontrol grubuna göre dönüştürücü büyüme faktörü beta 1 (TGF-β1) değerinde anlamlı azalma sadece FBM + AdMKH grubunda izlenmiştir. İnterlökin 1-beta (IL-1β) düzeyi NK, FBM ve AdMKH gruplarına kıyasla FBM + AdMKH grubunda anlamlı olarak daha düşük bulunmuştur. Sonuç olarak enflamasyonu baskılamada en iyi sonuç FBM + AdMKH tedavi grubunda elde edilmiştir. Tüm tedavi gruplarında α-düz kas aktini (α-SMA) düzeyi, NK grubuna kıyasla anlamlı olarak daha düşük bulunmuştur. Keratokan düzeyi AdMKH ve FBM + AdMKH gruplarında pozitif kontrol grubu ile benzer bulunmuştur. Gerçek zamanlı PCR analizinde COL1, COL3, IL-1β ve α-SMA tüm tedavi gruplarında NK grubuna göre anlamlı olarak azalmıştır. Polikromatik ışık, TEM görüntüleme ve H&E boyamaya göre sıçan lensi, retinası ve endotelinde hasara neden olmamıştır. Bu tez çalışması, in vivo görüntüleme ve in vitro doku analizleri sonucunda subkonjonktival AdMKH enjeksiyonunun ve polikromatik ışıkla FBM tedavisinin (her seansta toplam enerji yoğunluğu 4,6 J/cm2 olmak üzere 3 seans) kornea dokusu rejenerasyonunda etkili ve güvenli olduğunu ve FBM'nin kornea yara iyileşmesi için potansiyel bir tedavi olarak değerlendirilebileceğini göstermiştir. Ayrıca FBM tedavisi, AdMKH'lerle birlikte uygulandığında kök hücrelerin terapötik etkinliği artmıştır.
Osteokondral hasarlar için peptit amfifil ve bor katkısı içeren gradyan özellikli biyomürekkep formülasyonlarının geliştirilmesi
Osteokondral hasarların tedavisinde kullanılan mevcut yöntemler yetersiz kaldığından yeni tedavi yöntemlerinin geliştirilmesine ihtiyaç vardır. Bu amaç doğrultusunda, osteokondral dokunun hiyalin kıkırdak ile subkondral kemik arasında dereceli olarak değişen özellikleri dikkate alınarak doku mühendisliği yaklaşımlarıyla alternatif tedavi yöntemlerinin geliştirilmesi üzerine çalışmalar devam etmektedir. Yapılan çalışmalar arasında üretimde standardizasyon, tekrarlanabilirlik, ölçeklendirme esnekliği ve hastanın kendi hücreleriyle önceden tanımlanmış boyut ve şekilde doku iskelesi üretimine izin veren özellikleri sebebiyle üç boyutlu (3B) biyoyazıcı teknolojisi öne çıkmaktadır. Sunulan doktora tezi kapsamında, gradyan özelliklere sahip osteokondral doku iskelelerinin üretilmesi amacıyla ekstrüzyon tabanlı 3B biyoyazıcıda kullanımı uygun yenilikçi kitosan biyomürekkep formülasyonları geliştirilmiştir. Bu formülasyonlarda kondrojenik farklılaşmayı indükleyecek peptit amfifil (PA) ve osteojenik farklılaşmayı indükleyecek bor katkılı hidroksiapatit (B-nHAp) kullanılmış, ön çalışmalar MC3T3-E1 kemik öncül hücreleri ve göbek kordonu mezenkimal kök hücreleri (MSC) ile yapılmıştır. Tez çalışması kapsamında, kitosan biyomürekkep formülasyonunda kullanılacak olan B-nHAp ve PA'nın karakterizasyon çalışmaları yapılmıştır. Karakterizasyon çalışmaları sonucunda, kütlece %10 B-nHAp ve %2,5 PA içeren kitosan biyomürekkep formülasyonlarının uygun olduğuna karar verilmiştir. Biyomürekkep formülasyonları, 0,628-100 rad/s aralığında kayma incelmesi (shear thinning) davranışı göstermiş ve ~25°C'den sonra jelleşmeye başlamıştır. Kayma incelmesi davranışı, biyomürekkeplerin 3B biyoyazıcıda ekstrüde edilebilirliğinin bir göstergesidir. Tez çalışması kapsamında Derece 4'teki osteokondral hasarlar amaçlanmış ve 5 mm kalınlığındaki gradyan doku iskelelerinin üretimi üzerine çalışılmıştır. Öncelikle 3B biyoyazıcının yazdırma kafalarına entegre edilebilen akış yönlendirici aparat tasarımı yapılmış, ardından uygun yazdırma parametrelerinin belirlenmesi amacıyla ön çalışmalar yapılmıştır. Ön çalışmaların sonucunda, uygun parametreler küt iğne uçlu 20G nozul, 60-70 kPa yazdırma basıncı ve 4 mm/s yazdırma hızı olarak bulunmuştur. Akış yönlendirici aparat kullanılarak, kütlece %26 Pluronic® F-127 destek çözeltisinin içine yazdırılan kütlece %10 B-nHAp ve %2,5 PA içeren kitosan biyomürekkepler ile gradyan doku iskeleleri desen geometrileri bozulmadan 3B biyoyazıcı ile rahatlıkla üretilebilmiştir. Üretilen gradyan doku iskelelerinin karakterizasyon çalışmaları yapılmış ve doku iskelelerinin katmanlarında kemik ve kıkırdak dokularına uygun farklı yapılar gözlenmiştir. Tez çalışması kapsamında elde edilen sonuçlar i) kitosan tabanlı biyomürekkep geliştirilmesi ve ii) subkondral kemikten hiyalin kıkırdağa doğru bor katkılı nano hidroksiapatit-peptit amfifil gradyanı içeren osteokondral doku iskelelerinin üretimidir ve bu sonuçlar osteokondral dokuya özgü biyomürekkep çeşitliliği açısından literatüre katkı sağlayacaktır.
Lizozim tayini için lizozim baskılanmış yüzey plazmon rezonans çipler
Vücutta doğal bir antimikrobiyal savunma mekanizmasına yardımcı olan lizozim, çeşitli dokularda bulunarak mikroorganizmaların hücre duvarlarını parçalayarak etki gösterir. Bu özelliği sayesinde, vücudu bir dizi patojen mikroorganizmadan koruyan önemli bir bileşen olarak kabul edilir. Alzheimer, Chron gibi bazı hastalıkların teşhisi için lizozim tespiti kritik bir öneme sahiptir. Bu tez çalışması, moleküler baskılama tekniğini kullanarak hazırlanan lizozim baskılanmış yüzey plazmon rezonans (SPR) sensörlerin, sulu çözeltiler ve yapay örnekler üzerinde lizozim tayini için kullanılmasını içermektedir. Altın nanopartiküllerin (AuNP) kullanıldığı bu çalışmalarda, AuNP'lerin sağladığı sinyal kazancı dikkat çekicidir. Lizozim baskılanmış polimerik film (MIP), lizozim baskılanmış altın nanopartikül temelli polimerik film (AuNP-MIP) ve baskılanmamış altın nanopartikül temelli polimerik film (AuNP-NIP) SPR sensörleri, analizler ve karşılaştırmalar üzerinden detaylı bir şekilde incelenmiştir. Baskılanmış ve baskılanmamış biyosensörlerin lizozim tespit duyarlılığı, lizozim çözeltileri (pH: 7.4 fosfat tamponunda), yapay idrar, yapay gözyaşı ve yapay plazma kullanılarak araştırılmıştır. Lizozim baskılanmış ve altın nanopartikül kullanılarak hazırlanan sensörler, baskılanmamış ve altın nanopartikül kullanılarak hazırlanmış sensörlere göre lizozime daha fazla duyarlılık göstermiştir. Adsorpsiyon kinetiklerinin belirlenmesi için farklı derişimlerde lizozim çözeltileri kullanılmıştır. AuNP-MIP SPR sensörde kinetik analiz verileri kullanılarak en düşük tayin limiti (LOD) 0.008 µg/mL ve en düşük miktar limiti (LOQ) 0.026 µg/mL olarak hesaplanmıştır. MIP sensörlerde ise bu değerler LOD 0.095 µg/mL iken LOQ 0.317 µg/mL olarak belirlenmiştir. Lizozim baskılanmış AuNP-MIP ve MIP sensörlerin seçiciliğini göstermek için lizozim, miyoglobin ve hemoglobin yarışmacı ajanları kullanılmıştır. Seçicilik deneyleri sonucunda, lizozimin hazırlanan AuNP-MIP ve MIP sensörlere yüksek seçicilik ve duyarlılıkta olduğu gösterilmiştir. Bu çalışmanın sonuçları, lizozim tespiti alanında yeni ve etkili sensörlerin geliştirilmesine katkı sağlamaktadır.
Bor, çinko, magnezyum ve kalsiyum içeren biyoaktif seramik tozların akrilik kemik çimentosunun ısıl ve mekanik özelliklerine etkilerinin incelenmesi
Akrilik kemik çimentoları toz ve sıvı fazdan oluşan iki bileşenli bir sistemdir. Ortopedik cerrahide protez fiksasyonunu sağlamak amacıyla sıklıkla kullanılmaktadır. Kemik çimentosunun toz ve sıvı bileşenleri karıştırıldıktan sonra oluşan hamurumsu karışım kendi kendine kürlenebilen bir yapıya sahiptir. Toz bileşendeki benzoil peroksit ile sıvı bileşendeki n,n-dimetilpara-toluidinin tepkimesi sonucu meydana gelen benzoil radikalleri, metil metakrilatın polimerleşme sürecini başlatır. Polimerizasyon tepkimesi ekzotermiktir ve yüksek miktarda ısı açığa çıkmaktadır. Oluşan bu ısı çevredeki sağlıklı kemik dokuya zarar verir. Protezlerdeki aseptik gevşemenin en büyük nedenlerinden biri kemik dokunun ısıl nekroza uğramasıdır. Bir diğer neden kemik çimentolarının düşük mekanik dayanımıdır. Bu çalışmada standart viskoziteye sahip bir akrilik kemik çimentosuna bor, magnezyum, kalsiyum gibi kemik oluşumu ve onarımında etkili olduğu bilinen minerallerden oluşan seramik tozlar eklenerek kompozit bir malzeme oluşturulması ve bu yolla polimerizasyon sıcaklığının düşürülmesi ve mekanik dayanımın arttırılması hedeflenmiştir. Yerli erişimi kolay ve düşük maliyetli olması sebebi ile borik asit (H3BO3), çinko borat (2ZnO.3B2O3.3,5H2O), magnezyum oksit (MgO) ve trikalsiyum fosfat (Ca3(PO4)2) tozları tercih edilmiştir. Seramik tozlar akrilik kemik çimentosunun toz bileşenine farklı miktar ve partikül boyutlarında tekli (unimodal) ve ikili (bimodal) olarak eklenmiştir. Oluşturulan kompozit kemik çimentolarına sıcaklık ölçümü, basma testi ve eğilme testi uygulanmıştır. Kemik çimentosunun polimerizasyon sıcaklığını düşürmede trikalsiyum fosfatın ve mekanik dayanımı arttırmada çinko boratın en etkili olduğu tespit edilmiştir. Bu iki malzemenin kemik çimentosuna farklı oranlarda birlikte eklenerek ısıl ve mekanik açıdan sinerjik etkisi araştırılmıştır. Kemik çimentosuna ağırlıkça %5 oranında ve partikül boyutu 30 mikrondan küçük çinko borat ve ağırlıkça %5 oranında ve partikül boyutu 88 mikrondan büyük trikalsiyum fosfat karıştırılması ile en düşük polimerizasyon sıcaklığı 63°C±3 elde edilmiştir ve kontrol grubu kemik çimentosunun polimerizasyon sonucu ulaştığı sıcaklıktan yaklaşık 31,9 °C daha düşüktür. En yüksek mekanik dayanıma, ağırlıkça %1 oranında ve partikül boyutu 30 mikrondan küçük çinko borat ve ağırlıkça %5 oranında ve partikül boyutu 88 mikrondan büyük trikalsiyum fosfat karıştırılan kemik çimentosu ulaşmıştır. Eğilme modülü 3370,5±331,5 MPa, eğilme dayanımı 61,03±10,4 MPa ve basma dayanımı 116,3±16,45 MPa olarak kaydedilmiştir ve kontrol grubu kemik çimentosundan daha dayanıklıdır. Sonuç olarak bu çalışmada trikalsiyum fosfat ve çinko borat eklenen kemik çimentosunun polimerizasyon sıcaklığının düştüğü ve mekanik dayanımının önemli ölçüde arttığı raporlanmıştır.
Rekombinant antikor fragmentlerinin üretimi ve genetik modifikasyonuyla sitokin ölçümüne yönelik immünoassay geliştirilmesi
İmmün yanıtın ve inflamasyonun düzenlenmesinde önemli rol oynayan sitokinler, birçok hastalığın tanısında biyobelirteç olarak kullanılırlar. Patojenlere ya da hastalıklara karşı gelişen bu immün yanıt sırasında sitokin derişimleri hızla değişir ve kontrol altına alınamazsa sepsis gibi ağır bir duruma sebep olabilir. Bu sebeple, sitokin seviyelerinin ölçümü erken tanı ve tedavide büyük önem taşımakta, hassas, hızlı ve ekonomik testlerin geliştirilmesi gerekmektedir. Biyolojik örnekler içerisindeki bileşenlerin ölçümünde en hassas ve spesifik yöntemler, antikorların tanıyıcı molekül olarak kullanıldığı immünosensörlerdir. Yüksek afinite ve özgüllükleri sebebiyle biyosensörlerde tanıyıcı molekül olarak kullanılan monoklonal antikorlar (mAb), teşhis ve tedavide önemli bir yere sahiptir; fakat üretim maliyetleri yüksektir. Küçük, glikozillenmemiş antikor fragmentlerinin prokaryotlarda yüksek verimle üretilebilmesi, gerekli zaman ve maliyeti azaltır. Bu bağlamda, tek zincirli değişken fragmanı adı verilen scFv'ler, küçük boyutlu (25 kDa), mAb ile benzer özgüllük ve afiniteye sahip proteinlerdir. ScFv'ler, boyutları sebebiyle IgG'ye kıyasla daha kolay modifiye edilebildiğinden, sensör yüzeylerine immobilizayonlarında farklı yöntemler kullanılabilmesine olanak sağlar. ScFv'lerin yüzeye daha yüksek yoğunlukta ve yönlendirilerek bağlanabilmesi, fonksiyonel antijen bağlanma bölgelerinin sayısını arttırır ve bu şekilde, biyosensörlerin hassasiyeti de arttırılabilir. Bu tez çalışmasında, çeşitli anti-sitokin scFv'lerin, Escherichia coli (E. coli) bakterisinde rekombinant üretimi ve yüksek hassasiyetli immünoassaylerin geliştirilmesi amaçlanmıştır. Bakteriyel üretimin avantajları (düşük maliyet, proses kontrol kolaylığı) kullanılarak kolay, hızlı, hassas ve düşük maliyetli bir immünoassay üretimi temel hedeftir. Sınırlı sayıda çalışmada üretilmiş anti-TNFα, anti-IL6, anti-IL1β ve anti-IFNγ scFv'lerde, verim, geri kazanım, stabilite, bağlanma aktivitesi ve çözünürlük problemleri görülmektedir. Çözünürlük, stabilite, bağlanma aktivitesi ve üretim verimlerinin iyileştirilmesi amacıyla, E. coli SHuffle® T7 Express suşunun kullanımı, daha az oksitleyici sitoplazmik ortamı sayesinde çözünür formda scFv üretimi için ilk hedef olmuş; klonlama adımları gen kasetinin tasarımları doğrultusunda başarıyla tamamlanmıştır. Gen ve proses düzeyinde yapılan optimizasyonlar sonucunda bakteriyel rekombinant protein üretiminde sıkça görülen düşük protein çözünürlüğü ve düşük saflaştırma verimi elde edilmiş; problemin çözümü için sarkozil ile inkülüzyon cisimlerinden aktif protein eldesi sağlanmıştır. Bu yöntemde denatüre edici ajanlar kullanmadan ve tekrar katlama gibi zahmetli deneyler yapılmadan daha yüksek verimde protein elde etme avantajı doğmuştur. İnklüzyon cisimlerinden protein üretim veriminin, çözünür fraksiyondan protein eldesine kıyasla 8-10 kat fazla olduğu görülmüş ve literatürle karşılaştırıldığında yüksek verim ve saflıkta scFv'ler elde edilmiştir (>%95 saflık, 23 mg/mL). Bu teknik, anti-sitokin scFv'ler haricinde, E. coli'de üretilecek diğer rekombinant proteinlerde de kullanılabilecektir. Üretim sonrası immobilize metal afinite kromatografi (IMAC) ile saflaştırılan scFv'lerin SDS-PAGE, Western Blot ve ELISA ile karakterizasyonları yapılmış; sonrasında ilk etapta AuNp ile işaretlenmiş ve yatay akışlı immünosensörler üretilmiştir. Test bölgesinde non-spesifik bağlanmanın görülmesi sebebiyle ELISA tabanlı testlerin üretimi tercih edilmiştir. Sonuç olarak, sitokin ölçümü için kullanılan ticari mAb-temelli kitlerde genel olarak kullanılan ELISA yönteminde mAb fragmentleri (scFv) kullanılmış, teşhis limiti (LoD) 49 pg/mL ve Kd=0,77 µM afiniteye sahip stabil testler üretilmiş ve birçok hastalığın tanısında rol oynayabilecek bir biyoteknolojik ürün için literatüre katkı sağlanmıştır.
Grafen/GelMA/PCL sinir konduit benzeri yapılarda elektriksel stimülasyon altında temel hücre etkileşiminin incelenmesi
Periferik sinir yaralanmalarının sıklığı, yaralanmanın tipine ve yerine göre yaşam standartlarını etkileyen sonuçları, biyolojik greft materyalleri aracılığıyla geleneksel cerrahi tedavi yöntemleri ile karşılaşılan güçlükleri, periferik sinir doku mühendisliği yöntemleri ile mühendislik ürünü biyomateryallerin geliştirilmesine ve bu alanda çeşitli araştırmaların yapılmasında lokomotif rol oynamıştır. Periferik sinir yaralanmasının tipine göre değişmekle birlikte onarımdaki temel amaç bütünlüğü bozulmuş periferik sinir kılıfının bütünlüğünün sağlanmasıyla, rejenerasyon için gereken uygun mikroçevrenin doğala yakın şekilde sunulmasıyla akson uzamasının kontrollü bir şekilde devam ettirilmeye çalışılmasıdır. Bu amaçla geçmişten günümüze konduit ve konduit benzeri doku iskeleleri tasarlanarak, bu bütünlüğü sağlamaya yönelik içi boş veya kompozit yapıda farklı yeteneklerde, farklı özelliklerde doku mühendisliği ürünleri geliştirilmiştir ve geliştirilmeye devam edilmektedir. Bu tez çalışması, grafenin iletkenlik özelliğini ön plana çıkararak geliştirilen kompozit yapıdaki hidrojel konduit öncülü bir doku iskelesi üzerinde yoğunlaşmaktadır. İskele, iletkenlik özelliğinin kendi avantajlarına ek olarak, dışarıdan kapasitif yolla uygulanan elektriksel stimülasyonun nöronal hücre davranışları üzerindeki etkilerini incelemek amacıyla tasarlanmıştır. Bu plana göre üretilmiş indirgenmiş grafen oksit (rGO), jelatin metakrilat (GelMA) ve polikaprolaktondan (PCL) oluşan kompozit yapıdaki hidrojel malzemenin karakterizasyon analizi yapılmıştır. Kompozit yapıyı oluşturan materyallerin hücre ve hidrojel ile uyumu ayrı ayrı ve birlikte değerlendirilmiştir. Karakterizasyon işlemini takiben, bir kare dalga üreteci marifeti ile sağlanan elektriksel stimülasyonun uygulandığı ve uygulanmadığı gruplar birbirleriyle karşılaştırılmıştır. Başta rGO içeren gruplar olmak üzere elektriksel stimülasyon verilen tüm gruplarda proliferasyon lehine sonuçlar alınmıştır. Ayrıca üretilen malzemelerin sitotoksik olmadığı ve biyouyumlu olduğu gözlemlenmiştir.
