464
Archived Theses
0
DOIs Assigned
0%
DOI Rate
Discipline
Meme kanseri modeli olarak MCF-7 hücre hattında iyot uygulamasının hücre çoğalması üzerine etkisi
Giriş ve Amaç: Meme kanseri, günümüzde kadınlarda sıklığı ve ölüm oranlarıyla ilk sıradaki kanser türüdür. Cerrahi, radyoterapi, kemoterapi ve akıllı ilaç tedavileri uygulansa da halen alternatif tedavilere ihtiyaç vardır. Artan vakalar, koruyucu olduğu düşünülen takviye besinlerin, vitaminlerin, eser elementlerin ve birtakım bitkisel ürünlerin kullanımını arttırmıştır. İyotlu ürünler de bunlardan bazılarıdır. İyot kullanımı ve meme kanseri insidansındaki arasındaki bağlantı ilk olarak epidemiyolojik çalışmalarda fark edilmiş, ardından hayvan ve hücre çalışmaları ile desteklenmiştir. Çalışmamızda da, MCF-7 meme kanseri hücre hattında, iyot uygulamalarının çoğalma davranışına etkisini belirlemeyi, homeopatik amaçla alınan iyotlu ürünlerin, farkında olunmayan bir tümöre etkisini in vitroda simüle etmeyi amaçladık. Gereç ve Yöntemler: MCF-7 hücrelerinde değişen dozlarda (1, 2 ve 3 mM) iyot (I2) ve I2+KI uygulamalarıyla, çoğalma davranışı MTT, koloni formasyon, 3D sferoid kültür ve migrasyon deneyleri ile kalitatif olarak incelendi. Hücre çoğalma belirteci olan Ki-67 molekülünün immün floresan boyama ile pozitiflik oranları değerlendirildi. Bulgular: MTT deney sonuçlarına göre, en düşük dozda her iki iyot grubunda canlı hücre sayısında anlamlı bir azalma olmadığı, 2 mM dozda I2'nin, hücre canlılığında 48 saatte %20'lik bir düşüş sağladığı, I2+KI'nin canlı hücre sayısını 24 saatte %85'e, 48 saatte %74'e düşürdüğü belirlendi. En yüksek dozda 24 saatte I2, %61'e, I2+KI, %45'e, 48 saatte I2 %31'e, I2+KI %21'e düşürdü. Migrasyon deneyi ile, yüksek doz iyot gruplarında çizim kenarlarındaki yoğun düzensizleşmeler ölçümlerin sağlıklı yapılmasını engelledi. Analizler değerlendirme dışı bırakıldı. Koloni formasyon deneyi ile 3 mM I2'de canlı kalan hücreler gözlense de koloni oluşumu saptanmadı. Diğer gruplarda koloni formasyon belirlendi. I2+KI'da hücrelerin her üç dozda da kontrol grubuna oranla daha çok koloni oluşturduğu gözlendi. 3D kültürlerde I2'nin 2 mM ve 3 mM dozlarında, I2+KI'nin sadece 3 mM dozunda kontrole kıyasla sferoid alanında anlamlı bir artış görüldü. I2'nin 2 mM ve 3 mM dozlarında ve I2+KI'nın sadece 1 mM dozunda sferoid yoğunluğunda anlamlı değişiklik gözlendi. Ki-67 skorlaması, Ki-67 pozitif boyanan hücrelerin 3 mM I2+KI dışındaki gruplarda aritmetik olarak birbirine yakın olduğu, 3 mM I2+KI'de ise diğer gruplardan %28,5-%8,3 oranında daha düşük pozitiflik gözlenmiştir. Sonuç: I2 ve I2+KI uygulamasının MCF-7 hücrelerinde doza ve süreye bağlı olarak canlılığı azalttığı gösterilmiştir. Migrasyon deneyleri değerlendirme dışı bırakılmıştır. Farklı formlarda uygulanan iyot, koloni oluşturma kabiliyeti üzerine farklı etkiler göstermiştir. Etki, iyot formlarının farklı tutulumunun olabilmesine bağlanmıştır. 3D kültürlerde iyodun hücrelerarası bağlantıları zayıflattığı, bu durumun hücreyi apoptoza sürükleyebileceği ya da hücrenin epitelyal mezenkimal dönüşüm geçirebileceği şeklinde yorumlanmıştır. Ki-67 sağ kalan hücrelerde değerlendirildiğinden, iyot da ileri seviyede hücre kaybına yol açtığından, MCF-7 hücrelerinde, in vitroda Ki-67'nin verimli bir belirteç olmadığını düşünülmüştür. Anahtar kelimeler: MCF-7, Meme Kanseri, İyot, Ki-67, Proliferasyon
Flavopiridol'ün pankreas kanseri hücrelerinde anti-proliferatif etkilerinin değerlendirilmesi