Anjiyogenik mikroiğnelerin geliştirilmesi ve karakterizasyonu
Anjiyogenez doku onarımı sürecinde başta kök hücrelerin farklılaşması, hücre çoğalması ve migrasyonu gibi önemli hücresel süreçlerin devam ettirilebilmesi için dokuya oksijen taşınmasını sağlarken ayrıca doku hasarından dolayı meydana gelen hipoksi koşullarının doku üzerindeki etkisinin azaltılmasında önemli bir rol oynamaktadır. Östrojen hormonlarının ise memelilerde özellikle yumurtlama döneminde anjiyogenez sürecinde etkili olduğu bilinmektedir. Diğer taraftan son yıllarda penetrasyon arttırıcı özellikleri nedeniyle mikroiğneli (MN) yamalar, çeşitli terapötiklerin transdermal uygulama için ideal platformlar olarak düşünülmektedir. Bu tez kapsamında östrojen (estron (E1), ß-estradiol (E2), estriol (E3)) içeren anjiyogenik mikroiğnelerin geliştirilmesi hedeflenmiştir. Bu amaçla kitosan (CH) ve poli(vinil alkol) (PVA) polimeleri harmanlanarak farklı çapraz bağlayıcılar (gluteraldehit, Glu), tetraetil ortosilikat (TEOS)) ile mikroiğneler hazırlanmış ve mekanik özellikleri karşılaştırılmıştır. Aynı zamanda farklı östrojen türevleri içeren mikroiğnelerin anjigenik etkileri ve in vivo cevapları incelenmiştir. Üretilen mikroiğnelerin morfolojileri ışık ve taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile incelenmiştir. E1 ve E2 içeren mikroiğnelerin yaklaşık 650 m iğne yüksekliğine sahip kare tabanlı pyramidal, düzgün iğne yapısına sahip olduğu ancak E3 içeren mikroiğnelerin morfolojisinin bozulduğu ve düzgün iğne sayısının azaldığı görülmüştür. Diğer taraftan TEOS ve Glu ile çapraz bağlanmış E1 ve E2 yüklü MN'lerin morfolojik görünümlerinin benzer olduğu ve oluşan iğnelerin pürüzsüz ve düzenli bir şekilde sıralandığı gözlenmiştir. TEOS ve Glu kullanılarak çapraz bağlanan E1 veya E2 içeren MN'lerin mekanik karakterizasyonları tekstür cihazı ile incelenmiş olup TEOS konsantrasyonu ve glutaraldehit buharına maruz kalma süresinin, MN'lerin mekanik özelliklerini önemli ölçüde etkilediği görülmüştür. TEOS içeren MN-T gruplarının TEOS içermeyen MN gruplarına göre daha esnek ve daha yüksek bir kuvvette kırılma gösterdiği, E1 veya E2'nin mekanik özellikler üzerinde anlamlı bir değişim meydana getirmediği görülmüştür. Diğer taraftan Glu maruz bırakılan E1 veya E2 içeren mikroiğnelerin Glu buharı uygulama süresinin artmasıyla daha kırılgan bir yapı haline geldiği görülmüştür. Mikroiğnelerin su tutma kapasiteleri incelendiğinde ise TEOS ile çapraz bağlı mikroiğnelerin yeterli çapraz bağa sahip olmadığı, su içinde çözündüğü ve kararlı bir yapı sergilemedikleri izlenmiştir. Glu buharın maruz kalan mikroiğnelerin ise kararlı oldukları 8. günde maksimu %1 kütle kaybına sahip olduğu izlenmiştir. Glu çapraz bağlı mikroiğnelerin ise gluteraldehit buhar süresinin artışıyla birlikte su tutma kapasitesinin azaldığı tespit edilmiştir. E2 içeren ve 15, 30 ve 60 dakika süreyle Glu buharına maruz bırakılan mikroiğnelerin % su tutma kapasitesi %88, 49 ve 31 olarak ölçülmüştür. Östrojen yüklü MN'lerin anjiyogenez üzerindeki etkileri in ovo CAM deneyi ile incelenmiştir. Östrojen yüklü mikroiğnelerin tümünde, içermeyen gruplara göre istatistiksel olarak anlamlı derecede daha yüksek damarlanma tespit edilmiştir (p<0.05). Östrojen yüklü mikroiğne grupları kendi aralarında karşılaştırıldığında ise en yüksek damarlanma E3 yüklü mikroiğne grubunda gözlemlenmiş ve bu artışı sırasıyla E2 ve E1 grupları takip etmiştir. Bununla birlikte E3, E2 ve E1 grupları arasında damarlanma seviyelerine göre istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık görülmemiştir (p>0.05). Bu sonuç, farklı östrojen türevlerinin anjiyogenez üzerinde benzer etkilere sahip olduğunu göstermiştir. Sonuç olarak mikroiğnelerin güvenli dozda anjiyogenezi teşvik edici bir etkiye sahip olduğu görülmüştür. Geliştirilen mikroiğnelerin in vivo yanıtının değerlendirilmesine yönelik olarak E2 içeren ve glutaraldehit buharına maruz bırakılan mikroiğneler seçilerek, sıçanların deri altına implante edilmiştir. MN yamalarının in vivo implantasyonundan 14 gün sonra abdomen bölgesinden alınan örneklerin makroskobik incelemelerinde MN yamaların bağ dokusu içinde dokuyla bütünleşerek dokuya entegre olduğu gözlenmiştir.
Poli (bütilenadipat-ko-tereftalat) (PBAT)-bazlı nanotopografik fibröz doku iskelelerinin üretimi ve hücresel davranışların incelenmesi
Sunulan tez çalışmasının amacı doku mühendisliğinde göreceli olarak daha yeni bir polimer olarak kullanım bulan poli(bütilenadipat-ko-tereftalat) (PBAT) temelli ve nanotopografik yüzey özelliklerine sahip fiberlerin ve fibröz matrikslerin kök hücrelerin mekanotransdüksiyon mekanizması ve hücre davranışları üzerindeki etkilerinin incelenmesidir. Nanotopografik fiberler faz ayırım mekanizmalarıyla desteklenen elektroeğirme yöntemiyle üretilmiş, matrikslerin, fiziksel, kimyasal ve morfolojik yapıları karakterize edilmiştir. İnsan göbek kordonu mezenkimal kök hücrelerinin (GK-MKH) matriksler ve tek fiberler ile etkileşimi hücre kültüründe incelenmiştir. Mekanotransdüksiyon mekanizmasının araştırıldığı hücre kültürü çalışmaları kapsamında nanotopografinin yanısıra polimer kimyasal yapısının da etkisini belirlemek üzere ε-polikaprolakton (PCL) nanotopografik tek fiberler PBAT tek fiberler ile karşılaştırmalı olarak incelenmiştir. Nanotopografik morfolojilere sahip fiberleri oluşturmak için kötü çözücüyle indüklenen faz ayrılması (NIPS), buharla indüklenen faz ayrılması (VIPS), nefes şekilleri (BF) ve termal olarak indüklenmiş faz ayrılması (TIPS) mekanizmaları kullanılmıştır. PBAT için, tetrahidrofuran (THF), diklorometan (DCM), 1,1,1,3,3,3-hekzafloro-2-propanol (HFIP) çözücüleri iyi çözücü olarak, dimetilsülfoksit (DMSO) çözücüsü kötü çözücü olarak seçilmiştir. İkili bileşimde THF çözücüsü DMSO ile, DCM çözücüsü HFIP ile eşleştirilmiştir. THF/DMSO grubu için polimer konsantrasyonu % 12 (w/v), çözücü hacim oranları 9/1 (v/v) olarak, DCM/HFIP grubu için ise polimer konsantrasyonu % 10 (w/v), çözücülerin hacim oranları ise 8/2 (v/v) olarak belirlenmiştir. Bu bileşimler sonucu üretilen fiberlerin gözenekli, buruşuk ve oluklu morfolojide oldukları, HFIP çözücüsü kullanılan gruplardaki fiberlerin ise pürüzsüz morfolojide oldukları, taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile belirlenmiştir. Ortalama fiber çapları SEM görüntülerinden hesaplanmıştır. Gelişigüzel ve hizalanmış formülasyonlar için ortalama çap değerleri 2141 ± 860 nm ve 867 ± 487 nm arasında değişmiştir. İki farklı yüzey nanotopografisine sahip PBAT doku iskelerinin (THF/DMSO-buruşuk ve HFIP-pürüzsüz) biyolojik performansları 14 gün boyunca araştırılmıştır. Hücre kültür çalışmaları kapsamında GK-MKH'lerin bu iskeleler üzerindeki morfolojileri, tutunma, çoğalma davranışları; SEM, F-aktin/DAPI immünofloresan boyama (ICC), Alizarin Red boyama ve MTT analizleri ile incelenmiştir. Analiz sonuçlarından, buruşuk nanotopografideki iskeleler üzerindeki hücrelerin tutunma-yayılma davranışının daha belirgin olduğu ve mineralizasyonun daha yoğun olduğu tespit edilmiştir. Ayrıca bu iskelelerde, osteojenik farklılaşmayı temsil eden belirteçler olan RUNX2, OPN ve OCN için bağıl gen ifadelerinin istatistiksel olarak daha yüksek bir ekspresyon seviyesine ulaştığı RT-PCR analiz sonuçlarından görülmüştür. Çalışmanın mekanotransdüksiyon çalışmaları kapsamında, PBAT ve PCL tek fiberler kendi bazal membranları üzerine faz ayırım destekli elektroeğirme yöntemiyle desenlenmiştir. GK-MKH'lerin polimerik tek fiberlerin nanotopografilerine verdikleri cevap F-aktin/DAPI, fibronektin ve integrin ICC boyamaları ile ortaya konulmuştur. Mekanotransdüksiyon mekanizmasında önemli bir rol oynayan YAP (Yes ile ilişkili protein)'ın görüntülenmesi için ICC boyamaları gerçekleştirilmiştir. ImageJ-FIJI yazılımı ile örneklerin floresan görüntülerinden çekirdek ve sitoplazma boy/en oranları; YAP sinyal oranları ve integrin-fibronektin alanları için sayısal veriler elde edilmiştir. Elde edilen analiz sonuçları istatistiksel olarak karşılaştırılmıştır. Bu aşamada elde edilen bulgular sonucunda, PBAT-bazlı buruşuk nanotopografik yüzeylerde kuvvetli hücre-yüzey etkileşimine bağlı lamellipodia yapılarının belirginleşmesi, integrin ve fibronektin miktarının artması ve özellikle YAP'ın sitoplazmadan çekirdeğe geçişi belirgin bir şekilde gözlenmiştir. Bu durum aktin boyama ve çekirdeğin daha büyük boy/en oranı vermesi ile desteklenmiştir. Çalışmada kullanılan pürüzsüz fiberlerde hücrelerin daha az uzama ve yayılma gösterdiği, hücre iskeletinin çoğunlukla çekirdek etrafında lokalize olduğu görülmüştür. Çalışma kapsamında elde edilen PBAT-bazlı fiber yapılardaki morfolojik değişimlerin ve kimyasal yapının sinerjik etkisi ile hücre tutunma, yayılma gibi pek çok hücresel fonksiyonun daha etkin bir şekilde indüklendiği görülmüştür. Hücresel aktiviteler ve mekanotransdüksiyon üzerinde en etkili olan polimerik yapı PBAT ve en iyi morfoloji de buruşuk nanotopografi olarak belirlenmiştir. Elde edilen bulguların klinik çalışmalarda kullanılabilecek, 3B nanofibröz iskelelerin tasarımına, mekanotransdüksiyonla ilişkili konularda ilgili literatüre ve uygulamalara katkı sağlaması beklenmektedir. Anahtar Kelimeler: Elektroeğirme, ε-polikaprolakton (PCL), poli(bütilenadipat-ko-tereftalat) (PBAT), nanotopografi, mekanotransdüksiyon, insan göbek kordonu mezenkimal kök hücreler (GK-MKH).
Seramik faz içeren yumuşak doku ogmentasyon jellerinin hazırlanması ve karakterizasyonu
Travma, güneşin zararlı etkileri, beslenme yetersizliği ya da doğal yaşlanma süreciyle yumuşak dokularda zaman içinde doku kayıpları, deri veya deri altı doku atrofisi, bağ doku zayıflığı gibi çeşitli klinik durumlar ortaya çıkabilmektedir. Buna ek olarak konjenital olarak da çeşitli deri, deri altı ve bağ doku hastalıkları nedeniyle de benzer klinik durumlar görülebilmektedir. Bu klinik kusurların ortadan kaldırılabilmesi, atrofi durumunda yumuşak dokuların rejenerasyonu, deri kırışıklığı, dolgunluk veya turgor/tonus kaybının giderilmesi amacıyla sistemik olarak kullanılabilen diyet destek ürünlerinin yanı sıra deriye haricen uygulanabilen ya da deri altı dolgusu olarak kullanılabilen pek çok materyal önerilmiş ve halen yeni, etkin materyallerin üretilmesi, eski materyallerin geliştirilmesi çalışmalarına devam edilmektedir. Bu yöndeki çabalara katkı olarak bu tez çalışması ile yumuşak doku onarımı ve ogmentasyonu için özel bir formülasyonla tasarlanmış enjekte edilebilir bir deri altı implant malzemesi geliştirilmesi amaçlanmıştır. Malzeme, kalsiyum hidroksiapatit (Ca-HAp) seramik fazının, karboksimetil selüloz (CMC), gliserol ve saf sudan oluşturulan bir taşıyıcı jel içinde dağıtılmasıyla hazırlanmıştır. Sentezlenen malzeme bileşenlerinin biyouyumlu, biyobozunur ve seramik fazın biyoaktif olduğu literatürdeki birçok çalışmayı destekler nitelikte çalışmamız kapsamında da doğrulanmıştır. Geliştirilen jel formülasyonu çeşitli analitik tekniklerle kapsamlı bir şekilde karakterize edilmiştir. Fourier dönüşümlü kızılötesi spektroskopisi (FTIR) ile yumuşak doku ogmentasyon malzemesi ve bileşenlerinin kimyasal yapı analizleri gerçekleştirilirken, X-ray difraksiyonu (XRD) kullanılarak seramik partiküllerinin kristal fazları ve yapısal özellikleri belirlenmiş; termogravimetrik analiz (TGA) ile formülasyonun termal stabilitesi ve bozunma davranışları değerlendirilmiştir. Taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile Ca-HAp partiküllerinin yüzey morfolojisi ve boyut dağılımı gözlemlenmiş, partikül boyutlarının yaklaşık 20−60 μm arasında olduğu doğrulanmıştır. Elemental analiz, hidroksiapatit yapısında Ca/P oranının 1.65 olduğunu göstererek, bu stokiyometik oranın literatürle uyumlu olarak seramik fazın nihai ürünün etkinliğine, biyouyumluluğuna ve biyoaktifliğine yaptığı katkıya işaret ettiği değerlendirilmiştir. ICP-MS analizi ile malzemenin cerrahi implant kullanımı için uygun olduğu ve ağır metal içeriği bakımından risk taşımadığı gösterilmiştir. Reolojik analizlerle, sırasıyla 2 ve 5 Hz frekansta 58.6 ve 68.9 kPa depolama modülü ve 21.7 ve 24.8 kPa kayıp modülü değerleri ortaya konmuştur. Bu veri ile malzemenin uygulanacağı anatomik bölge içerisinden göç etmeden kalabileceği ve implante edileceği dokuya eş değer nitelikteki mekanik özellikler barındırdığı değerlendirilmiştir. Geliştirilen malzeme morfolojik, kimyasal, termal ve reolojik açılardan test edildikten sonra in vitro çalışmalarla sitotoksisite analizi ile değerlendirilmiştir. Hücrelerin canlılık yüzdeleri 5 mg/mL için % 87,34 ve 10 mg/mL için % 61,38 olarak belirlenmiştir. Örneklerimizin uygun dozlarda sitotoksisite belirtisi göstermediği ve hücrelerin büyümesi ve çoğalması için uygun bir ortam yaratabileceği, mikroçevre ile etkileşimde iskele görevi görebileceği değerlendirilmiştir. MTT analizi ile biyouyumluluğu test edilen malzememiz sıçan deri altı ogmentasyon deney modelinde ticari pozitif kontrol örnekle karşılaştırılmıştır. In vivo deneylerde, sterilize edilmiş 150 μL Ca-HAp/CMC jeli sıçanların sırt derisinin altına enjekte edilerek pozitif kontrolle karşılaştırmalı olarak histolojik ve histomorfometrik açılardan değerlendirilmiştir. Histolojik bulgular, sentezlediğimiz Ca-HAp/CMC jelinin dermal kalınlık, elastik lif ve kolajen yoğunluğunda anlamlı düzeyde; kolajen yoğunluğunda kontrol grubuna oranla 120. gün sonunda %12,77, elastik fiber yoğunluğunda ise %9,64 artış sağladığını göstermiştir. Histomorfometrik analizler, bu malzemenin fibroblastik büyümeyi desteklediğini ve yeni kolajen ve elastin oluşumunu teşvik ettiğini doğrulamıştır. Özetle bu çalışma ile, özel bir formülasyonla sentezlediğimiz Ca-HAp/CMC ogmentasyon jelinin biyostimülatör etkinlik gösterdiği, aynı zamanda immünojenik ve toksik olmadığı, önemli bir yan etki ve komplikasyon profili göstermediği ve biyouyumlu olduğu doğrulanmıştır. Geliştirilen malzemenin, in vivo koşullarda implante edilen anatomik bölgeye başarılı bir şekilde entegre olduğu, fibroblastik büyümeyi desteklediği, yeni kolajen oluşumunu teşvik ederek üç boyutlu hacimsel stabilite kapasitesi gösterdiği belirlenmiştir. Sonuç olarak, formülasyonumuzun yumuşak doku onarımı ve ogmentasyonu için umut verici bir seçenek olabileceği ortaya konulmuştur.
Pnömotoraks Tedavisine Yönelik Biyobozunur Doku İskelesi Destekli Hücre Tabakası Tasarımı
Sunulan tez çalışmasında; akciğerin dinamik hareketlerini kısıtlamadan, mevcut basınca ve hareketlere dayanıklı, dikiş ve yapıştırma gerektirmeyen, pnömotoraks tedavisine yönelik hücre tabakasına dayalı alternatif bir tedavi yöntemi üretmek hedeflenmiştir. Bu hedef doğrultusunda hücre tabaka teknolojisinden faydalanılmıştır. İnsan göbek kordonu kaynaklı mezenkimal kök hücrelerinden (GKMKH) askorbik asit (vitamin C, VC) varlığında hücre tabakası elde edilmiştir. Bu amaçla hücre kültürü yüksek ekim yoğunluğunda (5x104 hücre/cm2) ve kültür ortamına 20 µg/mL VC eklemesi yapılarak gerçekleştirilmiştir. Elde edilen hücre tabakasının tek başına kullanımı yeterli dayanımı sağlayamayacağından, nanolifli yüzey ile hücre tabakaları desteklenmiştir. Çalışmanın ilk kısmında, nanolif yüzey eldesi için polikaprolakton (PCL)/jelatin (gelatin, GEL) çözeltisi kullanılarak elektroeğirme ile doku iskelesi üretilmiştir. Yüzeye antimikrobiyal özellik sağlanması amacıyla geniş spektrumlu amoksisilin (AMX) i yüklemesi yapılmıştır. Elektroeğirme yönteminde elektroeğirme/ ağ (ESN) tekniği ile nano-lif/ağ (NFN) matriksler elde edilmiştir. Sentezlenen NFN matrikslerin karakterizasyon çalışmaları için; Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) ve Enerji dağılım X ışını (Energy dispersive X-ray, EDX) ile fiber morfolojileri ve yapıları incelenmiş, X ışını Fotoelektron Spektroskopisi (XPS), Fourier Dönüşümlü Kızılötesi Spektroskopi (FTIR) Analizleri ile NFN matriks yapıları doğrulanmış ve özellikleri belirlenmiştir. Üretilen doku iskelelerinin mekanik dayanımları için çekme ve hidrolitik bozunma testleri yapılmıştır. Doku iskelelerinin yapısına yüklenen AMX enkapsülasyon verimi ve NFN matrikslerden salım profili incelenmiştir. AMX antibiyotiğinin matriks içindeki etkinliği, NFN matrikslerin antibakteriyel aktivite testi ile incelenmiştir. Üretilen NFN matriks yapılı doku iskelelerinin hücreler üzerindeki toksik etkisine sitotoksisite testi ile bakılmıştır. Çalışma sonuçları üretilen NFN matrikslerin pnömotoraks tedavisi için potansiyelini ortaya koymuştur. Çalışmanın ikinci kısmında, üretilen NFN matriksler ile elde edilen GKMKH tabakaları birleştirilmiştir. NFN matrikslerle desteklenen hücre tabakalarının hedef dokuya uygunluğunun belirlenmesi için matriks-malzeme etkileşimleri, mekanik dayanımları incelenmiştir. Bu amaçla NFN matriks destekli hücre tabakalarının canlılık testleri, SEM, konfokal, çekme analizleri ve histolojik inceleme için Hematoksilen & Eozin (H&E) boyaması yapılmıştır. Analiz sonuçları, GKMKH'lerinden elde edilen hücre tabakalarının üretilen NFN matrikslerle mükemmel bir uyum içerisinde olduğunu göstermiştir. Sonuç olarak, pnömotoraks tedavisine yönelik biyobozunur doku iskelesi destekli hücre tabakaları başarılı bir şekilde elde edilmiştir. Bu ikili yapının, biyouyumluluğu, yüksek mekanik dayanımı ve uygulanabilirliği ile pnömotoraks ve plevral hasarlarda alternatif bir tedavi yaklaşımı olarak değerlendirilebileceği belirlenmiştir.