Pankreas kanseri, dünya çapında neredeyse vaka sayısı kadar ölüme neden olmak ile birlikte pankreas kanserlerinin yüzde 90'ından fazlasını pankreatik duktal adenokarsinom (PDAC) oluşturur. Hastalarının büyük çoğunluğu, PDAC ilerlemesini tetiklediği düşünülen KRAS mutasyonlarını ve yarısında fazlası ise CDKN2A, TP53 ve SMAD4'ün inaktive edici mutasyonlarını taşımaktadır. Otofaji PDAC'da proliferasyonu, invazyonu ve metastazı, metabolizmayı, hücre ölümünü veya bağışıklığı modüle ederek PDAC'ın agresifliğini arttırmaktadır. Son otuz yılda kanser tedavisi için FDA onaylı ilaçların yaklaşık %80'i ya doğal ürünler ya da türevlerinden elde edilmiştir. FDA onaylı doğal bir bileşiğin yarı sentetik formu olan Flavopiridol (FP) ise hali hazırda bir antikanser ajan olarak kullanılmaktadır. Çalışmamızda FP'ün PDAC hücrelerinde otofaji mekanizmasındaki rolü araştırılmıştır. Elde ettiğimiz sonuçlar göre, FP'ün sağlıklı pankreas hücrelerini etkilemeyen fakat kanserlileri öldüren en etkili dozların 100 ve 200 nM olduğu tespit edildi. Belirlenen iki dozunda Panc-1 hücrelerinin koloni oluşumunu engellediği tespit edildi. Otofaji tetiklenmiş Panc-1 hücrelerinde seçilen tüm FP dozların Siklin D1, ATG12, ATG16L1 ve ATG5 protein düzeyini azalttığı gözlendi. Beklin-1 protein ekspresyonunda 100 nM dozda azalış, 200 nM dozda ise artış tespit edildi. Gen düzeyinde tüm dozlar Siklin D1, ATG5 ve Beklin-1 ekspresyonunu azaltırken, 100 nM dozun ATG16L1 gen ekspresyonunu attırdığı fakat 200 nM dozun azalttığı görüldü. Ayrıca LC3B, Bcl-2 ve Kaspaz-3 protein konsantrasyon sonuçları ayrıca değerlendirildi. Kanserli hücrelerde sağlıklı hücrelere oranla Kaspaz-3 ve LC3B konsantrasyonu az olduğu tespit edilirken, Bcl-2 yüksek bulundu. Fakat FP dozları uygulandıktan sonra Kaspaz-3 konsantrasyonunda artış, Bcl-2 ve LC3B konsantrasyonunda azalış tespit edildi. Elde edilen veriler ışığında FP'ün PDAC hücrelerinde proliferasyonu, koloni formasyonunu, migrasyonu ve otofajiyi inhibe ettiği görüldü.
Flavopiridol'ün, pankreatik duktal adenokarsinoma hücrelerinde epiteliyal-mezenkimal geçiş üzerinden anti-metastatik rolünün araştırılması
Pankreas Kanseri, tedavi ve tanıdaki yetersizlikleri, yüksek agresif özellikte olması ve kemoterapötiklere dirençli olmsı sebebiyle, dünyada en ölümcül kanserlerinden birisidir ve sağkalım oranı oldukça düşüktür. Dolayısıyla ivedilikle yeni terapötik yaklaşımların geliştirilmesi elzemdir. Bu çalışmada bir flavonoid olan Flavopiridol'ün (FP) pankreas kanseri hücre hatları olan Panc-1 ve MIA Paca-2'nın epiteliyal-mezenkimal geçiş üzerindeki etkisi araştırılmıştır. Elde edilen veriler sonucunda FP'nin pankreas kanseri hücreleri üzerinde 24 saatlik zaman dilimi için 300-400-500 nM; 48 saatlik zaman dilimi için 100, 200, 300 nM en etkili dozlar olduğu belirlenmiştir. FP'nin EMT belirteçlerinin protein düzeyindeki etkisine bakıldı. Panc-1 hücrelerinde ZEB-1 ve Vimentin ekspresyonunda en çok azalma 48 saatlik zaman diliminde 300 nM FP ile sağlandı. MIA PaCa-2 hücrelerinde ise 48 saat 300 nM FP ile ZEB1 ve 24 saat 500 nM ile 48 saat 300 nM Flavopiridol Vimentin ekspresyonunu azalttı, Snail ve N-Kaderin ekspresyonlarında 48 saatlik Flavopiridol muamelesinin tüm dozlarında azalma gözlemlendi. Epiteliyal proteinler olan Klaudin ve E-Kaderin ekspresyonunun ise 24 saat FP uygulamasıyla arttığı tespit edildi. FP, gen düzeyinde Panc-1 hücrelerinde 24 saat 400 nM ve 48 saat 300 nM muamelesiyle Klaudin mRNA'sını; iki zaman diliminde de 300 nM muamelesiyle E-Kaderin mRNA'sını artırtığı; Vimentin mRNA'sını her iki zaman diliminde de 300 nM, ZEB1 mRNA'sını 24 saat 300 nM, 48 saat 200 nM muamelesiyle azalttığı belirlendi. MIA Paca-2 hücrelerinde ise, Klaudin mRNA'sı 24 saat 500 nM, 48 saat 200 nM; E-Kaderin mRNA'sı 24 saat 500 nM, 48 saat 300 nM FP muamelesi ile artarken; Vimentin mRNA'sı her iki zaman diliminde 300 nM, ZEB1 mRNA'sı ise 24 saat 300 nM ve 48 saat 200 nM FP muamelesi ile azaldığı gözlemlendi. Tüm bu veriler ışığında, FP'nin pankreas kanseri hücrelerinde epiteliyal mediyatörlerin ekspresyonlarını artırdığı, mezenkimal mediyatörlerin ekspresyonlarını azalttığı belirlenmiştir.