Abdominal cerrahide kullanılmak üzere PHBHHx membranların hazırlanması ve karakterizasyonu
Abdominal cerrahi sonrası iyileşme sürecinde hastaların yaklaşık %90'ında peritoneal adezyonlar gelişmektedir. Adezyonlar, iyileşme sürecinden kaynaklanan anormal fibröz veya skar dokusudur. Yapışkanlık önleyici olarak degrade olmayan polypropilen ve polietilenterrafitalat meshlerin dışında, degrade olabilen poliglaktin, poliglikolik asit, poli4-hidroksibutirat meshlerde kullanılmaktadır. Degrade olan meshlerin mekanik problemlerinin yanı sıra adhezyon problemi görülmüştür. Sunulan tez çalışmasında abdominal cerrahi sonrası oluşan yapışıklıkların önlemek için PHBHHx membranlarının hazırlanması ve in-vitro, karakterizasyonun yapılması amaçlanmıştır. PHBHHx membranların serbest yüzey enerjilerini düşürmek, fibroblast adhezyonunu engellemek, pıhtılaşma faktörlerini uyarmamak için oleik asit, polietilen glikol-400 (PEG), PEG-8000, izopropil miristat ilave edilerek modifiye edilmiştir. PHBHHx membranların serbest yüzey enerjileri, dinamik mekanik test cihazı ile mekanik özellikleri, su tutma kapasiteleri, belirlenmiştir. Modifikasyonlar ile insan fibroblast hücre adhezyonu korele edilmiştir. Aynı zamanda modifikasyonun sitokin salımına etkisi, hücresel oksidasyona etkisi, insan serum albümin bağlama kapasitesi belirlenmiştir. Kan pıhtılaşma faktörlerini etkilemeyen, hücre adhezyonuna izin vermeyen, proinflomatuar sitokinleri uyarmayan formülasyonlar belirlenmiştir.
Telomeraz aktivitesi tayinine yönelik yüksek enerji dönüşümlü floresan partiküllerin biyosensör olarak kullanımı
Bu tez çalışması kapsamında, nadir toprak elementlerinin yüksek enerji dönüşümü (up-conversion) özelliğini ve antikor etkileşim süreçlerinin hassas seçim kabiliyetini kullanarak silika nanoyapıları ile vücut sıvısından telomeraz tespitini yapabilecek bir tanımlayıcı florofor probun geliştirilmesi amaçlanmıştır. Telomeraz enzimi, sınırsız bölünme yeteneğine sahip hücrelerde (kanser hücreleri) ekspresyonu oldukça yüksek olarak literatürde rapor edilmiş bir enzimdir. Buradan hareketle, telomeraz enziminin sekrasyon miktarını saptayacak bir biyosensör, genel kanser taraması ve kanserin erken teşhisi için bir umut olabilir. Günümüzde yaygın ve ölümcül bir hastalık olan kanserin erken dönemde teşhis edilmesi durumunda tedavisinin mümkün olduğu bir hastalıktır. Telomeraz miktarı ve aktivitesindeki anomaliler bu bağlamda bilim insanlarına ön bilgi vermektedir. Bu gerekçeyle, yeni nesil problar ile vücut sıvısından telomeraz varlığını araştırabilecek bir florofor prob geliştirmek hedeflenmiştir. Bu tez çalışması kapsamında, silika nanopartiküller taşıyıcı ana gövde olarak seçilmiştir. Literatürde Stöber yöntemi olarak bilinen yöntem ile sentezlenmiş ve bunlara yardımcı bağlayıcı gruplar (NH, OH vb.) ile modifiye edilmiştir. Modifiye edilen silika nanopartiküller ön deneme olarak, organizmada fizyolojik ve biyolojik açıdan önemli bir yer teşkil eden demir ile alakalı olan ''transferrin'' antikoru ile yapılmıştır. Transferrin antikoru başarılı bir şekilde temel silika nanopartiküllere bağlanmış ve antijen yakalama ve tespit etme kabiliyeti ve kapasitesi analizler ile ölçülerek rapor edilmiştir. Kanserin erken teşhisi için, benzersiz emisyon özellikleri olan yüksek enerji dönüşümlü lantanit katkılı silika (silika@lantanit) probların denemesinden önce yapılan bu ön deneylerde transferrin antijenin vücut sıvısındaki miktarını ölçmeye yarayan bir biyosensör olmuştur. Ön denemelerin başarılı bir şekilde sonuçlanmasından sonra, ölçülecek proteinden alınan sinyal farklarının daha yüksek ve daha keskin alınmasını sağlamak amacı ile sentezlenen silika nanopartiküllerin çekirdeğine evropiyum lantanit iyonu yerleştirilmiş ve alınan sinyalin daha yüksek ve kalıcı olması için de anten görevi görecek bir organik malzeme ile bu yapı desteklenerek bir florofor prob haline getirilmiştir. Daha sonra bu malzemeye, Si@Eu (Eu katkılı silika), ''telomeraz'' antikoru bağlanarak dekore edilmiş ve bir immüno prob halini almıştır. Hem florofor hem de immün etkileşimi olan bu nano sensör '' immünoprob'' olarak adlandırılmıştır. Telomeraz antijenini yakalamaya hazır hale getirilmiş olan bu problar ile deneyler yapılmıştır. Ticari antijen ve gerçek kanser hücrelerinden ekstrakt edilmiş antijenler ile etkileşime sokularak ortam absorpsiyon sinyalleri değerlendirilmiştir. Bu analizlerde yüzey karakterizasyonu, modifikasyonun her aşamsında yüzey potansiyeli ve elektron mikroskobu incelemeleri, FT-IR, elektroforez, UV spektrometri ve spektroflorometri analizleri yapılmış ve sonuçlar, başarılı bir şekilde rapor edilmiştir. Bu çalışma neticesinde elde edilen net veriler şunlar olmuştur; 1) Silika nanoyapılar ön denemelerde bir prob haline getirilmiş ve toplam demir bağlama kapasitesi (TIBC) analizi yapabilecek medikal bir sensör geliştirilmiştir. 2) Silika nanoyapılar florofor problara dönüştürülerek, yüksek enerji dönüşümlü (YED) prob halini almış ve ticari antijen ile gerçek antijeni kayda değer oranlarda yakalamayı başarmıştır. 3) Elektroforez analizlerinde, yüksek enerji dönüşümlü (YED) nanoprobların, ticari boya olan Cy2@Green ile yarışması sonucunda elde edilen bant görüntüleri, dissosiyasyon davranışları ve keskinliklerden de biyo-sensör olmasının yanısıra iyi bir belirteç olduğu da görülmüştür. Özetle, silika nanoyapıların uygun ve işlenebilir yapıları sayesinde; lantanitlerin enerji dönüşümlerinin kararlılığı ve antikor-antijen etkileşimlerinin yüksek seçiciliği sayesinde hem ticari kararlılığı yüksek bir biyo belirteç sentezlenmiş hem de tezin ana çalışması olan kanserin erken teşhisine olanak veren, telomeraz miktarının tayinini saptayacak bir biyosensör başarılı bir şekilde üretilmiştir.
Hyaluronik asit saflaştırması için çekirdek – kabuk yapısına sahip silika partiküllerin geliştirilmesi
Bu çalışmada, ekonomik değeri yüksek olan Hyaluronik Asit (HA)'in saflaştırılması ve ayırımı için amfifilik polimer çekirdek – silika kabuk (core-shell) özellikli afinitesi yüksek partikül geliştirilmesi amaçlanmaktadır. Bu hedef doğrultusunda estetik, sağlık ve kozmetik sektörlerinde yaygın olarak kullanılan biyomalzemelerden HA'nın ayrılması ve saflaştırılması için Stöber yöntemi ile hibrit çekirdek-kabuk silika jel bazlı partiküller sentezlendi. Elde edilen partiküllerin son yıllarda gözde olan kromatografik teknik olan hidrofilik ayırım kromatografisi, HILIC, temellerine uygun olduğu gözlendi. Ayrıca üstün özellikleriyle birlikte çekirdek – kabuk teknolojisine sahip partiküller de kromatografi dolgu malzemeleri arasındaki ticari payı ve yerini gün geçtikçe arttırmaktadır. Sentezlenen partiküllerin hyaluronik aside karşı afinitesini arttırmak için fonksiyonel ligand olarak seçilen L-aspartik asit ile yüzey modifikasyonu gerçekleştirildi. Hazırlanan 0,6 µm L-aspartik asit modifiyeli çekirdek – kabuk hibrit silika partiküllerin (mod-SiO2@P1) yüzey alanı 240 m2/g ve 5,3 µm boyutunda olan L-aspartik asit modifiyeli çekirdek – kabuk hibrit silika partiküllerin (mod-SiO2@P2) yüzey alanı 440 m2/g'dır. Karakterizasyon yöntemlerinden olan Fourier dönüşümlü infrared spektroskopisi (FTIR), taramalı elektron mikroskopisi (SEM), geçirgenlik elektron mikroskopu (TEM), termogravimetrik analiz (TGA), ışık saçılım yöntemli (DLS) partikül boyut analizi ve yüzey alanı ölçümleri (BET) ile karakterize edildi. Sulu çözeltide ve bakteri lizatı ortamında hyaluronik asit adsorpsiyonu ve desorpsiyonu mod-SiO2@P1 ve mod-SiO2@P2 hibrit çekirdek – kabuk partiküller ile gerçekleştirildi. Kullanılan tampon sisteminin adsorpsiyonu etkilediği görüldü ve maksimum hyaluronik asit adsorpsiyonu mod-SiO2@P1 partikülleri için 25,85 mg/g ve mod-SiO2@P2 partikülleri için 65,25 mg/g olarak fosfat tamponu varlığında, pH 7 değerinde gerçekleştirildi. Adsorpsiyon-desorpsiyon döngüleri sonucunda mod-SiO2@P1 ve mod-SiO2@P2 hibrit çekirdek – kabuk partiküllerin adsorpsiyon kapasitesinde önemli bir azalma olmadığı gözlendi. mod-SiO2@P2 partikülleri ile kesikli sistem haricinde sürekli sistem çalışmaları da yapıldı. Partiküllerin tekrar kullanılabilirliği de ayrıca incelendi. HPLC analizleriyle deneysel verilerin doğrulamaları yapıldı.
Fotostimülasyonun 2 ve 3 boyutlu in vitro hiperglisemik modellerde insan dermal fibroblast, keratinosit ve endotel hücreleri üzerindeki etkinliğinin incelenmesi
Bu çalışma "2-Boyutlu ve 3-Boyutlu in vitro Diyabetik Ülser Modellerinde Fotostimülasyonun Etkinliğinin Araştırılması" başlıklı kapsamlı araştırma projesi (FBA-2022-20162) kapsamında Hacettepe Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinasyon Birimi (BAP) tarafından desteklenmiştir. Sunulan tez çalışmasında fotostimülasyonun insan dermal fibroblast, keratinosit ve endotel hücreleri üzerindeki biyolojik etkilerinin diyabetik koşulları taklit eden 2 ve 3 boyutlu in vitro hiperglisemik modellerde incelenmesi amaçlanmıştır. Diyabetik hastalarda sıklıkla karşılaşılan kronik yaralar, özellikle hiperglisemi nedeniyle hücresel proliferasyonun ve göçün azalması, yetersiz anjiyogenez, re-epitelizasyon, artan oksidatif stres gibi birçok faktörle ilişkilidir. Bu kapsamda fotostimülasyonun yara iyileşmesindeki hücresel ve moleküler süreçler üzerindeki etkilerinin in vitro çalışmalarla araştırılıp diyabetik yara tedavisindeki kullanım potansiyelinin ortaya koyulması hedeflenirken, tedavi yaklaşımlarının denenebileceği in vitro hiperglisemik modellerin geliştirilmesi de hedeflenmiştir. Gerçekleştirilen in vitro çalışmalarda ilk olarak insan dermal fibroblast (HDF), keratinosit (HS2) ve endotel hücrelerinin (HUVEC) kültürü yapılmıştır. Hücreler farklı glikoz konsantrasyonları kullanılarak oluşturulan ortamlardaki proliferasyon ve morfoloji özellikleri incelenerek bir hiperglisemik koşul belirlenmiştir. Belirlenen hiperglisemik koşullarda ve normal koşullarda fotostimülasyon uygulaması yapılarak hücrelerin morfoloji, proliferasyon, ECM sentezi, göç ve anjiyogenez üzerindeki etkileri çeşitli analiz yöntemleri ile incelenmiştir. Hücre proliferasyonu MTT analizi, hücre göçü scratch analizi, ECM sentezi immünositokimyasal analizler, anjiyogenez ise tübül oluşumu ve gen ekspresyonu analizleri ile karşılaştırmalı olarak değerlendirilmiştir. Daha sonra fibroblast ve keratinosit hücreleri ile polikaprolakton (PCL) / kitosan-jelatin doku iskelesi üretilerek 3-boyutlu bir hiperglisemi modeli oluşturulmuştur. Oluşturulan modelde, fotostimülasyonun yara iyileşmesi üzerine etkisini incelemek üzere 600-1200 nm dalga boyunda, yakın kızılötesi (NIR) polikromatik ışın sağlayan plazma ark ışık kaynağı kullanılarak fotostimülasyon uygulaması yapılmıştır. Bu uygulama karşısında hücre canlılığı, morfolojisi ve ECM yoğunluğu üzerindeki etkisi SEM ve MTT analizleri ile incelenmiştir. Çalışmada gerçekleştirilen analizler doğrultusunda fotostimülasyonun 2 ve 3-boyutlu modellerde hücresel proliferasyonu, göçü, ECM sentezini ve anjiyogenez sürecinde kritik rolü olan tübül oluşumunu desteklediği görülmüştür. Ayrıca hücrelerin biyolojik yanıtları göz önünde bulundurulduğunda keratinositlerin, fotostimülasyona en duyarlı hücreler olduğu, endotel hücrelerinin ise hiperglisemik koşullardan en çok etkilenen hücreler olduğu belirlenmiştir. Bu sonuçlar, fotostimülasyonun diyabetik yara tedavisinde potansiyel tedavi yöntemi olarak kullanılabileceğine dair umut vermektedir. Ancak bununla birlikte yapılacak olan yeni analizlerle bu 3-boyutlu hiperglisemik modelin optimize edilmesinin, in vivo ve klinik çalışmalar öncesinde önemli bir basamak oluşturacağı düşünülmektedir.
Simvastatin için kontrollü ilaç salım sisteminin geliştirilmesi
Bu çalışmada, simvastatinin kontrollü salınımı için moleküler baskılama tekniği (MIT) kullanılarak, farklı derişimlerde poli(2-hidroksietil metakrilat-N-methacryloyl-L- tryptophan methyl ester) kriyojel membranlar sentezlendi. Sentezlenen simvastatin baskılanmış (MIP) ve baskılanmamış (NIP) kriyojel membranların sentezi, -20 °C sıcaklıkta ve 24 saat süreyle gerçekleştirildi. Kriyojel membranlar yaklaşık 10 mm çapında ve 1.0 mm kalınlığında hazırlandı. Farklı derişimlerde (0.5 mg, 0.75 mg ve 1 mg) hidrofilik simvastatin içeren kriyojel membranlar sırasıyla MIP-I, MIP-II ve MIP-III olarak hazırlandı ve her grup membran üzerine ilaç yükleme miktarının salım üzerine etkisini değerlendirmek amcıyla, 0.05 mg/mL, 0.25 mg/mL ve 0.5 mg/mL simvastatin çözeltileri hazırlanarak, loading işlemi yapıldı. Poli(HEMA-MATrp) kriyojel matrislerinin kimyasal ve morfolojik özellikleri karakterizasyon teknikleri ile değerlendirildi. Hazırlanan membranların şişme özellikleri ve çapraz bağlayıcı oranlarını değerlendirmek için şişme testleri gerçekleşti ve kalıp molekülün hidrofilik doğası nedeniyle hem şişme ve hem makropor oranı üzerinde artırıcı bir etkiye sahip olduğu belirlendi. Fourier dönüşümlü kızılötesi (FTIR) spektroskopisi, kriyojel matrisinde bulunan fonksiyonel grupları belirlemek ve sentez sırasında meydana gelen kimyasal değişiklik derecesini değerlendirmek için uygulandı, böylelikle simvastatin spektrumunda 3,551 cm-1 ve 870 cm-1'de, aromatik hidroksi ve asimetrik eterik grupların OH gerilmelerine ait pikler bulundu, dolayısıyla membranlar içindeki simvastatinin bozulmamış yapısı doğrulandı. Kriyojel membranların yüzey yapısı, taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile üç farklı yüksek çözünürlükte tanımlandı. 3-[4,5-Dimetiltiazol-2- il]-2,5-difenil-tetrazolyum bromür (MTT) testi yapılrak kriyojel membranlardaki hücre canlılığı, simvastatin yüklendikten 24 saat sonra sırasıyla 41 ± 2.71, 54 ± 1.38, 60 ± 3.88, 53 ± 1.04 olarak rapor edildi. X-Işını Kırınımı (XRD) yöntemi, malzemelerin kristal yapısını belirlemek için kullanıldı ve simvastatin, kırınım açısındaki (2θ) keskin pik noktaları (10.98°, 15.70°, 16.62°, 17.32°, 17.82°, 18.88°, 19.50°, 22.12° ve 22.66°) sayesinde yüksek kristallik sergilemiştir, böylece simvastatinin kristal formda olduğu tespit edildi. Kriyojel membranlardan ilaç salım hızının frklı çapraz bağlayıcı oranları (5:1, 10:1 ve 20:1), farklı ortamın pH değerleri (pH 4, pH 5, pH 6 ve pH 7.4), ortam sıcaklığı (37 °C ve 25 °C) ve yüklenen ilaç miktarı ile değiştiği gözlemlendi ve çalışmanın sonucunda en iyi salınım MIP-III kriyojel membranların 10:1 çapraz bağlayıcı oranında, fizyolojik (pH 7.4) değerinde, 37 °C sıcaklık ortamda ve 0.5 mg/mL simvstatin çözelti ile yüklendiğinde gözlemlendi. Kriyojel membranların sterilite testi için, nutrient agar ve nutrient broth besi yeri kullanıldı ve membranlar besi ortamına ekildi ve 2-5 gün (37 °C) inkübasyona bırakıldıktan sonra, ortam incelendi ve herhangi bir bakteri üremesi gözlemlenmedi. Bu çalışmanın kinetik parametrelerini (ka, kd ve KD) elde etmek için, SIM baskılanmış poli(HEMA-MATrp) (MIP) ve baskılanmamış (NIP) yüzey plazmon rezonans (SPR) sensörleri tasarlandı. Moleküler baskılama yöntemi ile hazırlanan SPR sensör ve SIM arasındaki bağlanma kinetik analizi ve adsorpsiyon modelini belirlemek amacıyla farklı izoterm modelleri uygulandı. Simvastatinin (0.001-1 mg/mL) derişim aralığındaki veriler değerlendirildiğinde elde edilen derişim-∆R grafiklerinden küçük ve büyük derişimler için sırasıyla (y=9.799x-0.0061) ve (y=3.3314x+1.585) denklemleri elde edilmiştir. Elde edilen bu grafikten doğrusallık katsayısı ise sırasıyla (R2 = 0.997) ve (R2 = 0.9255) olarak bulunmuş ve %99 doğrulukta ölçüm yapabilmektedir. Bu çalışmanın kontrollü simvastatin salınımına yönelik, moleküler baskılama yöntemiyle hazırlanan kriyojel membranın avantajlarının karşılaştırılması bakımından, literatüre katkı sağlayacağı düşünülmektedir.
Investigation of the effects of perceptual salience on target tracking behavior performance of zebrafish during rheotaxis
Zebrafish (Danio rerio) are freshwater fish inhabiting rivers and lakes in the South Asian region. During their behavior known as rheotaxis, they exhibit a tendency to orient their bodies againts the water flow, thereby displaying station keeping. Objects present in the flowing water can create areas of reduced current velocity behind them by obstructing the flow in specific regions. Particularly in situations of high current velocity (> 0.5m/s), fish seek refuge behind such objects to avoid being carried away by the current. One of the most important problems that may arise in the system description of multimodal sensory integration dynamics is that sensory salience profoundly affects behavioral control. Perceptual salience is the tendency for one sensory system to become more dominant or salient compared to the others. Particularly salient sensory inputs are processed more dominantly by the Central Nervous System (CNS), which in turn shapes behavioral responses. For example, experiments on zebrafish have shown the effect of sensory salience when studying the fish's swimming behavior against a current (rheotaxis). In a custom-built speed-controlled swim tunnel, a D-shaped tube was placed to alter the flow. It produced mechanosensory cues upon movement, while its red inner stick elicited visual stimuli, tracked by the fish. While the zebrafish followed these visual and mechanosensory signals, the weights of the relevant sensory signals were rapidly updated by the CNS according to the sensory salience levels. Therefore, understanding the impact of perceptual salience on multi-sensory integration dynamics is one of the main objectives of this thesis. We utilized tubes of different sizes (2cm, 4cm, and 6cm in diameter) made of red-colored 3D printed material and plexiglass (6cm) to locally disrupt water flow in a speed-controlled experimental setup. The tubes were moved sinusoidally by a motor at frequencies of 0.05Hz, 0.10Hz, 0.25Hz, 0.55Hz, and 0.95Hz. The experimental conditions encompass four different stages: 1) Attaching a 6cm plexiglass tube outside the 2cm, 4cm, and 6cm red tubes in a well-lit environment, 2) Conducting the experiment without attaching the 6cm plexiglass tube outside the 2cm, 4cm, and 6cm red tubes in a well-lit environment, 3) Attaching a 6cm plexiglass tube outside the 2cm, 4cm, and 6cm red tubes in a dark environment, 4) Conducting the experiment without attaching the 6cm plexiglass tube outside the 2cm, 4cm, and 6cm red tubes in a dark environment. These perceptual salience conditions were tested with N=5 fish. Analysis of the results indicates that fish exhibit superior tracking behavior at lower frequencies compared to higher frequencies. Furthermore, as the diameter increases, the consistency of the tracking behavior improves, resulting in enhanced performance. This suggests that the mechanosensory system plays a more dominant role in tracking behavior of zebrafish. However, when the visual system is also engaged, tracking behavior becomes more consistent. The integration of these two sensory systems allows for more effective responses to environmental stimuli. This information may have potential applications in the treatment of multisensory disorders, and the novel experimental setup we designed, which is not yet reported in the literature, may be a valuable tool for disease diagnosis, treatment, and future research.
Sinoviyal eklem sıvısında fosfolipid zenginleştirme için monodispers-mezoporoz SiO2 metal oksit afinite kromatografisi (MOAC) sorbentinin geliştirilmesi
Hastalıkların teşhisi, seyrinin izlenmesi ve tedavi etkinliğinin gözlemlenmesi tıp biliminin önde gelen odak noktaları arasında yer almıştır. Geleneksel yöntemler bu yönüyle erken müdahale imkânı açısından günümüz şartlarında yetersiz kalabilmektedir. Laboratuvar teknolojileri ve kromatografik yöntemlerdeki gelişmeler, klinik tabloların moleküler düzeyde incelenmesine olanak sağlamış; zaman, işgücü ve maliyet etkin alternatiflerin önünü açmıştır. Osteoartrit (OA) de dahil olmak üzere artropatilerin teşhisi, seyrinin izlenmesi ve tedavi etkinliğinin değerlendirilmesi genellikle hastayla gerçekleştirilen kalitatif parametrelere dayalı anketler aracılığıyla yapılmaktadır. Kantitatif karşılaştırmaların yapılabileceği analitik bir yöntemin geliştirilmesi, tedavi planlaması başta olmak üzere klinik süreçlere fayda sağlayacaktır. Sinoviyal eklem sıvısı (SES), eklem bölgesi için sürtünmeyi azaltan bir kayganlaştırıcı olmakla beraber, aynı zamanda kıkırdak ekstrasellüler matrisi ve vasküler dolaşım sırasında salınan moleküller için bir transfer ortamıdır. Sinovyum, menisküs, eklem bağı ve eklem kapsülü gibi yapılar, sinoviyal eklem sıvısına sekresyon yoluyla çeşitli belirteçleri eksprese eder. Kemik ve kıkırdak homeostazisi için yapım ve yıkım olayları sonucunda oluşan anabolitler ve katabolitler de SES'e difüze olur. Dolayısıyla SES'in etkileşime girdiği doku ve sistemlerde yaşanabilecek anormal bir durum, moleküler düzeyde sinoviyal eklem sıvısına da yansımaktadır. Tez çalışması kapsamında SES içerisinde bulunan fosfolipidlerin (FL'ler) özgül ve seçici olarak tespitine yönelik bir mikroekstraksiyon sorbentinin geliştirilmesi hedeflenmiştir. Bu amaçla SiO2, SiO2@PEI ve SiO2@PEI@Ti(IV) aday sorbentler olarak belirlenmiştir. Önçalışmalar neticesinde SiO2 ile elde edilen sonuçların daha anlamlı olması sebebiyle deneysel çalışmalar monodispers-mezoporoz SiO2 mikrosferler ile gerçekleştirilmiştir. Monodipers-mezoporoz SiO2 mikroküreler, çok basamaklı hidroliz kondenzasyon yöntemiyle sentezlenmiştir. Mikrokürelerin karakteristik yapıları SEM, XPS, XRD, ICP-OES ve BET yöntemiyle incelenmiştir. Sinoviyal eklem sıvısı, eklem kıkırdağı ile ilişkili biyobelirteçleri içerdiğinden çalışmalar bu biyolojik materyal üzerinden gerçekleştirilmiştir. Sıvı-sıvı ekstraksiyon (SSE) yöntemiyle SES'ten ekstrakte edilen lipit fraksiyonu, monodispers-mezoporöz SiO2 mikrokürelerle etkileştirilerek fosfolipid zenginleştirme performansı açısından incelenmiştir. SSE sonrası katı faz ekstraksiyon (KFE) protokolü ile elde edilen fraksiyonda toplam 141 FL karakterize edilirken, konsantre ekstrakttan SSE sonrası elde edilen fraksiyonda tespit edilen FL sayısı 164 civarında bulunmuştur. Bu iki sayının birbirine yakın olması zenginleştirmenin başarılı olduğu ve FL'ler açısından seçici olduğunu göstermektedir. Ekstraksiyon verimliliği her iki yöntemle tespit edilen 44 ortak pik üzerinden değerlendirilmiştir. Sonuç olarak FL zenginleştirmesi, önerilen KFE protokolüyle başarıyla gerçekleştirilmiştir. Önerdiğimiz KFE protokolü ile SES'te gerçekleştirilen FL zenginleştirme işlemi sonucunda sorbentin FL zenginleştirmede başarılı olduğu ortaya konmuştur. Monodispers-mezoporöz SiO2 mikroküreler, SES örneklerinde FL'lerin seçici olarak zenginleştirilmesi için uygun bulunmuştur. Bu mikrokürelerin, OA'ya yönelik araştırmalar da dahil olmak üzere fizyolojik ve patolojik durumlarda FL değişikliklerini tanımlamak için kullanılabileceği sonucuna varılmıştır.
Osteokondral doku mühendisliğinde tabakalı hibrit yapıların geliştirilmesi
Bu çalışmada kemik doku mühendisliği ve osteokondral doku mühendisliği uygulamalarında kullanılmak üzere seramik ve deselülerize kemik katkılı Poli(gliserol sebakat) (PGS) elastomer bazlı doku iskeleleri tasarlanmış, üretilmiş ve karakterize edilerek kemik ve osteokondral doku mühendisliğindeki etkinlikleri in-vitro hücre kültürü çalışmalarıyla belirlenmiştir. Tez çalışmasının birinci bölümünde PGS elastomeri subkondral kemik doku iskelesi olarak kullanılmak üzere farklı miktarlarda hücresizleştirilmiş (deselülerize) kemik (deK) hücre dışı matriksi (ECM) ile fonksiyonelleştirilmiştir. Tez çalışmasının ikinci bölümünde ise subkondral kemik doku iskelesi olarak kullanılmak üzere PGS elastomeri farklı miktarlarda β-TCP katkısıyla fonsiyonelleştirilmiştir. Ayrıca, osteojenik farklılaşma bağlamında gözenek boyutu ile PGS elastomer bileşimi arasındaki karmaşık etkileşim de tez çalışmasının ilk iki bölümünde ortaya konmuştur. Tez çalışmasının son bölümünde mezenkimal kök hücreler üzerinde osteojenik etkinliği kanıtlanan seramik ve kemik katkılı subkondral doku iskeleleri kullanılarak bifazik osteokondral doku iskeleleri üretilmiş, karakterize edilmiş ve osteokondrojenik etkinlikleri in-vitro hücre kültürü çalışmalarıyla belirlenmiştir. Tez çalışmasının ilk iki bölümü TÜBİTAK, BİDEB, 2214A- doktora öğrencileri için uluslararası araştırma burs programı tarafından desteklenerek Trinity College Dublin, Trinity Biomedical Sciences İnstitute'de gerçekleştirilmiştir. Tez çalışmasının üçüncü bölümü ise Hacettepe Üniversitesi BAP komisyonu tarafından 19746 No'lu proje ile desteklenmiştir. Tez çalışmasının birinci bölümünde MSC'lerin osteojenik soy taahhüdü için dokuya özgü ipuçları içeren ve uygun bir mikro yapı ile kemik doku mühendisliği için PGS elastomeri bazlı biyouyumlu ve biyoaktif bir doku iskelesi geliştirilmiştir. Bu doğrultuda PGS elastomeri, osteoindüktif potansiyelini artırmak amacıyla ağırlıkça %14 ve %28 deselülerize kemik (deK) ECM kaynağı ile fonksiyonelleştirilmiştir. İn-vitro osteogenez için tercih edilen gözenek boyutunu belirlemek amacıyla küçük (100–150 μm) ve büyük (250–355 μm) iki farklı gözenek boyutuna sahip PGS/deK doku iskeleleri tuz uzaklaştırma yöntemiyle üretilmiştir. PGS/deK subkondral doku iskelelerinin hücresizleştirilmiş kemik ECM ile fonksiyonelleştirilmesi, ilkin hücre tutunma verimini %100'e çıkarırken ve osteojenik farklılaşmayı da iyileştirmiştir. Aynı zamanda doku iskelesinin mekanik gücünü 165 kPa'ya kadar artırmıştır. PGS yapısına kemik katkısıyla birlikte ayrıca gelişmiş bir bozunma oranı/pH değişimi ve ıslanabilirlik ile başarılı bir şekilde uyarlandığı ortaya konmuştur. %28 kemik katkılı küçük gözenekli (KG) PGS/deK doku iskelesi, 28 günlük inkübasyon sonrası %12 kütle kaybına uğramış ve ortamın pH değeri yaklaşık 7,14 olarak ölçülmüştür. PGS/deK doku iskelelerinde MSC'lerin in vitro osteojenik farklılaşması, kalsiyum ölçümü, Alkalin fosfataz (ALP) ifadesi ve alizarin kırmızısı ile kanıtlandığı gibi, küçük gözenek boyutlu ve %28 (a/a) kemik katkılı doku iskelelerinin daha iyi bir osteojenik soy taahhüdünü sağladığı ortaya konmuştur. Bu çalışma ile kemik doku iskelesi olarak uyarlanmış PGS/deK doku iskeleleri aracılığıyla MSC'lerin osteoindüksiyonu için uygun gözenek boyutu ve hücresizleştirilmiş kemik ECM miktarı gösterilmiş ve kemik doku mühendisliği uygulamaları için etkili bir aday olduğu ortaya konmuştur. Tez çalışmasının ikinci bölümünde dokuya özgü ipuçları içeren ve uygun bir mikro yapı ile PGS elastomeri bazlı biyouyumlu ve biyoaktif subkondral doku iskelesi geliştirilmiştir. Bu doğrultuda PGS elastomeri, osteoindüktif potansiyelini artırmak amacıyla ağırlıkça %14 ve %28 β-TCP katkısı ile fonksiyonelleştirilmiştir. Aynı şekilde in-vitro osteogenez için tercih edilen gözenek boyutunu belirlemek amacıyla küçük (100–150 μm) ve büyük (250–355 μm) iki farklı gözenek boyutuna sahip PGS/β-TCP doku iskeleleri tuz uzaklaştırma yöntemiyle üretilmiştir. PGS yapısına %14 β-TCP katkısıyla birlikte elastik basma modülü 30.56 kPa olarak ölçülmüştür. Yapıda artan β-TCP miktarıyla doku iskelesinin elastik basma modülünde ileri bir iyileşme gözlenmemiştir. Bununla birlikte doku iskelelerinin hidrofilisitesi β-TCP katkısıyla birlikte anlamlı şekilde artmıştır. PGS yapısına katılan seramik miktarındaki artış ile hücre ekim verimliliği %100 olarak ölçülmüştür. β-TCP inkülüzyonu içermeyen küçük gözenekli doku iskelesi (PGS-0TCP-KG) %40.7'lik hücre yapışması gösterirken, PGS-5TCP-KG doku iskelesi %58.3 ve PGS-15TCP-KG doku iskelesi %100 verimle hücre yapışması sergilemiştir. Yapıdaki yüksek β-TCP inkülüzyonuna rağmen doku iskelesi gözenek boyutunun artmasına bağlı olarak PGS-15TCP-BG doku iskelesinde hücre ekim verimliliği %32.3'ye düşmüştür. PGS/β-TCP kemik doku iskelelerine ekilen domuz kökenli BMSC'lerin SEM analizinde, küçük gözenekli doku iskelesi yüzeyinde geniş yayılma alanı ve doğru kontraktil hücre fenotipi sergilemesinin osteojenik soy taahhütü için faydalı olabileceğini göstermiştir. İn-vitro osteojenik indüksiyon ortamında 21 gün kültür sonrası tüm doku iskelelerinde osteojenik farklılaşmanın geç belirteci olarak Ca miktarı artarken, ALP ifadesindeki artış 21.güne kadar uzamıştır. MSC'lerin osteojenik farklılaşmalarının bir ileri belirteci olarak doku iskelelerinde mineralizasyon Alizarin kırmızısı ile belirlenmiştir. Özellikle küçük gözenekli PGS/β-TCP doku iskelelerinde yoğun pozitif Alizarin kırmızısı gözlenmiştir. Bu çalışma ile kemik doku iskelesi olarak uyarlanmış PGS/β-TCP doku iskeleleri aracılığıyla MSC'lerin osteoindüksiyonu için uygun gözenek boyutu ve β-TCP miktarı gösterilmiş ve kemik doku mühendisliği uygulamalarında başarılı bir şekilde kullanılabileceği ortaya konmuştur. Tez çalışmasının üçüncü bölümünde subkondral doku iskelesi olarak ilk iki bölümde en iyi etkinliği gösteren PGS-15deK-KG ve PGS-15TCP-KG doku iskeleleri kullanılarak bifazik osteokondral doku iskeleleri üretilmiştir. Kondral tabaka yerine gözenek boyutu 0-45 μm aralığında tutularak PGS/deK ve PGS/β-TCP subkondral doku iskelesi kalıplarının üzerine kondral tabaka kalınlığı 1 mm'nin üzerinde olacak şekilde belirli miktarda tuz aktarılarak bifazik osteokondral doku iskelelerinin kalıbı oluşturulmuş ve tek seferde yerinde PGS'nin in-situ polimerizasyonu sağlanmıştır. Bifazik ostekondral doku iskeleleri OC-PGS-15deK ve OC-PGS-15TCP olarak adlandırılırken, seramik veya kemik katkısı içermeyen bifazik kontrol doku iskelesi OC-PGS-Ktrl olarak adlandırılmıştır. Yüksek hidrofilik yapıdaki bifazik osteokondral doku iskelelerinin aynı zamanda %90'ın üzerinde çapraz bağlı olduğu belirlenmiştir. Bifazik osteokondral doku iskeleleri 28 günlük inkübasyon sonrası %13 bozunma oranına sahipken tabakalar arası bütünlük korunmuştur, ortam pH değeri 7.2 olarak ölçülmüştür. Bifazik osteokondral doku iskelelerine kondral tabakaya hücre ekimi deselülerize ve nötralize kıkırdak ECM pre-jeline enkapsülasyonu ile gerçekleştirilmiştir. Bifazik osteokondral doku iskelelerinin kondral tabakaya sıçan BMSC, subkondral tabakaya MC3T3-E1 preosteoblastik hücrelerin ikili kültürü ile hem osteojenik hem de kondrojenik farklılaşma ipuçlarını içeren osteokondrojenik farklılaşma ortamında 28 gün in-vitro kültürü gerçekleştirilmiştir. 28 gün kültür sonrası kondral ve subkondral kemik tabakalarında DNA ve GAG miktarı her bir tabaka için bağımsız ve aynı zamanda kümülatif olarak ölçülmüştür. Histolojik analizler ile osteokondral doku oluşumuna yönelik ipuçları ortaya konmuştur. Anahtar Kelimeler: Kemik doku mühendisliği, poli(gliserol-sebakat) (PGS), β-TCP, deselülerizasyon, osteokondral doku mühendisliği, kemik, kıkırdak, pBMSC, rBMSC, MC3T3-E1
Vezikovajinal fistül onarımı için pro-anjiogenik/antibakteriyel doku interpozisyon flep eşleniğinin tasarımı ve geliştirilmesi
Vezikovajinal fistül (VVF), mesane ve vajina arasında sürekli idrar kaçırmaya neden olan olağan dışı bir açıklıktır. VVF' nin tedavisi fistülün boyutu, yeri ve cerrahın deneyimi gibi etmenlere bağlı olarak konservatif veya girişimseldir. VVF'nin cerrahi onarımında başarılı bir sonuç elde etmek için çoğunlukla mesane ile vajina arasına iyi damarlanmış bir doku interpozisyon flebi yerleştirilmektedir. Doku interpozisyon flepleri, mesane ile vajina arasında bir bariyer görevi görerek ve doku oluşumunu ve damarlanmayı artırarak tedavinin başarı şansını yükseltmektedir. VVF'nin cerrahi tedavisinde otolog doku interpozisyon flepleri yaygın olarak tercih edilmektedir. Ancak otolog fleplerin kullanımı hastanın genel sağlık durumu, fistülün özellikleri ve cerrahi teknik ile ilgili nedenlerle her zaman mümkün olmamaktadır. Otolog dokuların kullanımının mümkün olmadığı durumlarda, sentetik interpozisyon fleplerinin kullanılması önerilmiş ve bazı çalışmalarda denenmiştir. Bu fleplerin hiçbiri VVF tedavisi için özel olarak tasarlanmamış olup yaygın klinik kullanıma girememiştir. Bu tez çalışmasının birinci aşamasında VVF onarımında kullanılan doku interpozisyon fleplerinin klinikte başarı oranları değerlendirilmiş ve klinik ihtiyaçlar göz önüne alınarak tedaviye özel, pro-anjiyojenik ve antibakteriyel fiber yapıda bir doku interpozisyon flepi tasarlanmıştır. Tez çalışmasının ikinci bölümünde ise tasarlanan flepler elektro-eğirme yöntemi ile üretilerek in vitro ve in vivo olarak incelenmiştir. Bu amaçla ipek fibroin (Fib) ve polikaprolakton (PCL) polimerleri kullanılarak elektro-eğirme yöntemi ile 2 katmanlı fiberler (Fib/PCL) üretilmiştir. Fib/PCL fiberlerin birinci katmanına pro-anjiogenik özellik gösteren 17-β-estradiol (E2) ve ikinci katmanına ise antibakteriyel etki gösteren AgNO3 eklenerek gümüş nanopartiküllere indirgenmesi sağlanmıştır. E2 ve AgNP içeren fiberlerin (E2Fib/PCL-Ag) anjiyogenik ve antibakteriyel etkileri incelenmiştir. Çapları 0,28-0,55 µm arasında değişen düzgün ve homojen morfolojideki fiberler, L929 hücre hattında toksik etki göstermemiştir. E2'nin fiberlerden salım profilleri incelendiğinde; ilk 7 günde ani bir salım gözlenmiş olup 14. günden sonra ise sürekli bir salım profili izlenmiştir. AgNP ise benzer bir salım profili göstermiştir. E2 içeren fiberlerin anjiyogenik etkisi koryoallantoik membran (CAM) deneyi ile incelenmiştir. Bu fiberlerin normalize damar yoğunluklarını kontrol grubuna göre %10 ile 36 arasında artırdığı tespit edilmiştir. Bu sonuçlar fiber yapısından salınan E2'nin anjiyojenik etki gösterdiğini ispatlamıştır. Aynı zamanda AgNP içeren fiberler mesane ve vajina florasında yaygın olarak bulunan Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 ve Candida albicans ATCC 90028 suşlarına karşı antibakteriyel etki gösterdiği tespit edilmiştir. E2 ve AgNP içeren fiberler sıçanların abdomen ve mesane–vajina bölgesine ayrı ayrı implante edilerek erken dönem doku yanıtı karşılaştırmalı olarak incelenmiştir. Bu amaçla, bu bölgelerden alınan doku kesitleri, polimorfonükleer lökositler (PMN), mononükleer hücreler (MN), bağ dokusu organizasyonu ve damarlanma açısından değerlendirilerek skorlanmıştır. E2 içeren iki katmanlı fiberlerin damarlanmayı ve bağ dokusu oluşumunu kontrole göre artırdığı gözlenmiştir. Diğer taraftan, fiberler enfeksiyon açısından değerlendirildiğinde, AgNP içeren fiberler diğer gruplara göre daha az yabancı cisim reaksiyon kaynaklı enfeksiyon göstermiştir. Mesane-vajina ve abdomen bölgelerinden alınan doku örnekleri PMN, MN, bağ dokusu organizasyonu ve dev hücre sayısı açısından incelendiğinde, bölgeler arasında anlamlı bir farkın olmadığı görülmüştür. Sonuç olarak doku interpozisyon flep eşleniği olarak geliştirilen iki katmanlı fiberlerin klinik kullanım potansiyeli olduğu ve ileriye dönük çalışmalar ile kliniğe translasyonunun mümkün olabileceği düşünülmektedir.