Meme kanser modelinde Tocilizumab'in moleküler mekanizmalara etkisi
Meme kanseri, dünya genelinde en yaygın ve agresif malignitelerden biri olup, üçlü negatif meme kanseri (TNBC) kötü prognoz ve sınırlı tedavi seçenekleri ile karakterize edilmektedir. Bu çalışmada, BALB/c farelerde 4T1 TNBC modeli oluşturularak, interlökin-6 reseptör (IL-6R) inhibitörü Tocilizumab ve geleneksel bir kemoterapötik olan Cisplatin'in tek başına ve kombinasyon halinde terapötik etkileri araştırılmıştır. Negatif ve tümör kontrol gruplarının yanı sıra Tocilizumab, Cisplatin ve kombinasyon tedavisi alan deney grupları tasarlanmıştır. Tümör büyümesi dijital kumpas ile seri ölçümlerle izlenmiş, sistemik sağlık durumu ise vücut ağırlığı takibi ile değerlendirilmiştir. Tedavi sonrasında primer tümör dokuları histopatolojik, immünohistokimyasal, ELISA ve qPCR analizleri için toplanmıştır. Sonuçlar, Tocilizumab ve Cisplatin'in birbirini tamamlayıcı ancak farklı mekanizmalarla etkili olduğunu göstermiştir. Tocilizumab, IL-6 sinyal yolunu baskılayarak STAT3 aktivasyonunu azaltmış ve PCNA ekspresyonunu düşürerek belirgin antiproliferatif etki sağlamıştır.. Kombinasyon tedavisi, tümör hacminde anlamlı azalma, metastatik aktivitede düşüş ve PCNA ekspresyonlarında sinerjik modülasyon sağlamıştır. Bu moleküler bulgular histopatolojik bulgular ve sağkalım verileri ile de uyum göstermiştir. Bu çalışma, TNBC'de IL-6/STAT3 sinyal yolunun hedeflenmesinin terapötik önemine ilişkin yeni ve anlamlı bulgular sunmaktadır. Tocilizumab ve Cisplatin'in birlikte uygulanması, antitümör etkinliği artırarak olası bir sinerjik etkileşimi ortaya koymuştur. Elde edilen veriler, IL-6/STAT3 yolak inhibisyonunun umut vadeden bir tedavi yaklaşımı olduğunu desteklemekte ve TNBC tedavisinde yenilikçi kombinasyon stratejilerinin geliştirilmesi için bilimsel bir temel oluşturmaktadır. Anahtar Kelimeler: IL-6/STAT3 Sinyal Yolağı, Kombinasyon Tedavisi, Cisplatin, Tocilizumab, Üçlü Negatif Meme Kanseri (TNBC)
Epigenetik faktörler DNMT3A ve DNMT3B gen ekspresyonlarının erkek infertilitesindeki etkilerinin araştırılması
Küresel bir halk sağlığı sorunu olarak görülen infertilite; düzenli, korunmasız bir cinsel ilişkiden on iki ay sonra klinik gebeliğin sağlanamaması, erkek infertilitesi ise; bir erkek bireyin en az bir yıl korunmasız cinsel ilişkide bulunarak doğurgan bir kadında gebelik oluşturamaması durumudur. Erkek infertilitesi nedenleri olarak kriptorşidizm, varikosel, endokrinolojik bozukluklar, seminal yolların tıkanması/yokluğu, enfeksiyon gibi etkenlerin yanında, genetik değişiklikler de önemli faktörler olarak öne çıkmaktadır. Spermatogenez süreci ve erkek infertilitesi ile ilişkilendirilen genetik faktörler arasında epigenetiğin rolüne odaklanılmış ve birçok araştırma bu konuya yönelmiştir. Epigenetik değişiklikler; bir genin DNA sekansında herhangi bir değişiklik olmaksızın genin ifade edilişini etkileyen bölgesel ve geçici değişikliklerdir. Epigenetik mekanizmalar içerisinde en yaygını DNA metilasyonudur. Genellikle genlerin promotorunda bulunan CpG adalarında meydana gelen metilasyon, genin ekspresyonunun azalmasına neden olmaktadır. DNA metiltransferazlar, bir metil grubunun DNA'ya aktarılmasını katalize eden bir enzim ailesidir. Bu ailenin aktif iki üyesi olan DNMT3A ve DNMT3B gelişimde merkezi bir rol oynarlar ve aktiviteleri spermatogenez için vazgeçilmezdir. Çalışmamızda; normozoospermi ve oligozoospermli infertil erkek bireylerde DNMT3A ve DNMT3B genlerinin hem RNA düzeyinde hem de protein düzeylerindeki değişikliklerinin tespit edilerek erkek infertilitesi üzerine etkilerinin araştırılması amaçlandı. Çalışmaya spermiogram analizleri yapılan 53 erkek (30 normozoozspermi, 12 oligozoospermi, 11 şiddetli oligozoospermi) birey dahil edildi. Bireylerin ejakülat örneklerinden plazma ayrılarak elde edilen sperm hücrelerinden RNA izolasyonları yapıldı. cDNA çevirim sonrası, DNMT3A ve DNMT3B gen ekspresyonları qPCR ile analiz edildi. Oligo ve şiddetli oligozoospermi durumunda DNMT3A gen ekspresyonunda ve ayrıca erkek infertilitesi bakımından hem DNMT3A hem de DNMT3B ekspresyonlarında belirgin azalma olduğu tespit edildi, ancak bu azalış istatistiksel olarak anlamlı bulunmadı. DNMT3A ekspresyonu ve infertilite durumu ise koreleydi (p˂0,05). Deneysel DNMT knockout farelerde, DNMT3B ilişkili infertilite gözlenmezken, DNMT3A ilişkili spermatogenetik arrest ve azospermi görülmektedir. Bulgularımız bu sonuçlarla uyumlu olmakla birlikte daha geniş örneklem grubunda sonuçlarımızın tekrar değerlendirilmesi gereklidir.