Sinir doku iskelesi olarak modifiye edilmiş PEDOT: PSS ve PEDOT: Heparin kaplanmış kanallar içeren PDMS temelli esnek ve iletken kompozit filmlerin geliştirilmesi
Bu yüksek lisans tezi kapsamında Poli (3,4-etilen dioksitiyofen):Poli(stiren sülfonat) (PEDOT:PSS) ve Poli (3,4-etilen dioksitiyofen):Heparin (PEHE) temelli iletken ve esnek filmler çalışılmıştır. PEDOT:PSS, literatürde en başarılı olan iletken polimerlerden biridir. PEDOT:Heparin de günümüzde gelecek vaat eden iletken polimerlerdendir. İkisi de görece kolay film oluşturma, iyi iletkenlik ve gerilebilirlik sunmaktadır. PEDOT:PSS ve PEDOT:Heparin sentezlenmiş, kimyasal katkı maddeleri olarak Gliserol ve Bis(triflorometan) sülfonimid lityum tuzu kullanılarak farklı oranlarda birleştirilmiştir. 3B yazıcı ile basılmış özel elektronik tasarıma sahip kalıba PDMS ve PLLA polimerleri dökülerek filmler oluşturulmuştur. Sonrasında film kanalları dip coating yöntemi ile iletken polimerler ile kaplanarak 0,4 mm genişliğinde, 62,8 mm uzunluğunda ve 0,1 mm derinliğinde kanallara sahip 1,1 mm kalınlığındaki kompozit filmler elde edilmiştir. Hazırlanan filmler fiziksel, kimyasal ve mekanik olarak karakterize edilmiş, L929 hücre hattı kullanılarak hücre kültür davranışları incelenmiştir.
Investigation of the effects of sensory salience on the refuge tracking performance of weakly electric fishes
Weakly electric fish species typically demonstrate hiding behaviors among plant roots and suspended objects in streams within their natural habitats. These fish employ the force generated by their anal ribbon-like fins to facilitate back-and-forth movements, thus modulating visual and electrosensory feedback. These movement abilities allow them to effectively maintain their position in a computer-controlled moving refuge. For our research, we conducted behavioral experiments involving wave-type gymnotiform species, namely, Apteronotus albifrons called black ghost knifefish and Eigenmannia virescens called glass knifefish, native to South America. We utilized an experimental setup consisting of a 3D-printed refuge, the motion of which was controlled using a linear actuator. The 3D refuges, made of PLA material, were prepared in three different lengths (7 cm, 14 cm, and 21 cm) and two surface feature variations (with and without windows). The refuge was moved by the sum of sinuses in the range of 0.10 Hz to 2.05 Hz with the help of a special code on the computer. The experimental conditions encompassed manipulations of four variables: 1) lighting levels (dark, dim, and light), 2) refuge structure (with or without windows), 3) refuge length (7 cm, 14 cm, 21 cm), and 4) conductivity levels (low, medium,and high). A total of 54 different sensory conditions were tested, (with N=5 individual fish) for each species. There was a statistically significant difference between species; with black ghost knifefish having lower RMSE values than glass knifefish species. The most important parameters for refuge tracking performance were illumination and length. Moreover, the conductivity had a significant impact on tracking performance. However, we determined that the window condition did not have the same effect on refuge tracking performance. Besides, we found statistically significant interactions between the 'Species and Length', 'Species and Window', 'Illumination and Length', 'Illumination and Window' conditions. The length of the refuge had a greater effect on the refuge tracking performance of the fish than whether the refuges are windowed or not. The presence of windows opened in refuges in well illuminated conditions had a minor effect on tracking performance, while the presence of windows in refuges in dark conditions had a positive effect on tracking performance, making a big difference in results. The results showed that refuge tracking behavior was much more successful at low conductivity. Fish weighted visual information when electrosensory salience was compromised at high conductivities.
Kontrollü florid salımı için moleküler baskılanmış süpermakrogözenekli kriyojellerin hazırlanması
Bu tez çalışması kapsamında florid baskılanmış kriyojel disklerden florid salınımı gerçekleştirilerek in vitro ortamda farklı parametreler incelenmiştir. Kriyojeller, monomerlerin/polimerlerin donma sıcaklığının altındaki bir çözücü içinde kriyojelasyonundan oluşan makro gözenekli polimerik yapılardır. Kriyojelasyon, biyomedikal amaçlar için polisakkarit malzemelerin üretimi için yeni geliştirilmiş yöntemlerden biridir. Doğal olarak birbirine bağlı makro gözeneklilik, hazırlama kolaylığı ve biyouyumlulukları nedeniyle, 3D biyobaskı, ilaç dağıtımı, yara iyileşmesi ve enjekte edilebilir terapötikler gibi biyomedikal uygulamalarda kullanım için giderek daha fazla araştırılmaktadır. Kriyojeller tipik olarak birbirine bağlı makro gözeneklere (veya süper makro gözeneklere) sahiptir, bu da hemen hemen her boyuttaki çözünen maddelerin engelsiz difüzyonunun yanı sıra nano ve hatta mikro partiküllerin kütle taşınmasına izin verir. Bütün hücrelerin ve farklı biyolojik makromoleküllerin saflaştırılması, ayrılması ve immobilizasyonu için destek matrisleri olarak birbirine bağlı süper makro gözenekli kriyojellerin uygulanması literatürde iyi rapor edilmiştir. Moleküler baskılanmış polimerlerin stereospesifik tanımaya sahip olmaları gibi üstün özellikleri, onların son zamanlarda ilaç salınımı gibi biyomedikal uygulamalarda da kullanılmalarını gündeme getirmiştir. Belli başlı problemler ilaç salınımı sistemlerinin pratik uygulanmalarını kısıtlamıştır. Örnek olarak, depo edildiği yerde ve hedef bölgede terapötik seviyeyi koruyabilmeleri gerekir. Bu durum ilaç salınım sistemlerinin, spesifik moleküllerin varlığı ya da denge derişimlerine ulaşıldığında salınımın gerçekleştirilmesini sağlayacak moleküler tanımlama özelliklerine sahip olmalarını gerekli kılar. Bu yüzden, moleküler baskılanmış polimerlerin moleküler tanımlama özellikleri, onlara ilaç salınımı sistemlerinde önemli avantajlar kazandırmıştır. Geçmişten bugüne bütün dünyada diş çürük prevalansı yüksek oranlarda etkileyen bir sorun olmaya devam etmektedir. Çürük oluşmasında beslenme ve oral hijyen alışkanlıklarının yanı sıra; tükürük akış hızı, dişlerin anatomisi, kalıtım, ağız florası ve floridin alımı gibi çeşitli etkenler rol alır. Florürün, çürüğün başlamasını önlemek ve yeni başlamış opak mine lezyonlarının remineralizasyonunu sağlamak amacıyla uygulanan koruyucu tedavilerde, en yaygın kullanılan ve özellikleri iyi bilinen bir eser elementtir. Florür, diş çürüğü insidansını azaltabilen etkili bir antikaryojenik ajandır. Florür remineralizasyonu arttırırken pelikül oluşumunu, mikrobiyal büyümeyi ve metabolizmayı azaltarak antikaryojenik bir etki gösterir.
Nano/mikro yapılı çok bileşenli ve sıralı ilaç salım sıstemlerının diyabetık yaralardakı etkisinin incelenmesi
Sağlık alanında birçok araştırmacı tarafından sorgulanan, henüz tam tedavisi yapılamayan, özellikle metabolik sorun/diyabetli hastaların kronik yaraları zorlu klinik sorunlardandır. Diyabetik hastalarda gelişen damar sorunları iskeminin temel nedenidir. Öte yandan diyabetik hastalarda hücresel ve hümoral yanıtta yetersizlikler ve bozuluklar gelişmektedir. Bu nedenlerden dolayı yara iyileşmesini sağlayan büyüme faktörlerinin seviyeleri azalmakta veya etkin aktivitelerini kaybetmektedirler. Azalan hücresel ve humoral seviye ve de bunlara eklenen vaskulopatiye bağlı kanlanma sorunları nedeniyle diyabetik hastalarda kronik yara iyileşme sorunları gelişmektedir. Vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) (MA 45 kDa), yara iyileşmesi sırasında damarlanmayı uyaran ve böylece iyileşmeyi hızlandıran en güçlü anjiyojenik büyüme faktörüdür. Granülosit makrofaj stimüle edici faktör (GM-CSF) (MA 14 kDa)'nun hücre proliferasyonunu uyardığı ve yara iyileşmesini hızlandırdığı bilinmektedir. VEGF ve GM-CSF düzeylerinin yara bölgesinde kontrollü bir şekilde varlığının sağlanması ya da dolaylı olarak verilmesi yara iyileşmesinde olumlu biyolojik etki sağlayacaktır.Bu çalışmanın amacı diyabetik yaralarda biyolojik pansuman malzemesi olarak VEGF ve GM-CSF ile yüklü PCL tabanlı polimerik partiküllerden veya polimer lipit hibrit partiküllerden oluşan malzeme geliştirmektir. İlk aşamada anjiyojenik ve hücresel yanıtı uyaran faktörleri içeren sıcaklığa duyarlı, enjekte edilebilir, pluronik F127 bazlı bir hidrojel geliştirilmiştir. Bu hidrojel, streptezotosin ile diyabetik hale getiştirilmiş Spraque Dawley sıçanların sırtında oluşturulan yaraları iyileştirme yeteneklerini değerlendirilmiştir. Tez çalışma kapsamında çift emülsiyon çözücü buharlaştırma yöntemi kullanılarak PCL tabanlı polimerik partiküller ve polimer-lipit hibrit partiküller (200-1000 nm) hazırlandı. Partiküller, LS, AFM ve SEM ile karakterize edilerek boyutu ve boyut dağılımı, morfolojileri değerlendirildi. Polimerik ve hibrit partiküllerin in vitro alım/salım yeteneklerinin değerlendirilmesi amacıyla model protein olarak sığır serum albümin (BSA, MA 60 kDa) ve Lizozim ( MA 14 kDa) kullanıldı. Çalışmalar sonuncunda polimer-lipit hibrit partiküllerin proteinleri tekli ve/veya ikili olarak yüksek oranda kapsüllenebildikleri ve proteinleri molekül ağırlıklarına göre 21 gün boyunca kontrollü salımlarını gerçekleştirebildikleri görüldü. Daha sonra hibrit partiküller yara bölgesine topikal olarak uygulanabilmesi amacıyla sıcaklığa duyarlı enjekte edilebilir pluronik F127 hidrojele dahil edildi. Sıcaklıya duyarlı hidrojelinin jelleşme sıcaklığı ve reolojik özellikleri değerlendirildi. Sonuçlar pluronik F127 jelinin ortam sıcaklığının +4 °C 'de akışkan bir halde iken 37°C'ye (vücut sıcaklığı) çıktığında viskozitenin artmasıyla jel haline geldiği gözlendi. Hidrojelin in vitro salım çalışmaları ile de model protein yüklü hibrit partiküllerin istenmeyen patlama salımlarını en aza indirdiği ve kontrollü salımlarını gerçekleştirdiği elde edilen sonuçlar ile gözlendi Çalışma kapsamında yara bölgesine özgü olarak tasarlanan VEGF/GM-CSF yüklü polimer-lipit hibrit partikülleri içeren hidrojelinin diyabetik sıçanların sırtında oluşturulan 2 cm çaplı yaraların iyileşmesindeki etkisi ön çalışma olarak 10 gün boyunca izlenmiş ve süre bitiminde yaralar histomorfik olarak incelenmiştir. Bu tez çalışmasında literatürde ilk defa yer alacak VEGF ve GM-CSF 'kombinasyonu ile birlikte çok bileşenli sıralı salım gerçekleştirebilen ve yara iyileşmesinin farklı fazlarında etkin rol oynayan bir taşıyıcı sistem tasarlanmış ve kullanılmıştır. Bu sistem iki etken maddeyi kapsülleyerek ve jel sayesinde topikal olarak uygulanabilecek özellik kazandırılmış ve kontrollü salımlarıyla diyabetik sıçanlarda inflamasyonunu artırarak peşinden anjiyogenezi teşvik ederek iyileşmesi zor olan yaraların daha hızlı bir şekilde iyileşip/iyileşmediği sorgulanmıştır.
Sinir kondüiti olarak metakrilatlanmış jelatin modifiye hücresizleştirilmiş koyun ince bağırsak submukozasının geliştirilmesi
Periferal sinir hasarı travmatik yaralanmalar sonucu yaygın olarak görülmektedir. Periferik sinir sisteminin karmaşık yapısının rejenerasyonunun yavaş olması hasar sonrası fonksiyon geri kazanımını yüksek oranda etkilemektedir. Bu kapsamda sinir doku mühendisliği çalışmaları önem arz etmektedir. Tez kapsamında periferik sinir hasarı rejenerasyonuna yönelik koyun ince bağırsak submukozasının (SIS) metakrilatlanmış jelatin (GelMA) ile hibrit doku iskeleleri tasarlanmıştır. Öncelikli olarak çalışma kapsamında SIS deselülerizasyonu iki farklı metotla gerçekleştirilmiştir. Birincil metot olarak fiziksel, kimyasal ve enzimatik uygulamaların kombinasyonu olan konvansiyonel bir metot kullanılmış olup süperkritik karbon dioksit (scCO2) teknolojisinin SIS deselülerizasyonuna yönelik özgün protokolünün geliştirilmesinde kontrol grubu olarak kullanılmıştır. Konvansiyonel yöntem ile deselülerizasyon sonrası %91,13 genomik DNA azalması gerçekleştirilmiştir. ScCO2 deselülerizasyonunda ise %92,77 genomik DNA azalması gerçekleştirilerek optimum metot belirlenmiştir. Uygulanan metotlar H&E ve DAPI histolojik boyamaları kullanılarak karşılaştırılmış olup hem hücresizleştirmenin gerçekleştiği hem de hücresizleştirme yöntemlerinin ECM üzerindeki etkileri kalitatif olarak incelenmiştir. GAG miktar tayini çalışmalarında konvansiyonel metot uygulanan grupta %75,47 azalma gerçekleşmiş olup scCO2 grubunda GAG miktarında azalma gözlemlenmemiştir. Bu bağlamda scCO2 teknolojisinin SIS hücresizleştirme uygulamalarında etkili ve veriminin yüksek bir metot olduğu ortaya konmuştur. Bu çalışmalar sonrası deselülerizasyon tekniklerinin morfolojik ve mekanik özelliklere etkisi taramalı elektron mikroskopisi (SEM) ve çekme testi ile karakterize edilmiştir. Tez çalışmasının ikinci kısmında hibrit membran eldesine yönelik GelMA pre-polimeri sentezlenmiş, hidrojel parametreleri optimize edilmiştir. Jelatin farklı oranlarda metakrilik anhidrit (MA) ile fonksiyonelleştirilerek ideal modifikasyon derecesi (MD) 1H-NMR ile belirlenmiştir. Bu kapsamda %75,76 MD gerçekleşmiş olan grup hidrojel sentezi için seçilmiştir. Devamında I2959 foto-başlatıcı kullanılarak farklı konsantrasyonlarda GelMA içeren pre-jel solüsyonlarının in situ çapraz bağlanması gerçekleştirilmiştir. Elde edilen hidrojeller FT-IR, şişme ve mekanik analizler ile karakterize edilmiştir. Hidrojellerde gelMA konsantrasyonunun arttırılmasının mekanik dayanımı arttırdığı gösterilmiştir. Çalışmanın üçüncü bölümünde GelMA çözeltileri SIS ile inkübe edilip I2959 foto-başlatıcı kullanılarak UV ışık altında çapraz bağlanmıştır. FT-IR ve SEM analizleri ile hibrit doku iskelesi eldesi kanıtlanmış olup yapısal değişiklikler incelenmiştir. Su tutma kapasiteleri, degradasyon özellikleri, mekanik dayanımları ve yüzey ıslatılabilirlikleri incelenerek aselüler SIS ve GelMA hidrojelleri ile karşılaştırılmıştır. Son olarak elde edilen hibrit membranların nöral hücreler ile etkileşimleri hücre canlılığı, proliferasyonu ve morfolojik değişimleri açısından in vitro kültür çalışması ile karakterize edilerek SIS/GelMA hibrit membranlarının nöral hücre proliferasyonunu indüklediği tespit edilmiştir.
Kaplanmış gözenekli Tİ6A14V implantların lazer metal toz ergitme (LAM) teknolojisi ile üretimi ve karakterizasyonu
Metal ortopedik implantlar, fonksiyonel olarak kemik hasarlarında iç onarımı sağlamak için oldukça umut verici tıbbi cihazlardır. İmplantın uygulanan bölgeye uygun elastik modülüs ve vücutta oluşacak olumsuz etkileri önleyici biyouyumluluk özelliklerinin olması minimum gereksinimlerdir. İdeal implant malzemesi üzerine yaygınlaşmış çalışmalar, yüksek mekanik mukavemet ve osteointegrasyon özellikleri nedeniyle titanyum elementler ve alaşımlar üzerinde yapılmaktadır. Bununla birlikte, piyasada geleneksel yöntemlerle yapılan Ti6Al4V alaşımlı implantlar, yüksek mekanik mukavemeti, stres koruma etkisi ve düşük süneklik gibi dezavantajlardan dolayı ideal implant özelliklerinden uzaktır. Bu problemi çözmek için tezde, dokuları implanta daha iyi entegre etmek ve kemiğin mekanik özelliklerine yaklaşmak amacıyla üçlü periyodik minimal yüzey (ÜPMY) kafes yapısına sahip gözenekli implantlar kullanılmıştır. Tezin başlangıç noktası, istenen mekanik özellikleri ve gözeneklilik oranı ile hücre hareketini sağlamak için kontrollü ÜPMY gözenek yapısının tasarımı ve bu yapıya sahip Ti6Al4V implantların, lazerle metal toz ergitme (LAM) teknolojisi kullanılarak üretimini sağlamaktır. Tezin genel amacı, ortopedik cerrahide kullanılabilen, piyasadaki konvansiyonel gözeneksiz titanyum implantlara kıyasla, mekanik özellikleri kemiğe daha yakın ve biyouyumluluk açısından daha yüksek aktivasyon gösterebilecek Ti6Al4V ÜPMY implantlar tasarlamak ve üretmektir. Ek olarak, gözenekli implantları kalsiyum fosfat ve polimer kompozitle kaplayarak osteointegrasyonun arttırılması amaçlanmaktadır. Amaca göre, tezin ilk bölümü Ti6Al4V ÜPMY yapılar için tasarım ve üretim süreci olmuştur. Bu bölüm ayrıca implant gereksinimlerini sağlamak için önce ÜPMY tasarım parametreleri, daha sonra LAM işlem parametreleri ve son adım temizleme işlemi parametreleri optimizasyonu ile prototip geliştirme olan yinelemeli süreci içermektedir. İkinci bölüm olan kaplamada, yüzey işlevselleştirme, CaP / Polimer kompozit sentezi, daldırma kaplama parametre optimizasyonu ve daldırma kaplama işlemi ile devam edilmiş, son olarak kompozit ve titanyum yüzey arasındaki kaplama kalitesini ve mekanik özelliklerinin belirlenmesi için kaplama gerilme testleri yapılmıştır. Üçüncü bölümde, Ti6Al4V gözenekli implantların biyouyumluluk özelliklerinin elde edilmesi için sitotoksisite testi uygulanarak karakterizasyon işlemi gerçekleştirilmiştir.
Pankreas kanseri kombine fototermal/kemo terapisinde altınnanopartiküllerle dekore edilmiş sıcaklığa duyarlı lipozomların kullanım potansiyelinin incelenmesi
Pankreas kanseri, beş yıllık sağkalım oranı %4-8 ve ölüm oranı %98 olan oldukça ölümcül bir hastalıktır. Bu hastalığın görülme sıklığı ve ölüm oranları artmaktadır ve 2030 yılına kadar kansere bağlı ölümlerin ikinci önde gelen nedeni olacağı tahmin edilmektedir. Pankreas kanserinin belirtileri genellikle hastalığın ileri aşamalarında ortaya çıkar ve bu da tedaviyi zorlaştırır. Cerrahi rezeksiyon mevcut tek tedavi seçeneğidir, ancak hastaların yalnızca küçük bir yüzdesinde mümkündür. Rezeksiyon yapılsa bile hastalığın nüks etme oranı yüksektir. Rezeksiyon yapılamayan hastalarda kemoterapi kullanılır, ancak tümörlerde düşük ve heterojen ilaç birikimi, tümörü çevreleyen fibrotik stroma tarafından direnç gelişimi ve toksisite gibi çeşitli faktörler nedeniyle etkinliği sınırlıdır. Nanotaşıyıcı sistemler, kemoterapinin sınırlamalarının üstesinden gelmenin bir yolu olarak önerilmiştir. Özellikle lipozomların immünojenik ve toksik olmadığı bulunmuştur, bu da onları terapötik ajanların kapsüllenmesi için popüler bir seçim haline getirmiştir. Sıcaklığa duyarlı lipozomlar da ilaç salım etkinliğini indüklemek ve kanser hücrelerini yok etmek için foto-emici ve yakın kızılötesi NIR ışınlamasını kullanan yeni bir kanser terapisidir. Altın nanopartiküller, iyi foto emici özellikleri nedeniyle fototermal tedavide giderek daha fazla kullanılmaktadır. Bu çalışma, fototermal terapi varlığında altın nanopartiküllerle süslenmiş bir lipozomal ilaç dağıtım sisteminin hipertermi ve ilaç salım özelliklerini araştırmayı amaçlamaktadır. Amaç, pankreas kanseri için sinerjik bir terapi ajanı olarak kullanılabilecek bir sistem geliştirmektir. Çalışma, hipertermi ve ilaç salınım özelliklerini kontrol etmek ve incelemek için ön araştırmaları içerecektir. Başarılı bir şekilde tamamlanmasının ardından, formülasyon geliştirme ve in-vivo/in-vitro çalışmaları da içeren kapsamlı bir proje hazırlanacaktır. Bu çalışmanın bulguları potansiyel olarak pankreas kanseri için etkili bir tedavinin geliştirilmesine yol açarak hastaların hayatta kalma oranını ve yaşam kalitesini artırabilir.
Yara iyileşmesine yönelik ekzozom entegre biyoaktif jelatin süngerlerin geliştirilmesi
Hücrelerarası sinyal iletim aracı olan ekzozomlar, kargolarında taşıdıkları çeşitli biyomoleküller aracılığı ile anjiyogenez, antijen taşıma, apoptoz, pıhtılaşma, hücresel hemostaz, inflamasyon ve hücrelerarası sinyal iletim gibi birçok biyolojik süreçte rol oynamaktadır. Bu etkilerinden dolayı ekzozomlar; nörodejeneratif, kanser ve kardiyovasküler hastalıkların teşhis ve tedavisinde, kemik rejenerasyonunda, ilaç ve aşı araştırmalarında yoğun ilgi görmektedir. Yara iyileşmesinde ise hemostaz, inflamasyon, anjiyogenez, kollajen birikimi, granül doku oluşumu ve epitelizasyon fazlarında etkili olduğu bilinmektedir. Ancak ekzozomların terapötik etki gösterebilmesi için stabilitelerinin ve biyolojik fonksiyonlarının korunması kritik öneme sahiptir. Bu amaçla ekzozomların taşıyıcı sistemlere yüklenerek uygulanması rejeneratif tıp alanında büyük ilgi görmektedir. Bu tezin amacı yara iyileşmesine yönelik olarak sıçan kemik iliği kök hücre (rt-MKH) kaynaklı ekzozomların jelatin süngerlere yüklenerek biyolojik fonksiyonlarının korunması ve yara bölgesinde uygulama kolaylığı sağlamasıdır. Bu amaçla rt-MKH kaynaklı ekzozomlar ultrasantrifüj yöntemi ile izole edilerek partikül boyutları 160-180 nm aralığında bulunmuştur. Ekzozomların CD81 ve CD63 proteinlerini ifade ettiği akış sitometrisi ile tespit edilmiştir. Hücre kaynağı ve kültür koşullarının ekzozom verimine etkisi incelenmiştir. Sıçan yaşının ekzozom veriminde etkili olduğu ve 8 haftalık sıçanlardan elde edilen rt-MKH kaynaklı ekzozom veriminin 5 ve 3 haftalık sıçanlara göre 2 kat fazla olduğu gösterilmiştir. Ayrıca ekzozom içermeyen fetal sığır serumu (Exodep FBS) kullanımı ise FBS'siz ortama göre verimi 2 kat artmıştır (p<0,05). Ekzozomlar, farklı konsantrasyonlarda (0-10 µg/mL) keratinosit hücrelerine (HaCaT) uygulandığında, 0.25 µg/mL konsantrasyonunda hücre proliferasyonunu % 10 artırdığı ve ancak yüksek konsantrasyonlarda (>1 µg/mL) ise anlamlı olarak düşürdüğü gözlenmiştir. rt-MKH kaynaklı ekzozomların hücre migrasyonuna olan etkisi faklı konsantrasyonlarda (0,25, 1 ve 10 µg/mL) incelenmiş ve 24 saat sonunda insan fibroblast hücrelerine (hFB) 10 µg/mL ekzozom uygulandığında yara alanı %51 oranında azalırken kontrol grubunda ise % 36 oranında azaldığı tespit edilmiştir. HaCaT hücrelerinde ise ekzozomların migrasyona etkisi görülmemiştir. Ekzozomların pro-anjiyojenik etkileri aortik halka ve koryoallantoik membran (CAM) analizleri ile test edilmiş ve ekzozomların endotel filizlenmesini ve yeni damar oluşumunu konsantrasyona bağlı olarak artırdığı izlenmiştir. Ortalama 200–250 µm gözenek çapına ve yüksek su tutma kapasitesine sahip jelatin süngerler dondurarak-kurutma yöntemi ile hazırlanmış ve ekzozomlar jelatin süngerlere yüklenerek biyolojik etkileri araştırılmıştır. CAM analizleri, 5 µg/mL ekzozom entegre edilen jelatin süngerlerin damar yoğunluğunu yaklaşık olarak kontrole göre %50 (p<0,05) oranında artırdığını göstermiştir. Aortik halka deneyinde ise ekzozom entegre jelatin süngerler serbest ekzozomlara göre daha yüksek anjiyojenik yanıt göstermiştir. Sonuç olarak jelatin süngerlerin ekzozom stabilitesini ve biyolojik özelliklerini koruyarak uygulama kolaylığı ile birlikte kronik/kompleks yara tedavisinde etkili bir strateji olacağı sonucuna varılmıştır.
Hasarlı omurilik onarımı için hücre destekli enjekte edilebilir ipek fibroin mikrotaşıyıcıların geliştirilmesi
Dünya Sağlık Örgütü (DSÖ)'nün verilerine göre omurilik yaralanmaları her yıl 250.000 ile 500.000 insanı etkilemektedir. Mevcut klinik uygulamalarda omurilik hasarlarını tamamen onarabilen bir tedavi yöntemi bulunmamaktadır. Hücre temelli rejenerasyon yaklaşımlarının önünde, hücrelerin hasarlı omuriliğe transplantasyonundan sonra düşük canlılık oranları ile karşılaşılması gibi engeller bulunmaktadır. Tez kapsamında, omurilik hasarlarının tedavisine yönelik enjekte edilebilir mikrotaşıyıcı-destekli hücre dağıtım sisteminin geliştirilmesi amaçlanmıştır. Doğal bir protein olan ipek fibroin (SF) temelli biyobozunur yapıdaki mikrotaşıyıcılar, emülsiyon haline getirilmiş faz ayrımı yöntemi kullanılarak hazırlanmıştır. Yüzde %1,5-6,5 ağırlık/hacim oranlarındaki 7 farklı ipek fibroin konsantrasyonuna sahip mikrotaşıyıcılar üretilmiştir. SF konsantrasyonu artıkça mikrotaşıyıcıların çapı 160,8±34,9 μm'den 385,5±112,9 μm'ye artmıştır. Mikrotaşıyıcıların topografik özelliklerinin ipek konsantrasyonu, donma sıcaklığı ve karıştırma hızı ile değiştirilebildiği gösterilmiştir. Mikrotaşıyıcı sistemlerinde partikül çapı enjekte edilebilirlik ile doğrudan ilişkilidir. Hücrelerin çoğalabileceği uygun yüzey topografisi de göz önünde bulundurulduğunda 7 grup arasından %2,5 SF konsantrasyonuna sahip mikrotaşıyıcı grubu (2,5 SF) ön plana çıkmıştır. Üretilen mikrotaşıyıcıların stabilizasyonu metanol ve etanol olmak üzere iki farklı alkol çözeltisinde test edilmiştir. Geliştirilen mikrotaşıyıcılar fiziksel ve kimyasal özellikleri temelinde ayrıntılı bir şekilde karakterize edilmiştir. Yedi günlük in-vitro statik ve dinamik hücre kültürü çalışmaları kapsamında; L929 fibroblastları, MC3T3-E1 pre-osteoblastları ve S42-Schwann hücrelerinin SF mikrotaşıyıcıların pürüzlü yüzeylerinde iyi bir şekilde çoğaldığı gösterilmiştir. Mikrotaşıyıcılar, Schwann hücrelerine mekanik destek sağlayarak hücrelerin enjekte edildikten sonra da canlılıklarının artarak devam etmesini sağlamıştır. Bu araştırma, üç boyutlu SF mikrotaşıyıcı yüzeylerinde çoğalan Schwann hücrelerinin çoğalmasını inceleyen ilk çalışmadır. Hücre yüklü enjekte edilebilir ve biyobozunur yapıdaki küresel SF mikrotaşıyıcılar ile invaziv olmayan bir tedavi seçeneği sunmak, çalışmadaki fikrin özgünlüğünü desteklemektedir.
Akne tedavisi için ilaç yüklü mikroiğneli yamaların geliştirilmesi
Akne vulgaris, cildin pilosebase birimlerinin iltihaplanması, propionibacterium acnes bakterisi kolonizasyonu, sebase (yağ) bezlerin aktivitesi, genetik faktörler, yaşam şekli ve hormonlar gibi birçok faktör nedeniyle özellikle ergenlik çağında yaşanan yaygın ve kronik bir hastalıktır. Akne tedavisinde oral veya topikal olarak antibiyotik ve retinoid türevi ilaçların birlikte kullanımı en etkili seçenektir. Günümüzde bu ilaçların tablet, krem, jel gibi klasik tedavi formları mevcuttur. Son yıllarda penetrasyon arttırıcı özellikleri nedeniyle mikroiğneli (MN) yamalar, çeşitli terapötiklerin transdermal iletimi için ideal platformlar olarak düşünülmektedir. Bu tez kapsamında akne tedavisinde kullanılan tetrasiklin (TCH) ve bir retinoid tüürevi olan retinoik asit (RA) hidrojel yapıya yüklenerek mikroiğneli yamaların tasarımı ve üretilmesi hedeflenmiştir. Bu amaçla jelatin (Jel) ve poli(vinil alkol) (PVA) bazlı Jel/PVA mikroiğneler mikrokalıplama yöntemi ile üretilmiştir. Mikroiğnelere tetrasiklin ve retinoik asit farklı 2 dozda yüklenerek mikroiğneler karakterize edilmiş ve etkinlikleri değerlendirilmiştir. Üretilen mikroiğnelerin morfolojileri ışık ve taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile incelenmiştir. Mikroskobik görüntülerde yaklaşık 650 µm iğne yüksekliğine sahip kare tabanlı piramidal mikroiğnelerin oldukça düzgün yapılar oluşturduğu ve etken maddelerin iğnelere başarılı bir şekilde yüklendiği tespit edilmiştir. Mikroiğnelerin termal özellikleri Diferansiyel Taramalı Kalorimetri (DSC) ve Termogravimetrik Analiz (TGA) ile incelenmiş ve bütün örneklerde ısıl bozunmanın yaklaşık olarak 325 °C'de başladığı ve 300-450 °C arasında %76-82 civarında kütle kayıplarının olduğu izlenmiştir. Etken maddelerin Jel/PVA'ya eklenmesinin ısıl bozunmaya önemli bir etkisinin olmadığı gözlenmiştir. Mikroiğnelerin DSC termogramları benzer özellik göstermiş olup 37.5 °C'de PVA'ya ait, 49.22 °C'de ise jelatine ait 2 farklı camsı geçiş sıcaklığı (Tg) tespit edilmiştir. Ayrıca 110 ve 195.36 °C'de sırasıyla jelatinin ve PVA'nın erime sıcaklıkları izlenmiştir. Üretilen mikroiğne yamalar L929 hücre hattına karşı toksik bir etki göstermemiştir. Mikroiğnelerin penetrasyon testi Parafilm M® katmanları ile gerçekleştirilmiştir. 650 µm iğne yüksekliğine sahip iğnelerin yaklaşık 5. ve 6. Parafilm M® katmanına kadar ulaştığı tespit edilmiştir. Bu sonuçlar değerlendirildiğinde mikroiğnelerin cildin dermis kısmına ulaşacağı sonucuna varılmıştır. Hazırlanan mikroiğne yamalarının antibakteriyal aktiviteleri Staphylococcus aureus ATCC 29213 suşuna karşı incelenmiş ve antibakteriyal özellikte olduğu değerlendirilmiştir. Sonuç olarak; tetrasiklin ve retinoik asit yüklü hidrojel yapılı mikroiğne yamalarının kombine ilaç yaklaşımı ile penetrasyonu artırarak akne vulgarisin topikal tedavisinde kullanım potansiyeline sahip olduğu düşünülmektedir.
Kan pıhtılaşma faktörlerinden faktör VIII'in anjiyogeneze pozitif etkisinin koriyoallantoyik membran modelinde gösterilmesi
Doku mühendisliği günümüzde pek çok disiplinle beraber sağlık alanında sıklıkla kullanılan bir yaklaşım haline gelmiştir. Bu alanlardan biri olan damar doku mühendisliğinde damar endoteline etki eden maddeler de inceleme konusu olabilmektedir. Bu maddelerden biri olarak düşünülen Faktör VIII (FVIII), koagülasyonda intrinsik yolağın önemli bir parçası olan ve eksikliğinde X'e bağlı resesif aktarılan hemofili A hastalığına yol açan bir pıhtılaşma proteinidir. Literatürde FVIII'in ekstra koagülatif doğasına odaklanan çalışmalar mevcuttur. Sunulan bu tez çalışmasında FVIII'in olası pro-anjiyogenik rolü anjiyogenez çalışmalarında kullanımı uygun olan koriyoallantoyik membran (CAM) modelinde incelenmiştir. Ayrıca sodyum aljinat/jelatin hidrojel yardımıyla FVIII'in yavaş salımının etkisi de değerlendirilmiştir. Bunun için dört deney grubu belirlenmiş olup, uygulamalardan 72 saat sonra fotoğraflar çekilip damarlanmadaki morfolojik değişimler Image J programıyla değerlendirilmiştir.
Geliştirilen üç boyutlu böbrek proksimal tübül modelinde nefrotoksisite değerlendirmesi
Akut böbrek hasarı her yıl dünyada 2 milyon insanın ölümüne neden olan yüksek morbidite ve mortaliteye sahip önemli bir sağlık sorunudur. Akut böbrek hasarının önemli nedenlerinden birisi de ilaçlara bağlı nefrotoksisitedir. Organ transplantasyonu sonrası tedavide bağışıklık baskılayıcı olarak kullanılan takrolimusun nefrotoksik etkisi klinik kullanımını kısıtlamaktadır. Primer olarak proksimal tübül (PT) epitelini hedefleyen nefrotoksisitenin modellenmesinde iki boyutlu (2B) in vitro modeller mikroçevre, polarite, hücre-hücre etkileşimleri ve tübüler akışı sağlayamamakta bu nedenle üç boyutlu (3B) ex vivo modellere ihtiyaç duyulmaktadır. Bu tez çalışmasında takrolimusun insan proksimal tübül epitel hücreleri (PTEH) üzerindeki gerçek zamanlı antiproliferatif dozunun belirlenip, ilacın etkilerinin ex vivo koşullarda biyomühendislik yaklaşımlarıyla geliştirilen 3B-PT modeli üzerinde yapısal ve fonksiyonel olarak değerlendirilebileceği varsayılmıştır. Takrolimusun antiproliferatif etki dozunun (ED50) belirlenmesi için insan PTEH'e (HK-2) 1x10-1, 1, 1x101, 1x102, 1x103, µg/ml konsantrasyonlarda takrolimus uygulanıp gerçek zamanlı impedans temelli proliferasyon analizi ile değerlendirilmiştir. Üç boyutlu PT modelinin oluşturulması için 3B baskı teknikleri ile bir platform üretilmiş, perfüze edilebilen bir kanal oluşturulmuş ve kanal içine HK-2 hücrelerinin ekimi yapılmıştır. Ayrıca ticari mikroakışkan kültür platformunda 3B-PT modeli oluşturulmuş, HK-2 hücrelerinin ekimi yapıldıktan sonra aralıklı salınım cihazı ile perfüzyon sağlanmıştır. Mikroakışkan kültür platformunda oluşturulan 3B-PT modelinde kontrol ve takrolimus verilen deney gruplarında ZO-1 ve asetillenmiş α tübülin immün işaretlemesi, hücre canlılığı, albümin geri alım işlevi ve bariyer bütünlüğü karşılaştırmalı olarak değerlendirilmiştir. Gerçek zamanlı proliferasyon analizinin sonucunda takrolimusun HK-2 hücrelerindeki ED50'si 48. saatte 44.69 µg/ml olarak bulunmuştur. Üç boyutlu baskı ile üretilen platformda kanal tasarlanmış, oluşturulmuş ve perfüzyon sağlanmıştır ancak HK-2 hücreleri kanal içinde tutunma eğilimi göstermemiştir. Mikroakışkan kültür platformunda ise perfüzyonun sağlandığı 3B-PT modeli başarıyla oluşturulmuştur. Takrolimus statik koşullarda ve 3B-PT modelinde hücre canlılığını anlamlı olarak azaltmıştır. Mikroakışkan kültür platformunda oluşturulan 3B-PT modelinde takrolimusun kontrol grubuna göre ZO-1 ve asetillenmiş α tübülin immün işaretlemesini azaltarak 3B-PT yapısını bozduğu gösterilmiştir. Mikroakışkan kültür platformunda oluşturulan 3B-PT modelinde kontrol grubu ile karşılaştırıldığında takrolimusun albümin geri alım işlevini bozduğu gösterilmektedir. Takrolimus kontrol grubuna göre PT epitelinin bariyer bütünlüğünü bozarak 155 kDa dekstran molekülüne karşı geçirgenliği 2.3 kat ve 20 kDa dekstran molekülüne karşı geçirgenliği 1.4 kat artırmıştır. Sonuç olarak takrolimusun HK-2 hücrelerindeki gerçek zamanlı ED50'si hesaplanmış, mikroakışkan platformunda 3B-PT modeli oluşturulmuş ve takrolimusun 3B-PT üzerindeki etkisi ex vivo koşullarda yapısal ve fonksiyonel olarak değerlendirilmiştir.