Behçet hastalığına özgül otoantikor varlığının taranmasına yönelik yaklaşımların geliştirilmesi
Behçet hastalığı, ilk defa Türk dermatolog Hulusi Behçet tarafından 1937'de, tekrarlayan oral aftöz ülserler, genital ülserler, üveitten oluşan üçlü semptom kompleksi ile karakterize bir hastalık olarak tanımlanmıştır. Behçet hastalığı orta ve uzak doğu toplumlarında sık görülen sistemik bir inflamatuvar hastalıktır. Prevelansı toplumlara göre değişkenlik göstermektedir. Hastalığın etiyolojisi bilinmemektedir. Hastalığın patogenezinde birçok otoantijen önerilmiş olmasına rağmen, hiçbirinin hastalık etiyolojisi ile ilişkili olduğu düşünülen bakteriyel HSP-65 ile ortak bir epitop paylaştığı gösterilememiştir. Tez projesinin temel aldığı çalışmada, nörofilaman medium(NF-M)'a karşı immün reaktif olduğu gösterilen Behçet hastalarına ait serumların bakteriyel HSP-65 ile çapraz reaksiyon gösterdiği saptanmıştır. Önerilen tez kapsamında, sınırlı bir hasta popülasyonunda saptanan otoantikor varlığının, Behçet hastalığına özgüllüğünün araştırılması amacıyla daha geniş bir hasta popülasyonunda taranmasına imkân sağlayacak hassas ve özgüllüğü yüksek peptit temelli bir tarama yöntemi geliştirilmesi amaçlanmaktadır.
Desminin çekirdeğe taşınımının potansiyel mekanizmalarının araştırılması
Daha sonra doldurulacaktır.
Investigation of mechanoregulatory role of desmin protein
İskelet kas dokusunun, çevresel değişikliklere uyum sağlaması gerekmektedir. Bu uyum, protein sentezinin artışıyla sağlanır. Kasın çevresel değişikliklere yanıtını etkileyen faktörler arasında büyüme faktörlerindeki değişiklikler, sitokin seviyeleri, nöral uyarım ve egzersiz/direnç antrenmanı gibi mekanik yüklemeler yer almaktadır. Ayrıca, amino asitler de (AA) adaptif yanıtı arttıran faktörlerdendir. Hücre iskeleti, hücrenin şeklini korur ve yapısal desteği sağlar. Bu özellik, hücrenin dış etkilere karşı direncini arttırır ve hücrenin işlevselliğini sürdürmesine yardımcı olur. Ayrıca, Hücre iskeleti, hücre içinde ve hücreler arasında hareketi sağlar. Hhücrenin göç etmesi, bölünmesi, organellerin yer değiştirmesi gibi süreçlerde önemli bir rol oynar. Hücre iskeleti ayrıca hücre içindeki maddelerin taşınması ve hücre zarının şeklinin değiştirilmesi gibi işlevleri destekler. Hücre iskeletinin bu temel işlevleri, hücrenin yapısal bütünlüğünü koruması ve hareket yeteneğini sağlamasıyla hücrenin yaşamsal işlevlerini destekler. Hücre iskeleti, hücre biyolojisi ve hücrenin işlevi açısından önemli bir role sahiptir. Bu işlevler, hücre iskeletinde bulunan üç temel filament türü aracılığıyla gerçekleştirilir: aktin, mikrotübüller ve ara filamentler (IF). Bu yapılar hücrenin içinde ve dışında çeşitli süreçlerin gerçekleşmesini sağlarlar. IF'lerin ortalama çapı yaklaşık olarak 10 nm'dir ve bu da onları mikrofilamentlerin (7 nm) ve mikrotübüllerin (yaklaşık olarak 25 nm) ortalama çapı arasına yerleştirir. Diğer hücre iskeleti bileşenlerin aksine, IF'ler hücresel hareketlilikte aktif olarak yer almazlar. Bunun yerine, temel rolleri çoğunlukla yapısal olup, hücreleri ve dokuları mekanik kuvvetlere karşı desteklemektir. Mikrofilament ve mikrotübüllerin monomerleri sırasıyla Aktin ve Tubulin iken IF'ler temel yapı taşlarında heterojenlik gösterirler. 50'den fazla IF proteini, yapısal benzerliklerine göre altı gruba ayrılabilir. Epitel hücreleri, her biri yaklaşık olarak 15 farklı proteini içeren ve keratinler olarak bilinen Tip I (asidik) ve Tip II (nötr/bazik) IF'leri ifade ederler. Epitel hücrelerde, her iki tip keratin de birlikte polimerleşme (co-polymerization) yoluyla üretilir. Sert keratinler, saç, tırnak ve boynuzlar gibi özelleşmiş yapıların gelişimine katkıda bulunur. Bu süreçte, farklı tip keratinler bir araya gelirler. Tip III ara filamentler, nöronlarda bulunan ara filamentler olup nöronların yapısal bütünlüğünü korur ve sinir sinyallerinin iletilmesinde rol oynar. Tip IV ara filamentler, nöronların aksiyon potansiyellerinin iletiminde görev alan nörofilamentlerdir. Tip V ara filamentler, bazı özel hücre türlerinde ve dokularda bulunan az bilinen filamentlerdir. Bu tip IF'lerin işlevleri ve özellikleri henüz detaylı bir şekilde açıklanmamıştır. IF'ler, ortak yapısal özelliklere sahiptirler. Tüm IF'lerde amino-terminal baş domaini, merkezi α-helikal rod domaini ve karboksiterminal kuyruk domaini bulunur. Bu proteinlerin lif benzeri yapıları ve merkezi α-helikal rod domainleri IF'lerin dördüncül yapısında dayanıklılık ve esneklik sağlar. Baş ve kuyruk domainlerdeki değişkenlik, farklı ara filament proteinleri arasındaki moleküler ağırlık farkına yol açar. Desmin, 53 kDa molekül ağırlığına sahip tip III IF olup sarkoplazmada Z bandında bulunur. Memelilerde, tek bir DES tarafından kodlanır ve 2q35'te bulunur. DES, 9 ekson ve sekiz introndan oluşur. Kas dokusundaki temel IF olan Desmin'in yanı sıra, kas hücrelerinde Vimentin ve Nestin gibi diğer ara filamentler de bulunabilir. Desmin'in başlıca işlevi, miyofibril Z bandının etrafında bir karkas oluşturmaktır. Bu karkas, tüm kasılmayı düzenleyen mekanizmayı sağlar ve subsarkolemmal hücre iskeletine bağlanarak bir ağ oluşturur. Ayrıca, bu protein, çekirdek ve mitokondri gibi organellerin konumlandırılmasında kritik bir rol oynar. Desmin, çizgili kas hücrelerinin Z diskleri etrafında uzunlamasına bağlantılar oluşturur. İskelet kasında miyotendinous ve nöromüsküler bağlantılarda, kalp kasında ise kardiomyositleri birbirine bağlayan interkale disklerde yer alır. Memelilerde, kalp kası hücrelerinde Desmin miktarı iskelet kası hücrelerinden daha yüksektir (sırasıyla toplam proteinin %2'si ve %0,35'i). Miyogenez farklılaşma sürecinde miyogenik bir belirteç olarak tanınan Desmin, miyogenez sırasında ortaya çıkan en erken proteinlerden biridir. Desmin, farklılaşmış kas hücrelerinde (miyotüplerde) yüksek düzeyde ifade edilirken, çoğalan miyoblastlarda ve satellit hücrelerinde minimal düzeyde bulunur. Desmin ifadesi, embriyonik gelişimin erken aşamalarında, özellikle fare embriyolarının 7.5. gün civarındaki prekardiyak bölgelerinde başlar. Daha sonra, 9. gün civarında miyotomlar ve düz kas hücrelerinde gözlenir. DES'teki hastalık ile ilişkili varyasyonlar, hem iskelet hem de kalp kaslarını etkileyen bir dizi hasara (alternatif olarak desminopatiler olarak adlandırılır) neden olur. Desminopatiler veya Desmin ile ilişkili miyopatiler (DRM) klinik ve genetik olarak çeşitlilik gösteren Miyofibriller Miyopatiler'in (MFM) bir alt türü olarak da bilinir. Farklılık, Desmin için pozitif protein birikimlerinin varlığı ve miyofibrillerde görülen dejeneratif değişikliklerle belirlenir. Ailevi desminopatilerde, kalıtım modeli genellikle otozomal dominant veya otozomal resesif olarak sınıflandırılır. Ancak, birçok vakada, de novo DES mutasyonlarıyla ilişkilendirilen ailevi bir arka plan bulunmamaktadır. Hastalığın başlangıç yaşı ve seyri, kalıtım modeline ve etkilenen protein domainlerine bağlı olarak değişebilir. Desminopati genellikle yaşamın orta dönemlerinde (üçüncü ila dördüncü on yıllarında) ortaya çıkar ve belirtiler MFM1'e göre daha erken yaşlarda görülür. Kalp yetmezliği sıkça rastlanan bir durumdur ve desminopati vakalarında oranları %40 ila %90 arasında değişmektedir. Kasların distrofik durumu genellikle yavaş ilerler. Hastalığın erken evrelerinde, distal kasları daha çok etkilerken, proksimal kaslar ve özellikle alt ekstremiteler, üst ekstremitelere göre daha fazla etkilenir. Proksimal kas distrofisi, ileri evrelerde belirgin hale gelebilir. Distrofi düzeyi, aynı aileye mensup bireyler arasında bile önemli ölçüde değişebilir. c.1289-2A>G mutasyonu, daha önce grubumuz tarafından bildirilen, Desmin'in kuyruk domaininde bulunan homozigot bir splice site mutasyonudur. Bu mutasyon, Desmin'in Lamin B bağlama domainine 16 amino asit eklemiş ve etkilenen bireylerde MFM1 hastalığının gelişimine yol açmıştır. Otozomal resesif kalıtıma sahip Desmin mutasyonları genellikle erken başlangıçlı belirtiler (ortalama beş yaşta başlar) ve ağır miyopati ve kardiyomiyopati ile karakterize bir seyir gösterir. Resesif kalıtıma sahip mutasyonlar sadece birkaç hastada tanımlanmış olmasına rağmen, c.1289-2A>G mutasyonunu taşıyan bireylerde kardiyomiyopati içermeyen geç başlangıçlı semptomlar ortaya çıkmıştır. Bu mutasyon, mutant Desmin'in ifade düzeyinde azalmaya neden olmamıştır. İskelet kası liflerinin hücre iskeleti ağında herhangi bir anormalliğe neden olmaz. Hasta bireylerin kas kesitlerinde yapılan araştırmalarda çekirdek ve mitokondri gibi zara sahip organellerin konumunda anormal değişiklikler bulunmamıştır. Bununla birlikte, sol gastroknemius kasından alınan biyopsi örneklerinde, kas liflerinin boyutunda farklılık ve lif boyunca gözlenen çekirdeklerin yanısıra internal çekirdeklerin varlığı da tespit edilmiş ve distrofik özellikler belirlenmiştir. Hasta hücrelerinde mekanotransdüksiyon hasarı öngörülmüş olsa da, hastalığın kesin nedeni halen bilinmemektedir. Literatürde yaygın olarak görülen desminopati patolojisi bulunmasa da, bu hastalarda Desmin-Lamin B etkileşiminin eksikliğinin hastalığın gelişimine yol açabileceği düşünülmektedir. Desmin ve Lamin B'nin birbirleriyle fiziksel etkileşime girerek