Kurkumin yüklü üç boyutlu poli(ε-kaprolakton)/kitosan nanofibröz yara örtü malzemelerinin geliştirilmesi
Bu çalışma "Kurkumin İçeren Makrogözenekli ve Antibakteriyel Üç Boyutlu Nanofibröz Yara Örtü Malzemelerinin Geliştirilmesi" başlıklı Kariyer Başlangıç Projesi (FKB-2022-19592) kapsamında Hacettepe Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinasyon Birimi tarafından desteklenmiştir. Sunulan tez çalışmasında istenilen şekil ve boyutlarda kurkumin yüklü ve makrogözenekli üç boyutlu (3B) yara örtü malzemelerinin geliştirilmesi amaçlanmıştır. Çalışma kapsamında ilk olarak geleneksel elektroeğirme yöntemi ile poli(ε-kaprolakton)/kitosan (PCL/Kit) ve kütlece %5 ve %10 kurkumin içeren PCL-Kit (sırasıyla PCL-Kit-Kur5 ve PCL-Kit-Kur10) nanofibröz matrisler üretilmiştir. Daha sonra bu matrisler, homojenizatör aracılığıyla süspanse hale getirilmiş ve kalıplara dökülerek dondurulduktan sonra liyofilize edilerek istenen boyutta ve geometride 3B nanofibröz yara örtü malzemeleri başarıyla üretilmiştir. Tez çalışması kapsamında 3B nanofibröz yara örtü malzemeleri çeşitli fiziksel ve kimyasal yöntemlerle detaylı bir şekilde karakterize edilmiştir. Öncelikle, ATR-FTIR analizi ile üretilen malzemelerin kimyasal yapıları doğrulanmıştır. Üretilen malzemelerde PCL-Kit, PCL-Kit-Kur5 ve PCL-Kit-Kur10 gruplarına ait su temas açıları sırasıyla 54° ± 7°, 51° ± 14° ve 57° ± 9° olarak ölçülmüş ve yine bu gruplara ait su alım kapasiteleri tüm gruplar için %400'ün üzerinde bulunmuştur. Yirmi sekiz gün boyunca gerçekleştirilen in vitro biyobozunurluk testlerinde tüm gruplar için ~%3-4 arasında kütle kayıpları görülmüştür. Mekanik basma testi sonucunda PCL-Kit, PCL-Kit-Kur5 ve PCL-Kit-Kur10 gruplarına ait 3B nanofibröz yara örtü malzemelerinin elastik modülü sırasıyla 7,6 ± 1,2 kPa, 15,8 ± 1,5 kPa ve 6,6 ± 3,0 kPa olarak bulunmuştur. Bilgisayarlı tomografi görüntülemesiyle tüm yara örtü malzemelerin için toplam gözenekliliğin ~%90 ve üzeri olduğu ve malzemelerde makrogözenekliliğin başarılı bir şekilde sağlandığı gösterilmiştir. Üretilen malzemelere yüklenen kurkumin için enkapsülasyon verimi PCL-Kit-Kur5 grubu için %60,8 ± 2,5, PCL-Kit-Kur10 grubu için ise %72,5 ± 2,8 olarak bulunmuştur. Ayrıca, kurkumin yüklü 3B nanofibröz yara örtü malzemelerinin kurkumin salım profilleri çıkarılmış ve salım kinetikleri matematiksel modeller ile analiz edilmiştir. PCL-Kit-Kur5 grubu için en yüksek korelasyon Higuchi modeli ile, PCL-Kit-Kur10 grubu için en yüksek korelasyon ise sıfırıncı derece kinetik model ile gerçekleşmiştir. Yara örtü malzemeleri ile yapılan hücre kültürü çalışmaları sonucunda sitotoksik etkiler gözlenmemiştir. Ayrıca, bu çalışmalar sonucunda kurkumin içeren 3B nanofibröz yara örtü malzemelerindeki hücrelerin özellikle kültürün ilk 7 günü boyunca diğer gruplara göre çok daha yüksek mitokondriyal aktiviteye sahip oldukları görülmüştür. Taramalı elektron mikroskobu görüntüleri incelendiğinde, 2B nanofibröz matrislerde hücre yapışması ve yayılmasının başarılı bir şekilde gerçekleştiği ancak bu yayılmanın yalnızca malzeme yüzeyinde kaldığı tespit edilmiştir. Bunun aksine, 3B nanofibröz yara örtü malzemelerinde hücrelerin makrogözenekler etrafında malzeme derinliklerinde bile yapışıp yayıldıkları ve hücre-malzeme ve hücre-hücre etkileşimlerinin başarılı bir şekilde oluştuğu görülmüştür. Sonuç olarak, tez çalışması kapsamında kullanılan üretim yöntemi ile farklı boyut ve şekillerde makrogözenekliliğe sahip; hücre yapışması, göçü ve proliferasyonunu destekleyen 3B nanofibröz yara örtü malzemeleri başarılı bir şekilde üretilmiştir. Tez sonucunda üretilen 3B yara örtü malzemelerinin, gelecekte yapılacak olan çalışmalar ile geliştirildikten ve in vivo çalışmalarla detaylı olarak incelendikten sonra, deri doku mühendisliği alanında klinik olarak kullanılabileceği düşünülmektedir.
Vitiligo tedavisine yönelik pimekrolimus yüklü lipozom formülasyonlarının geliştirilmesi
Pigment hastalıkları, deriye rengini veren melanosit hücrelerinin genetik, otoimmün veya çevresel nedenlerle hasar görmesiyle meydana gelen hastalıklardır. Melanositlerde oluşan bu hasarlar sonucunda cilt rengi normal renginden daha koyu (hiperpigmentasyon) ya da daha açık (hipopigmentasyon) bir renk alabilir. Vitiligo, edinsel hipopigmentasyon hastalıklar arasında en sık görülen olup, dünya çapında prevalansı yaklaşık % 8.8 civarındadır. Vitiligo için güncel tedavi seçenekleri arasında medikal, cerrahi, bitkisel ve bazı tıbbi tedaviler bulunmaktadır. Bu tedaviler ile hastalığın semptomları azaltılabilir, ancak bu konvansiyonel yaklaşımlar etkin bir tedavi sağlanmasında yetersiz kalmakta ve yan etkiler oluşturabilmektedir. Günümüzde, immünsüpresif ajan olan pimekrolimus içeren topikal formülasyonlar tedavi amacıyla sıklıkla tercih edilmektedirler. Ancak konvansiyonel formülasyonlar (krem, jel, merhem, losyon, toz) ile yapılan bu tedaviler, düşük penetrasyon özelliklerine sahip olması ve hedef dokulara ulaşamaması nedeniyle yetersiz kalmaktadır. Bu nedenle topikal tedavi, fototerapi veya sistemik tedavi ile kombine şekilde kullanılabilmekte, fakat kombine tedavilerin yan etkileri fazla ve tedavi süresi uzun olabilmektedir. Son yıllarda, yeni nesil formülasyonlar ve ileri teknolojik tedaviler ile vitiligo oluşumunun önlenmesi ve böylece hastanın yaşam kalitesinin arttırılması hedeflenmektedir. Bu açıdan lipozomlar, biyoparçalanabilen, biyouyumlu, biyolojik membranlara benzer yapıda olan, toksik olmayan, penetrasyon arttırma ve hedefleme özelliklerine sahip, etkili ilaç taşıyıcı sistemler olarak dikkat çekmektedirler. Bu avantajlar sayesinde lipozom formülasyonları ile, daha düşük dozlarla hem etkin tedavi sağlanabilmekte hem de ilaca bağlı yan etkiler azaltılabilmektedir. Bu tez kapsamında; lipozom formülasyonları farklı lipitler kullanılarak (Soya-fosfotidilkolin, DPPC, Lipoid S100) ince film tabaka oluşturma yöntemi ile hazırlanmış ve karakterizasyon çalışmaları (partikül büyüklüğü, polidispersite indeksi ve zeta potansiyel ölçümleri, morfolojik özellikler, enkapsülasyon etkinliği ve stabilite testleri) yapılmıştır. Optimize edilen lipozom formülasyonlarının, in-vitro salım/difüzyon özellikleri ve sitotoksisiteleri araştırılmıştır. Sonuç olarak; şu an tedavide kullanılmakta olan konvansiyonel preparatlara alternatif olarak yenilikçi bir formülasyon geliştirilmiştir. Böylece hastalar için daha düşük dozda, daha kısa sürede ve daha etkin bir tedavi seçeneği sağlanmıştır.
Göz içi tümör radyocerrahisi için göz takip sistemi ve kalite güvence fantomunun geliştirilmesi
Uveal malign melanom, erişkinlerde en sık görülen göz içi kanser türüdür. Bu tür tümörlerin tedavisinde sıklıkla stereotaktik radyocerrahi uygulamaları yapılmaktadır. Lineer hızlandırıcılar ve proton terapi cihazları gibi eksternal radyoterapi cihazlarıyla yapılan bu radyasyon tedavilerinde, hedefin bulunduğu gözün hareketinden kaynaklanabilecek hatalı ışınlamaları önleyebilmek için tedavi hazırlığı aşamasında invaziv yöntemlerle gözün immobilizasyonu sağlanır. Bu tez kapsamında, tedavi cihazı ile iletişim kurarak otonom olarak tedaviyi yönetmesi tasarlanan bir göz takip sisteminin ve sistemin kalite güvence testlerinin yapılmasını sağlayacak bir göz fantomunun geliştirilmesi amaçlanmıştır. Tedavi öncesinde gözün immobilizasyonunun sağlanması yerine, geliştirilen sistemin kullanılarak tedavi sırasında göz pozisyonunun takip edilmesiyle göz içi tümörün yalnızca tedavinin planlandığı pozisyonda ışınlanması otonom olarak sağlanabilecektir. Göz takip sistemi, iris tespiti ile göz takibi yapan görüntü algılayıcı tabanlı bir sistemdir. Geliştirilen sistem, takip edilen irisin tanımlanan toleransın içinde olduğu sürece tedavinin sürdürülmesi ve tolerans dışına çıkması durumunda tedavinin duraklatılması için çıktı verebilmektedir. Sistemin iris tespit etme başarısı insan gözü görüntüleriyle test edilmiştir. Sistemin tespit ettiği açı değerlerinin doğrulaması için ihtiyaç duyulan kalite güvence testleri, göz hareketlerinin simüle edilmesi için bu tez kapsamında geliştirilen göz fantomu ile gerçekleştirilmiştir. Fantom üzerindeki göz küresinin tanımlı açı değerlerine hareketinin tespiti, göz takip sistemi ile kaydedilen video görüntüleri kare-kare (frame-by-frame) kontrol edilerek yapılmış ve sapma miktarları değerlendirilmiştir. Sistemin insan gözünde iris tespitini başarıyla sağladığı ve elde edilen iris konturunun video görüntülerindeki kareler arasında sürekliliği görülmüştür. Fantom kullanılarak açı tespitiyle yapılan kalite güvence testlerinde ölçümler tutarlılık göstermiştir. Ayrıca tez kapsamında geliştirilen algoritmalar ile hareket eden göz küresindeki ilk konumu bilinen hedefin eş zamanlı koordinatlarının, açısal hareketinin ve doğrusal yer değiştirme bilgilerinin hesaplanması sağlanmıştır. Bu algoritmaların, tedavi edilecek hedefin hacminin tanımlanması ve tedavide izin verilecek yer değiştirme miktarının belirlenmesinde kılavuzluk sağlamasına ek olarak hedef konumunu eş zamanlı belirleyerek hedef takipli (target tracking) tedavilerin geliştirilmesi amaçlanmıştır. Göz içi tümörlerin eksternal radyoterapi cihazlarıyla radyocerrahisi için geliştirilen bu sistemin, klinikte tedavi öncesi simülasyon görüntüleme, hedef organ hacminin belirlenmesi ve tedavi gibi farklı aşamalarda kullanılması hedeflenmiştir. Göz takip sistemi ile hasta tedavisinin doğruluğu sağlanırken, ışınlanacak hedefin hareket toleransının, hacminin ve eş zamanlı konumunun belirlenmesi, göz fantomu ile de sistemin kalite güvence testlerinin yapılması şeklinde geniş kapsamlı bir tedavi destek sistemi tasarlanmıştır.
Favipiravir yüklü lipozom formülasyonlarının hazırlanması ve in-vitro değerlendirilmesi
Ülkemizde ve tüm dünyada COVID-19 hastalığı pandemi olarak ilan edilmiş ve ağır pnömoni seyrinde yaklaşık 6.5 milyon kişinin ölümüne sebep olmuştur. Günümüzde uygulanan tedavi protokolleri halen kısıtlı olup, henüz spesifik ve etkili bir tedavi yöntemi mevcut değildir. Bu kapsamda, ülkemizde ve dünyada yürütülen Ar-Ge çalışmaları ve klinik araştırmalarda favipiravir (FVP) kullanımının hastalık seyrinin iyileşmesine yönelik olumlu etkilerinin olduğu gözlenmiştir. FVP, influenza ve diğer birçok RNA virüsünün RNA'ya bağlı RNA polimerazını (RdRP) seçici ve güçlü bir şekilde inhibe eden antiviral ilaçtır. Bu kapsamda, virüs replikasyonunu azaltan tedaviler arasında yer almaktadır. Ancak, düşük çözünürlük özellikleri ve aldehit oksidaz tarafından hem metabolize hem de inhibe edilmesi nedeniyle, vücutta yeterli kan seviyelerini elde etmek için ilk oral yükleme dozu gerekmekte ve tedavi için yüksek dozda kullanımı sonrasında hastalarda yan etkiler gözlenmektedir. Son yıllarda, nanoteknolojik yaklaşımlar ile antiviral bileşiklerin etkinliklerinin arttırılması yönünde yapılan çalışmalar artmıştır. Nanotaşıyıcıların avantajları ile etkin maddelerin tedavide kullanılabilecek yeni formülasyonları geliştirilmeye başlanmıştır. Nanolipozomlar, üstün biyouyumluluk, çözünürlük ve hücre penetrasyonunu arttırma gibi avantajları nedeniyle bu sistemler arasında oldukça dikkat çekmektedirler. Bu bilgiler ışığında, tez kapsamında öncelikle formülasyon optimizasyon çalışmaları yürütülmüş ve FVP yüklü nanolipozom (FVP-NL) formülasyonları farklı lipit türevleri (Lipoid-α-fosfotidilkolin, Lipoid S100, Fosfolipon 90G, DPPC) ve organik fazlar (etanol ve kloroform) kullanılarak hazırlanmıştır. Karakterizasyon çalışmaları sonucunda, Fosfolipon 90 G ve kloroform organik fazında hazırlanan nanolipozom formülasyonunun (PB:120.6±4.378; EE: %76.50±1.27) homojen (PDI:0.280±0.038) ve stabil (ZP:30.6±1.48) olduğu gözlenmiştir. İn-vitro salım ve Franz difüzyon çalışmalarında ise, uzatılmış bir salım profili elde edilmiş olup FVP'nin ticari preparatına göre daha uzun sürede difüze olduğu görülmüştür. Sitotoksisite çalışmalarının ardından, formülasyonun etkinliğini belirlemek için SARS-CoV-2 ile enfekte edilmiş Vero E6 hücre hattı üzerinde antiviral aktivite çalışmaları yürütülmüştür. FVP-NL'nin IC50 değeri 1.147 mM olarak tespit edilmiştir. Sonuç olarak, bu tez çalışmasında mevcut tedavilerin dezavantajlarını ortadan kaldırmaya yönelik, etkin ve güvenilir yenilikçi bir nanolipozom formülasyonu geliştirilmiştir. İleri dönemde, bu formülasyonların COVID-19 hastalığı tedavisinde kullanılmak üzere kapsül içerisinde sunularak, oral ve/veya inhaler uygulamaya yönelik çalışmaların yürütülmesi planlanmıştır.
Synthesis, characterization and evaluation of skin tissue engineering potential of poly(lactic acid)-nanoclay composite scaffolds doped with various boron components
This study aims to investigate the characteristic features of boron (B) and nanoclay containing micro/nanocomposites and their effect on the normal human dermal fibroblast (NHDF) cells as a potential material to be used as a wound dressing. In the first part of this study, hybrid composites were fabricated by solvent-casting and electrospinning, and the impact of fabrication methods on resulting scaffolds was investigated. In this regard, montmorillonite (MMT) was modified with trimethyl octadecyl ammonium bromide (TMOD) as a quaternary ammonium salt. Then, B compounds, boron nitride (BN), zinc borate (ZB), or phenylboronic acid (PBA) were adsorbed on organomodified MMT (OMMT), and poly(lactic acid) (PLA) based PLA-OMMT/B hybrid composites were fabricated by solvent-casting and electrospinning. Modification of MMT nanoparticles with TMOD occurred through an ion-exchange reaction, leading to a series of critical changes in characteristic properties of the resulting composite: better distribution, enhanced mechanical and thermal properties, faster biodegradation, and higher crystallinity. Although the modification of MMT improved the overall properties of hybrid composites produced by both fabrication methods, electrospun scaffolds demonstrated superior characteristics to solvent-cast membranes. Consequently, fibrous scaffolds were chosen for antibacterial tests and cell culture studies. Scaffolds containing OMMT in their structure exhibited dramatic inhibition against gram-positive bacteria. Moreover, hybrid composites with ZB and PBA demonstrated both bacteriostatic and bactericidal effects for gram-positive Staphylococcus aureus (S. aureus) and gram-negative Escherichia coli (E. coli). The 100%, 50%, and 25% (v/v) extracts of the PLA-OMMT scaffolds showed a modest cytotoxic effect on the NHDFs at the second-day culture that probably originated from TMOD. These results were evaluated as PLA-OMMT/B scaffolds, thanks to their antibacterial, morphological, and chemical properties can be used as a wound dressing that supports the early stages of wound healing, where it will show limited interaction with cells. In the second part of this study, BN, ZB, and PBA were adsorbed on neat MMT, and PLA-based MMT/B micro composites were fabricated by electrospinning. The incorporation of neat MMT into the polymer matrix not only enhanced thermal properties and water uptake capacity but also led to the generation of porous nanofibers with antibacterial effects against S. aureus. The composites with BN, ZB, and PBA demonstrated bacteriostatic effects against both E. coli and S. aureus. In-vitro cell culture studies performed with NHDF indicated the non-toxic effect of utilized B compounds. The scanning electron microscope (SEM) and live/dead staining of cell-containing scaffolds showed that the incorporation of MMT supported cell adhesion and proliferation, and the further addition of B compounds, especially PBA, increased cell viability for 14 days. The cells retained their healthy morphology and viability in all groups, meaning that functionalized fibrous scaffolds were suitable for skin tissue engineering applications.
Investigating the effectiveness of wheat starch and polymeric additives on the production of biomedical thermoplastic starch composites
The presence of natural polymers as biomaterials has had a desirable efficacy on the development and progress of medical science research. Starch is a natural polymer that is abundant in nature, cost-effective, biodegradable, biocompatible, and non-toxic that has been recognized as a biomaterial with the potential to use in tissue engineering and pharmaceutical various fields of experiments. Practically, numerous hydrogen bonds amongst starch macromolecules make starch decompose, before reaching the melting point, under rising temperature conditions. This property can limit the usage of starch in different situations of research, however by modifying starch to thermoplastic starch (TPS), the mentioned problem can almost be solved. Conversion of starch to TPSs, improve the raw starch's physical, chemical, mechanical, and functional abilities, which is the first aim of the research, where the next goal of the study is to evaluate the effects of different type and the ratio of plasticizers in fabricated TPS films' mechanical and chemical properties to be able to choose the right options for use in tissue engineering research. Starch granules in the presence of water, heat, and shear condition by mixing with plasticizers like glycerol and D-sorbitol, which are approved by the Food and Drug Administration (FDA), undergo disruption, which causes a homogeneous melt named TPS. The last aim of the current research is to investigate TPS films' biocompatibility and cytotoxicity properties by seeding normal human dermal fibroblast (n-HDF) cells on them. In this study, Thermoplastic wheat starch (TPS) films were fabricated with 30% to 70% total plasticizer with different ratios of glycerol and D-sorbitol by solution casting method. Wheat starch due to its higher amylose content which can increase tensile strengths and young's modulus of the TPS was selected in fabricating the TPS films. The plasticizers portion of the films was altered from 30% to 70% depending on the starch weight (3 g). After the mechanical test, from this point of view, six TPS films were selected for the advanced analysis due to their pioneer mechanical properties. Generally, TPS Films with total plasticizers of 30% and 40% presented higher tensile strength, toughness, and elastic modulus values in comparison to films with a total plasticizer of 50%, 60%, and 70%. Increment in the ratio of the D-sorbitol to glycerol in TPS films with equal total plasticizers had led to higher density value and thermal stability, however, reduces moisture absorption, and hydrolytic degradation ratio of the TPS films. Three groups of the films with 60% (20S-40G), 50% (20S-30G), and 40% (10S-30G) plasticizers, presented higher biocompatibility and proper surfaces for cells adhesion and proliferation, from the normal human dermal fibroblast cells viability analysis. Overall, TPS films showed better mechanical and physical properties at lower percentages of plasticizer, on the contrary, in cell studies, an increment in the percentages of plasticizers led to higher cell adhesion and viability, therefore increasing the biocompatibility of the TPS films.