çekirdek ve sitoplazma arasında bir iletişim ağı oluşturduğunu gösteren araştırmalar bulunmaktadır. Bu etkileşim, zebra balığı kas dokusunda yapılan eş-immün çöktürme deneyleri ile doğrulanmıştır. Ayrıca, Desmin'in Torpedo marmorata elektrik hücresinin postsinaptik membranında Lamin B ile etkileştiğini tanımlayan başka bir çalışma da mevcuttur. Farklı çalışmalardan elde edilen bulgular, Lamin dışındaki diğer ara filamentlerin çekirdeğe yerleşebileceğini gösteriyor. Bu durumda, hücre iskeleti elemanlarının çekirdeğin transkripsiyon ile ilgili süreçlerini dinamik olarak etkileyebileceği düşünülüyor. Elde ettiğimiz ön veriler, Desminin çekirdekte yerleşmemesinin, kaslarda mekanotransdüksiyon hasarına ve uzun süreli mekanik stres altında kas dejenerasyonuna yol açabileceğini öne sürmektedir. Bu tez çalışmasındaki hipotezimiz, çizgili kas hücrelerinde mekanik gerilimin Desmin proteininin çekirdeğe yerleşimini arttırdığı ve bunun sonucunda aday genlerin ifade seviyelerinde doğrudan veya dolaylı olarak değişikliklere yol açtığı yönünde oluşmuştur. Bu tezin temel amacı ise, Desmin'in mekanik stres koşullarında çekirdekte yerleşiminin anlaşılmasına katkı sağlamak ve Desmin'in regülasyon yolaklarındaki rolünü araştırmaktır. Bu doğrultuda, Desmin'in hücre içindeki konumunu araştırmak ve mekanik gerilimin Desminin hücredeki yerleşimi üzerinde olan etkisini değerlendirmek için immünfloresan boyama gerçekleştirildi. Desmin'i tanıyan antikorun yanı sıra hücre germe deneyleri için pozitif kontrol olarak T-YAP'i, çekirdek belirteci olarak ise DAPI ve Lamin B'yi tanıyan antikorlar kullanılmıştır. Hücre germe deneyinden sonra, Pearson Korelasyon Katsayısı (PCC) kullanarak piksel tabanlı analiz yoluyla iki kanal arasındaki örtüşme derecesi (Desmin/DAPI, Desmin/Lamin B ve Desmin/T-YAP) ve dolayısıyla proteinlerin eş-yerleşim miktarı kantitatif olarak ölçüldü. İmmünofloresan boyama işleminden sonra, farklı gerilim seviyelerine maruz kalan hücre grupları arasındaki eş-yerleşim değerleri istatistiksel olarak analiz edildi. Kontrol grubu ile çeşitli gerilmeye maruz kalan gruplar arasında anlamlı bir PCC değeri artışı gözlendi (p < 0.01). Eş-yerleşim analizi, Desmin'in çekirdek içinde bulunduğunu ve Lamin B ve DAPI gibi çekirdek belirteçleriyle aynı konumda yer aldığını ortaya koydu. Bu durum özellikle, statik gruplara göre gerilime maruz kalan hücrelerde belirgin bir şekilde artış gösterdi. Desmin'in çekirdek yerleşimini doğrulamak için, protein fraksiyonu deneyleri gerçekleştirildi. Bu fraksiyonun kalite kontrolü, çekirdek (Lamin B) ve sitoplazmik (GAPDH) belirteçler kullanılarak değerlendirildi. Ardından, aynı hücresel fraksiyonlar, Desmin'e özgü bir antikorla immünoblot analizine tabi tutuldu. Sonuçlar, Desmin'in hem sitoplazmik hem de çekirdek fraksiyonunda varlığını doğruladı. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, Desmin'in regülatör işlevi, hücresel yerleşimi ve çekirdek-sitoplazma arasındaki taşınımı üzerine odaklanmıştır. Bu çalışmalar Desmin'de iki potansiyel çekirdek yerleşim sinyal dizisi (NLS) ve bir çekirdek dışına taşınım sinyali dizisi (NES) bulunduğunu göstermiştir. Bu sinyal dizilerinin silindiği mutant diziler içeren transfeksiyon çalışmaları, her iki NLS'nin işlevselliğini göstermiş ve Desmin'in çekirdek-sitoplazma arasındaki taşınımındaki potansiyel rolünü güçlendirmiştir. Mekanik stres altında çekirdekteki Desmin miktarında bir artış gözlenmesine rağmen, Desmin'in çekirdek içindeki özgün rolleri henüz netleştirilmemiştir. Çekirdekte bulunan Desmin'in regülatör rollerinin aydınlatılması öncelikli hedef olarak belirlendiği için, araştırmalar standart fizyolojik koşullar altında sadece statik grupta yürütüldü. Genellikle, mekanik uyarıcılar proteinlerin regülatör işlevlerini tetikleyici olmaktan ziyade yanıtı arttırıcı ve hızlandırıcı bir etkiye sahiptirler. Benzer senaryolar diğer mekanosensitif proteinlerde de gözlenmiştir. Ancak, gelecekteki çalışmalar bu koşulları dikkate almalı, uygun bir deneysel çerçeve oluşturmalı ve farklı fizyolojik koşulları ayrıntılı bir şekilde incelemelidir. Bu bulgular, mekanik gerilim koşulları altında Desmin ve çekirdek bileşenleri arasındaki potansiyel mekanistik etkileşimler hakkında değerli ipuçları sunmaktadır. Desmin'in çekirdeğe taşınımının önemi, özellikle Desmin'in eksik olduğu embriyonik kök hücreler üzerinde yapılan in vitro çalışmalarla vurgulanmıştır. Bu çalışmalar, Desmin'in düz kasın gelişimi üzerindeki kritik rolünü ve miyogenez sırasında çekirdek işlevleri üzerindeki etkisini ortaya koymaktadır. Desmin ifadesinin RNAi