Aloe vera bazlı bijeller: Sentez, karakterizasyon ve biyoaktif ajan salımındaki etkinliklerinin incelenmesi
Bu çalışma ''Aloe vera Bazlı Bijellerin Sentezi, Karakterizasyonu ve PLGA Nanopartikül Yüklü Transdermal Melatonin Salım Sistemlerinin Geliştirilmesi'' Hızlı Destek Projesi kapsamında (FHD-2022-19944 nolu) Hacettepe Üniversitesi Bilimsel Araştırma Koordinasyon Birimi tarafından desteklenmiştir. Sunulan tez çalışmasının ilk aşamasında, Aloe vera yağı organojeli ve ĸ-carrageenan/ Aloe vera hidrojeli kullanılarak yenilikçi bir bijel sistemin oluşturulması hedeflenmiştir. İkinci aşamada üretilen bijellerin karakterizasyon çalışmalarının yapılması hedeflenmiştir. Son aşamada ise üretilen bijellere amfifilik yapıda bir hormon olan melatoninin yüklenmesi ile oluşturulan hibrit yapının, transdermal salım sistemi olarak kullanım potansiyelinin incelenmesi hedeflenmiştir. Bu amaçlar kapsamında ilk olarak, ĸ-carrageenan/ Aloe vera tabanlı hidrojel ve Aloe vera yağı kullanılarak organojel üretimi gerçekleştirilmiştir. Ardından hidrojel/organojel oranı (H:O), 90:10, 70:30, 50:50, 30:70, 10:90 olacak şekilde hidrojel ve organojel oda sıcaklığında karıştırılarak kararlı yapıya sahip bijeller üretilmiştir. Üretilen bijellerin fiziksel, kimyasal, mekanik ve reolojik özellikleri incelenmiştir. Bijellerin 25℃ ve 37℃ sıcaklıklarda gerinim, frekans ve viskozite değerleri incelenerek reolojik özellikleri belirlenmiştir. Sonrasında bijellerin sitotoksik etkisinin belirlenmesine yönelik hücre kültür çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Son aşamada biyoaktif ajan olarak seçilen melatonin, poli (laktik-ko-glikolik asit) (PLGA) nanopartiküllerine, nanopartiküller içerisinde bijellere ve serbest halde bijellere yüklenerek in vitro salım kinetikleri incelenmiştir. Çalışma sonucunda hidrojel/organojel oranı 10:90 olan bijelin sarıya yakın renkte homojen olmayan bir dağılım gösterdiği, 90:10 oranındaki bijelin ise beyazımsı, pürüzsüz ve homojen bir dağılım gösterdiği gözlenmiştir. Ayrıca hazırlanan bijellerin tüm oranlarda mekanik açıdan herhangi bir farklılık göstermediği görülmüştür. Bijellerin 25℃ ve 37℃'de viskoelastik özellikte olup, katı jel davranışı sergiledikleri ve tüm bijel oranlarında artan kayma hızıyla viskozitelerinin azaldığı belirlenmiştir. Böylelikle bijellerin iyi yayılabilirlik özelliği gösterdiği anlaşılmıştır. L929 fibroblast hücreleri ile yapılan in vitro sitotoksisite deneyleri bijellerin toksik özellik taşımadığını göstermiştir. İn vitro melatonin salım sonuçları değerlendirildiğinde, en hızlı melatonin salımı, serbest melatonin yüklü bijellerden gerçekleşirken, en yavaş salımın melatonin yüklü PLGA nanopartikül içeren bijellerde görülmüştür. Sunulan tez çalışmasında ilk kez Aloe vera bazlı bijeller sentezlenmiş ve transdermal yolla melatonin salım potansiyeli PLGA nanopartiküllerin de katkısıyla in vitro olarak incelenmiştir. Elde edilen bulgular ışığında hazırlanan bijellerin transdermal salım sistemleri olarak çeşitli farmasötik/kozmetik ajanların kontrollü salımında kullanılabileceği değerlendirilmiştir.
Nerve guidance conduit application of magnesium alloys
Surgery is insufficient for peripheral nerve injuries larger than 5 mm. Function loss and scar formation occur as a result of slow healing rate and inflammation cells filling the damaged gap. Therefore, isolation of damaged area from surrounding tissue is crucial for treatment. For this purpose, NGCs have increasingly gained interest both in literature and clinic. Biocompatibility, slow biodegradation and semi-permeable structure that allow oxygen/nutrition/waste transfer and prohibits inflammation cells are the main requirements for NGCs. Therefore, biodegradation rate and degradation product toxicity of the material and a fabrication method that provides porosity control are crucial. In the literature, fabrication of NGCs with low cost and easy to use methods by using polymers is widely studied. On the other hand, even though metals can provide higher mechanical strength and electrical conductivity, they are not preferred for NGCs since it is not possible to obtain micro-scale porosity by conventional methods. In this thesis, development of a magnesium alloy-like compound with a similar composition of a magnesium alloy widely studied in the literature for stent applications and obtained FDA approval, for the use of NGC applications was studied. Magnesium is an abundant element found in human body, with high nutritional value, low density, high specific strength, high electrical conductivity and low toxicity. Therefore, it was planned to achieve enhanced physical, chemical and biological performance by using magnesium based alloy-like compound for NGC. For the fabrication of the compound, instead of conventional approaches, electrospinning were selected due to its ease of use and porosity control capability, and the spinning was conducted with the nitrates of alloy components and polyvinylpyrrolidone or polyvinylalcohol used as raw materials of the solution. Solution parameters such as concentration, temperature and viscosity, and electrospinning parameters such as voltage, distance and feeding rate were optimized with naked-eye observations and SEM. Electrospun samples were then underwent a gas flow-temperature-time controlled calcination under argon atmosphere in order to crystallize the components into alloy-like compound and remove non-alloy components. The calcination profile containing multiple temperature and duration steps was designed according to the thermal analyses applied to electrospun samples where all possible endothermic and exothermic phase transformations such as glass transition temperature, melting temperature and crystallization temperature were measured and analyzed with mathematical reaction kinetics. The crystallographic structure, elemental composition and morphological properties of the calcinated samples as well as removal of non-alloy components were determined with XRD, EDX, SEM and XPS. Additionally, physical and chemical properties such as absorption/swelling capacity, wettability, permeability and degradation rate were obtained as a part of characterization studies. In the final stage of the thesis, the cell-material interaction of the developed NGC candidate material was examined with MTT assay, haemocytometric counting and several staining/imaging techniques in terms of cell viability, attachment, proliferation and growth using fibroblast cell line. The physical, chemical and biocompatibility data obtained in this thesis showed that the fibrous magnesium based alloy-like compound fabricated with electrospinning could be a potential candidate for NGC applications.
Hücre tabakası mühendisliğinde kalınlık ve vaskülerizasyon problemlerine yönelik stratejilerin geliştirilmesi
Doku mühendisliği çalışmaları kapsamında bugüne kadar çeşitli dokuları onarmak ve yenilemek amaçlı çeşitli biyomalzemeler, hücreler ve biyosinyal molekülleri tek başlarına veya birlikte kullanılarak doku mühendisliği ürünü yapıların eldesine odaklanılmıştır. Hücresel terapilerle başlayan doku mühendisliği yolculuğu doku iskelesi temelli yaklaşımlarla büyük bir yol kat etmiş ancak hazırlanan bu üç boyutlu dokularda, hücre canlılığı için temel gereksinim olan çeşitli gaz ve besin maddelerinin taşınımı ve metabolik atıkların uzaklaştırılması sağlanamamıştır. Araştırmacılar bu bağlamda çeşitli biyoreaktörlerin tasarımı ve üç boyutlu biyofabrikasyon yöntemleri ile difüzyon sınırlamalarını ortadan kaldıracak tasarımlara yönelmiş ve elde edilen yapılarda çeşitli teknikler ile kütle aktarımını sağlayacak vasküler ağ yapısını oluşturmayı hedeflemişlerdir. Sunulan bu tez çalışması kapsamında da çeşitli doku hasarlarında kullanılmak üzere üç boyutlu biyofabrikasyon yöntemlerinden biri olan hücre tabaka mühendisliği ile çok katmanlı doku eşleniklerinin üretilmesi ve vaskülerize edilmesi amaçlanmıştır. Öncelikle MC3T3-E1 fare osteoblast öncülü hücreler, büyüme ortamı ve osteojenik ortam varlığında sıcaklık duyarlı kültür kaplarında (Nunc Upcell) ayrı ayrı kültürlenmiş ve hücre tabakası oluşturma potansiyelleri incelenmiştir. Bu aşamada MC3T3-E1 hücrelerinden oluşan sağlam, başka bir yüzeye transfer edilebilir ve pratik olarak elde edilebilir bir hücre tabakası eldesi literatürde ilk defa önerilmiştir. Hücre tabakaları eldesi sürecinde mikroskobik ve makroskobik görüntüleme, kollajen ve sülfatlanmış glikozaminoglikan (sGAG) miktarı tayini, osteojenik genlerin ifade düzeylerinin belirlenmesi, Alizarin Kırmızısı ile mineralizasyon sürecinin incelenmesi ve kalsiyum miktarı tayini çalışmaları yürütülmüş ve elde edilen bulgularla osteojenik ortamın üstünlüğü ortaya konulmuştur. Tez çalışmasının bir sonraki aşamasında osteojenik ortam uygulaması ile elde edilen hücre tabakaları üst üste lamine edilerek doku kalınlıkları artırılmaya çalışılmıştır. Bu aşamada, doku kalınlığını artırmaya yönelik ayrı bir yöntem olarak yine tez çalışması kapsamında üretilmiş, elektroeğirilmiş poli(L-laktik asit) (PLLA) membranlar kullanılmış ve nihai yapıların elde edilme süreci mikroskobik ve makroskobik bulgularla aydınlatılmıştır. Ardından PLLA membran kullanılarak elde edilen ve doğrudan hücre tabakalarının üst üste lamine edilmesiyle elde edilmiş çok katmanlı hücre tabakalarının in vitro etkinlikleri araştırılmıştır. Bu bağlamda, elde edilen nihai yapılarda öncelikle hücre canlılıkları ve hücre ölümü mikroskobik ve kolorimetrik yöntemlerle araştırılmıştır. Ardından, bir PLLA membranın üzerine iki hücre tabakasının lamine edilmesiyle oluşturulan ve toplam 3 PLLA membran ve 4 hücre tabakası içeren çok katmanlı yapıların kültür süresince sergilediği üstün sağ kalım ortaya konulmuştur. Böylece sunulan bu tez çalışması kapsamında doku mühendisliği ürünü, hücre-biyomalzeme kombinasyonunun sağlandığı, çok katmanlı, ıslak hali yaklaşık 1 mm olan, pratik bir şekilde transfer edilebilen, hücrece zengin ve hücrelerin kendi ECM'ini beraberinde taşıdığı üç boyutlu doku eşleniği yapılar üretilmiştir. Elde edilen bu yapılarda ayrıca kültür süresince alkalen fosfataz aktivitesi, kollajen, sGAG sentezine ilişkin karakterizasyonlar gerçekleştirilmiştir. Tez çalışmasının son kısmında ise bir önceki aşamada elde edilen nihai yapılarda ilerleyen süreçlerde vasküler ağ oluşumunu teşvik edecek endotel hücresi kültürü çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla yine bu tez çalışması kapsamında yüzeyi kanal ile desenlenmiş poli(gliserol sebakat) PGS elastomerler geliştirilmiş, karakterize edilmiş ve endotel hücresi kültürasyonu için ideal kültür şartlarının belirlenmesine yönelik çalışmalar gerçekleştirilmiştir. PGS elastomerlerinin kanallarında 14 gün süreyle endotelyal besi ortamı (EGM-2) ile kültüre edilen HUVEC hücrelerinin poligon biçiminde tübüler organizasyon sergilediği gözlemlenmiş ve anjiyogenezis sürecinin başladığı düşünülmüştür. Tez çalışması kapsamında geliştirilen yaklaşımların kraniyofasiyal kemik doku rejenerasyonu için kullanılabilirliği önerilmiş ve ileride osteokondral, kornea veya damar gibi ikili veya daha fazla mikroçevre içeren doku mühendisliği uygulamaları için de potansiyel teşkil edebileceği düşünülmüştür. Anahtar Kelimeler: Hücre Tabaka Mühendisliği, Çok Katmanlı Doku Eşlenikleri, Doku Kalınlığı Limitasyonu, Vaskülerizasyon.
Hücrelerinden arındırılmış miyokardiyal doku ile hücre tabakası destekli kalp yaması geliştirilmesi
Sunulan tez çalışmasında kardiyovasküler hücre tabakası ve hücrelerinden arındırılmış miyokardiyal hücre dışı matrisin (ECM) birleştirilmesi ile kalp yaması üretilmesi hedeflenmiştir. Çalışmada doku mühendisliğinin yenilikçi yaklaşımları arasında yer alan ''hücre tabaka teknolojisi'' ve ''hücresizleştirme yaklaşımı'' birleştirilmiştir. Böylece, kalp hastalıklarının tedavisi için kullanılabilecek in vitro kalp doku modeli geliştirilmiştir. Tez çalışmasının ilk aşamasında, kardiyovasküler hücre tabakalarının üretiminde kullanılan, H9C2 sıçan kardiyomiyoblast hücre hattı ve primer sıçan kardiyak mikrovasküler endotel hücreleri (KMEH)'nin karakterizasyon çalışmaları yapılmıştır. Ardından, yalnızca H9C2 hücre hattı kullanılarak hücre tabakası üretmek için 3 farklı yöntem, sıcaklık duyarlı kültür kapları, yüksek hücre ekim yoğunluğu ve serum konsantrasyonu ve askorbik asit (AA) uygulaması, kullanılmıştır. Genel olarak tüm hücre tabakalarında canlılığın yüksek oranda korunduğu ve hücre tabakalarının sırası ile kültürün 7., 9. ve 5. günlerinde başarılı şekilde yüzeyden kaldırıldığı belirlenmiştir. Ayrıca hücrelerin gen ekspresyon seviyelerinin hücre kültür kabı yüzeyinden, hücre ekim yoğunluğundan ve kültür ortamındaki AA ve serum konsantrasyonundan etkilendiği gözlenmiştir. Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) analiz sonuçları, poli(izopropil akrilamid) (PIPAAm) kaplı kültür yüzeyinin iskelet kası spesifik L-tipi voltaj bağımlı Ca+ kanalı (Alfa 1s, Cacna1s) gen ifadesini arttırdığını, düşük hücre ekim yoğunluğunun ise Cacna1s ve kardiyak troponin T (Tnnt2) ekspresyonunu azalttığını ve kollajen I (Col1a1) gen ekspresyonunu arttırdığını göstermiştir. Kültür ortamında yüksek serum konsantrasyonu ve AA kullanılması ile hücrelerin Col1a1 gen ekspresyonunun arttığı gösterilmiştir. Askorbik asitin etkisi değerlendirildiğinde, normal serum içeren ortamda H9C2 hücrelerinin miyojenik karakterinde artış meydana geldiği, ancak, yüksek serum ile birlikte 100 µg/mL AA kullanıldığında kardiyomiyojenik karakteri yüksek hücre tabakalarının üretildiği belirlenmiştir. Kardiyovasküler hücre tabakalarının üretilmesi için, öncelikle H9C2 hücreleri retinoik asit (RA; 10 nM, 50 nM ve 100 nM) içeren ortamda farklı sürelerde (5 ve 7 gün) kültüre edilmişler ve kardiyomiyosit hücrelerine farklılaştırılmışlardır. İmmünofloresan boyama ve RT-PCR analizleri sonucunda 5 gün süresince 100 nM konsantrasyonda RA uygulamasının farklılaşma için en uygun koşul olduğu belirlenmiştir. Ardından farklılaştırılmış H9C2 hücreleri ve KMEH'leri ko-kültür şeklinde (6:1) farklı konsantrasyonlarda AA (20, 50, 100 µg/mL) ve serum (%10.5 ve %15.0 v/v) içeren ortamlarda kültüre edilmişlerdir. Tüm gruplarda yüksek oranda canlılık gösteren hücre tabakası elde edilmesine rağmen, %10.5 (v/v) FBS ve 100 µg/mL AA konsantrasyonda kardiyomiyojenik özelliklerin en yüksek olduğu belirlenmiştir. Bu nedenle kalp yaması üretimi için bu koşullarda elde edilen hücre tabakaları kullanılmıştır. Tez çalışmasının ikinci aşamasında, kalp yamasının ikinci bileşeni olarak, hücresizleştirilmiş miyokardiyal ECM iskele üretimi için 2 farklı yöntem (SDS ve OGP) kullanılmıştır. Taramalı elektron mikroskobu (SEM), immünofloresan boyama, histolojik boyama ve DNA analizi sonuçları hücresizleştirmenin SDS yönteminde başarılı şekilde gerçekleştirildiğini ve doğal doku ile karşılaştırıldığında DNA içeriğinde ~%89 oranında azalma olduğunu göstermiştir. Ayrıca gerçekleştirilen hidroksipirolin, GAG analizi ve sitotoksisite testi ile yöntemin ECM yapısına zarar vermediği ve hücrelere toksik kimyasal kalıntı bulundurmadığı belirlenmiştir. Adipoz kökenli mezenkimal kök hücreler (AKMKH) ve KMEH'ler kullanılarak, hücresizleştirilmiş ECM iskele üzerinde 2 haftalık in vitro ko-kültür çalışması gerçekleştirilmiştir. Kardiyomiyojenik farklılaşmayı uyarmak için 24 sa süresince 5-Azasitidin (5-Aza) uygulaması yapılmıştır. Hücrelerin, kültür süresince, canlılıklarını yüksek oranda korudukları ve iskele içerisinde damar benzeri lümen yapıları oluşturdukları belirlenmiştir. Ancak, yapılan analizler (immünofloresan boyama ve RT-PCR) 5-Aza'nın, kalp ECM nişi üzerindeki AKMKH'lerin kardiyomiyojenik farklılaşmasında tek başına yeterli olmadığını göstermiştir. Kardiyovasküler hücre tabakası destekli miyokardiyal yamanın üretilmesi için AKMKH ve KMEH ekimi gerçekleştirilmiş ECM iskele yapısı, elde edilen kardiyovasküler hücre tabakası ile birleştirilmiştir. Kardiyomiyojenik farklılaşmanın desteklenmesi için 24 sa 5-Aza uygulaması yapılmıştır. 5-Aza'nın, kardiyomiyositler ile doğrudan ko-kültür etkisi yardımıyla, ECM nişi üzerindeki AKMKH'lerin kardiyomiyojenik farklılaşmasını desteklediği gözlenmiştir. RT-PCR sonuçları hücrelerin Tnnt2 ve Gata4 gen ekspresyonlarında artış olduğunu göstermiştir. Ayrıca, kimyasal uyarıcı ajan bulunmadığı durumda, kalp ECM nişi ve kardiyomiyositler ile doğrudan ko-kültürün de AKMKH'lerin kardiyomiyojenik farklılaşmasını desteklediği belirlenmiştir. Çalışma kapsamındaki tüm sonuçlar değerlendirildiğinde sıcaklık duyarlı kültür kaplarının kullanımına gerek duyulmadan hücre tabakalarının başarılı şekilde elde edilebildiği belirlenmiştir. Ayrıca, AKMKH'lerin kalp ECM nişi, kardiyomiyositler ile doğrudan ko-kültür ve 5-Aza'nın üçlü sinerjik etkisi ile kardiyomiyojenik farklılaştırılabildiği gözlenmiştir. Sonuç olarak, damarlanma potansiyeli yüksek bir in vitro kalp doku modeli ortaya konmuştur. Üretilen kalp yamasının, sıçanlar üzerinde gerçekleştirilecek in vivo deneylerde kullanıma uygun olduğu gösterilmiştir. Bu çalışmalarda başarılı sonuçlar alındığı takdirde, yamanın klinik çalışmalara uyarlanarak, kalp hasarlarında alternatif bir tedavi yaklaşımı olarak değerlendirilebileceği belirlenmiştir.
Meme kanseri hücreleriyle üç boyutlu tümör modellerinin geliştirilmesi ve noç reseptörü inhibitörünün uygulanması
Klinik öncesi çalışmalarda hastalık modelleri olarak hücre kültürleri vazgeçilmez araştırma araçlarından biridir. Tek tabaka (Monolayer) olarak oluşan İki boyutlu (2B) kültür doğal dokunun ekstraselüler matris (ESM) etkileşimlerini bulundurmaz. Dolayısıyla, hastalık modellemelerinde gerçekçi çözümler sunamamaktadır. Bu nedenle doku mühendisliği yaklaşımıyla geliştirilen üç boyutlu matrisler ile doğal ESM benzeri in vitro üç boyutlu (3B) tümör modelleri oluşturulması üzerinde çalışılmaktadır. Bu tez çerçevesinde, toplumda kadınlarda oldukça yaygın olarak görülen ve ölümcül patolojisi olan meme kanseri için üç boyutlu bir in vitro model oluşturmak ve oluşturulan modelde bir ilaç hedefi olan Noç reseptörün inhibisyonu hedeflenmiştir. Bunun için, tümör dokusu ekstraselüler matrisini taklit etmek amacıyla glikozaminoglikanlardan (GAG) kondroitin sülfat ve hyalüronik asidi bileşiminde içeren hidrojel-nanofiber kompoziti aljinat tabanlı matrisler tasarlanmıştır ve glukoz kullanılarak oluşturulan yapıya porosite kazandırılmıştır. MDA-MB-231 hücre hattı oluşturulan 3B matrislerde üretilmiştir. Jel matrislerde, yapılan taramalı elektron mikroskop görüntülerinde glukozla hazırlanan matrislerde istenen özellikte porlu yüzey özellikleri saptanmıştır. 3B matrislerle yapılan kültürde kullanılan matrislerin hepsinde hücre çoğalması 2B kültüre göre artmıştır, özellikle glukoz içerikli olanlarda hücre çoğalmasının en yüksek olduğu belirlenmiştir. Noç inhibisyonu, 2B kültürdeki hücrelerin çoğalmasını azaltırken 3B matristeki hücrelerin çoğalmasını istatistiksel olarak anlamlı şekilde etkilememiştir. Aljinat-hyalüronik asit ve glukoz içeren matrislerde en iyi hücre çoğalması sağlanmıştır. Sonuç olarak, aljinat, hyalüronik asit, glukoz ve jelatin/kondroitin sülfat kompozit elektro-eğirilmiş fiber içeren matrislerin hücre dostu ve ekstraselüler matris benzeri yapılar oluşturduğu ve bunların ilaç geliştirme ve dozlama çalışmalarına uyarlanabilecek sistemler olduğu belirlenmiştir.