aracılığıyla baskılanması, kas işlevine özgü genlerin ifadesinin bozulması gibi belirgin sonuçlara yol açmaktadır. Desmin'i hedef alan antisens çalışmaları, RNA taşınımındaki rolünü ve MyoD ve myogenin gibi farklılaşma faktörlerinin transaktivasyonunu etkileyebileceğini öne sürmektedir. Ancak, Desmin gibi bir hücre iskeleti proteininin transkripsiyon faktörlerinin denge durum (steady-state) seviyelerini nasıl etkilediği hala bilinmemektedir. Gen ifadesinin regülasyonu; proliferasyon, farklılaşma, hücre ölümü, hücre büyümesinin durması ve stres yanıtı gibi çeşitli hücresel olaylar sırasında; RNA transkripsiyonu, transkripsiyon sonrası RNA işlenmesi ve modifikasyonları, RNA taşınımı, translasyon ve mRNA/protein stabilitesi gibi farklı aşamalarda gerçekleşir. Desmin hangi regülasyon adımında rol almaktadır? Gen ifadesinin düzenlenmesindeki tüm adımları ikiye ayırabiliriz. Doğrudan DNA'ya bağlanarak ve dolaylı olarak gen ifadesini düzenleyerek. Bu nedenle, çekirdekte bulunan Desmin'in kromatinle doğrudan etkileşimini araştırmak için ChIP deneyi gerçekleştirildi. Aday olarak seçilen genlerin (MyoD, Nkx2.5 ve MYOG) 3'-UTR bölgelerindeki Desmin varlığı, IgG ile ve antikor olmadan yapılan IP'ler aracılığıyla değerlendirildi. Kat değişim yöntemini kullanarak hesaplanan kat değişim değerlerini karşılaştırdığımızda, ilgili aday genlerin 3'-UTR bölgelerinde Desmin'in doğrudan kromatine bağlanması tespit edilemedi. Desmin'in potansiyel çekirdek işlevini araştırmak için, zebra balığı verilerine ve literatürdeki mevcut RNA-Seq/proteomik verileri kullanarak işlevsel anotasyon analizleri gerçekleştirildi. Bu çalışma kapsamında özellikle, transkriptom ve proteomun Des KO fareler ile yabanıl tip fareler arasında karşılaştırıldı. Hem transkriptomik hem de proteomik veriler için moleküler işlev üzerine G.O. analizi yapıldığında, özellikle ribozom veya mRNA bağlanması ile ilişkilendirilen istatistiksel olarak anlamlı (P < 0.001) 10 terim belirlendi. Desmin'in regülatör rolü ile ilişkilendirilen 12 terim arasından yalnızca iki terimin Desmin'in doğrudan DNA'ya bağlanarak gen ifadesini etkileyebileceği istatistiksel olarak anlamlı bulundu (P < 0.01); bu terimler tek zincirli DNA bağlanması ve genel transkripsiyon başlatma faktörü bağlanması ile ilişkilendirilmiştir. Bunun yanı sıra, daha önceki araştırmamızda zebra balığı kas dokusunda gerçekleştirilen Desmin IP deneylerinden ve ardından yapılan kütle spektrometrisi analizi ile elde edilen proteomik veriler üzerinde G.O. analizi gerçekleştirildi. İlginç bir şekilde, fare ve zebra balığı örneklerinde yürütülen G.O. analizlerinde Desmin'in regülatör rolü ile ilişkilendirilen dört terim her iki model organizmada da ortak olarak tespit edildi. Sonuç olarak elde edilen veriler, Desmin'in çekirdekteki potansiyel rolünün özellikle mRNA ve ribozom etkileşimleri üzerinden olabileceğini ortaya çıkardı. Desmin'in mRNA üzerinden gen ifadesini nasıl etkilediğini araştırmak amacıyla, hedef transkriptlerin mRNA stabilitesi ölçüldü. Hücreler içinde mRNA stabilitesini dolaylı olarak değerlendirmenin bir yöntemi, transkripsiyonu inhibe ettikten sonra mRNA yarı ömrünü analiz etmeyi içerir. Bu amaçla, transkripsiyonun inhibe edilmesi için act-D kullanıldı. Hedef genlerin mRNA yarı ömürlerini değerlendirmek için Desmin'in siRNA ile susturulduğu ve kontrol gruplarının kullanıldığı deneyler yapıldı. Transfeksiyonun 72. saatinde transkripsiyonu inhibe etmek için kontrol ve siRNA ile transfekte edilen gruplara 1.7 μM Act-D eklendi. Belirtilen zamanlarda total RNA izole edildi ve hedef transkriptlerin miktarı qRT-PCR ile ölçülerek mRNA yarı ömürleri hesaplandı. Sonuçlar, Desmin'in baskılandığı grupta hem MyoD (39.85'ten 20.62 dakikaya) hem de MYOG (59.65'ten 29.44 dakikaya) için yarı ömürde bir azalma tespit edildi. Hedef transkriptlerin translasyonu üzerinde Act-D'nin etkisini değerlendirmek için qRT-PCR için kullanılan deneysel kurulumu tekrarlandı ve total RNA yerine total protein izole edildi. Ardından gerçekleştirilen Western blot analizi, Desmin'in susturulduğu örneklerde aday proteinlerin translasyon süreci üzerinde herhangi bir inhibisyon etkisinin olmadığını gösterdi. Bu bulgular, Desmin'in etkisinin transkripsiyon veya translasyon süreçlerine doğrudan katılımdan ziyade, mRNA sentezinden sonra meydana gelen süreçlerde daha belirgin olduğu hipotezini desteklemektedir. Translasyon sonrası modifikasyonlar, protein yıkım hızları ve diğer regülatör mekanizmaların RNA stabilitesinden bağımsız olarak protein seviyeleri üzerinde etkili olduğuna dikkat çekilmesi önemlidir. Bununla birlikte, Desmin'in spesifik transkriptlerin translasyon süreçleri üzerindeki olası etkilerinin daha kapsamlı bir şekilde araştırılması gerekmektedir. Bu tez çalışması kapsamında aday olarak seçilen MyoD ve MYOG, miyojenik regülatör faktörler olarak tanımlanır ve miyoblastların proliferasyonundan terminal farklılaşmasına geçiş sürecini ve miyotüplerin birleşmesini düzenleyen kritik transkripsiyon faktörleridir. Bu faktörler, kas öncül hücrelerinin farklılaşma süreci boyunca ilerlemesini kontrol ederek, miyojenik programın başlatılmasından hücrelerin füzyonuna kadar olan evreleri düzenlerler. Myogenin KO farelerde miyoblast oluşumundaki eksiklikler, işlevsel iskelet kasının oluşmamasına ve bu nedenle ciddi bir fenotipe sebep olmaktadır. Bu durum, myogenin'in miyojenik farklılaşmanın ileri aşamalarındaki kritik rolünü teyit etmektedir. Diğer yandan, bu KO fareler, neredeyse normal seviyelerde MyoD ifade ediyor olmalarına rağmen, çok çekirdekli hücre oluşumlarında ve çekirdek yoğunluğunda belirgin bir azalma göstermektedir ki bu da kas kütlesinde kayda değer bir düşüşe neden olmaktadır. Ancak, bu hücrelerde miyojenik farklılaşma belirteçlerinin, MyHC ve Aktin de dahil olmak üzere, eksikliği gözlenmektedir. Bu bulgular, myogenin'in farklılaşma sürecindeki hayati önemini vurgulamaktadır. Bu kritik farklılaşma regülatör genlerin mRNA yarı ömürlerindeki artışlar, C2C12 hücrelerinin farklılaşmasının başlangıç aşamasını belirgin bir şekilde hızlandırmaktadır. Bu bilgiler doğrultusunda Desmin'in susturulduğunda ve MyoD ve MYG'un stabilitesindeki değişikliklerin kasların farklılaşma üzerindeki morfolojik etkileri incelendi. Desmin'in susturulduğu hücrelerin miyojenik potansiyelini değerlendirmek için öncelikle transfeksiyonun yapıldığı hücrelerde Desmin proteininin ifade örüntüsü incelendi. Sonuçlar, farklılaşma sonrası beşinci güne kadar Desmin proteininin ifade düzeyinin bazal seviyelerde kaldığını gösterdi. Ancak, yedinci gün Desmin ifadesinde bir artış gözlendi. Hücrelerin canlılığı ise hiçbir grupta önemli ölçüde değişmedi. Farklılaşmanın beşinci gününde, çok çekirdekli MyHC pozitif miyotüplerin miyojenik potansiyelinin değerlendirilmesi için altı parametre dikkate alındı. Myotüp oluşumunun kapsamlı bir değerlendirmesi için, susturulan hücreler ve kontrol hücreleri arasında farklılaşma ve füzyon oranının yanı sıra dallanma noktalarının sayısı, miyotüp alan yüzdesi, ortalama miyotüp çapı ve çekirdeklerin oluşturduğu küme sayısı gibi altı parametre nicel bir analizle karşılaştırıldı. Sonuçlar, farklılaşmanın başlatılmasından beş gün sonra Desmin'in susturulduğu hücrelerde bu parametrelerde kontrol grubuna göre önemli bir azalma olduğunu gösterdi. Elde edilen veriler, MyHC ifade eden hücre sayısının transfekte hücrelerde önemli bir azalma göstermemesine rağmen, miyojenik farklılaşmada, özellikle miyotüp olgunlaşma aşamasında, füzyon sürecinin hücrelerin ikili çekirdek pozisyonunda özellikle duraksadığını göstermektedir. Elde edilen bulgular, Desmin'in çekirdekte yerleşim göstermeyen MFM1 hastalarından elde edilen hücrelerde, Desminin susturulduğu hücrelerde gözlenen farklılaşma bozukluğu ile benzer sonuçlara yol açmıştır. Desmin ifadesinin %80 oranında başarılı bir şekilde baskılanmasına rağmen, geriye kalan %20'lik oran, normal miyogenezin sürdürülmesi için yetersiz kalmıştır. Ancak, miyojenik potansiyelin azalması ve farklılaşmış hücrelerin morfolojisindeki değişimler, yalnızca miyogenezin temel regülatörlerindeki mutasyonlarla sınırlı olmayıp, aynı zamanda çeşitli kas distrofilerinde kritik bir faktör olarak kabul edilen hücre iskeleti bileşenlerindeki mutasyonlardan da etkilenebilir. Miyogenezin temel regülatörlerinin RNA stabilitesindeki azalma ve hasarlı miyojenik farklılaşma sürecinin ortaya çıkması, mekanik uyarıcıların olmadığı durumlarda bile Desmin'in regülatör rolünün varlığına işaret etmektedir. Mekanosensitif proteinler doğrudan mekanik kuvvetleri algılamak ve hücresel yanıtları başlatmak için tasarlanmış olmalarına rağmen (mekanoregülatör işlev), bunların çoğu, mekanik uyarıcılar olmaksızın da biyokimyasal sinyaller tarafından aktifleştirilebilir. Örnek olarak, fokal adhezyon kinazı (FAK) olarak bilinen bir protein verilebilir. FAK, hücrenin adezyon, göç, proliferasyon ve hayatta kalmasını düzenleyen sinyal iletim yolaklarında rol alan bir proteindir. FAK'ın fokal adezyonları üzerinde etki gösteren mekanik kuvvetler tarafından aktifleştirildiği bilinmesine rağmen, aynı zamanda mekanik uyarıcılardan bağımsız olarak biyokimyasal sinyaller tarafından da aktifleşebilir. Örneğin, epidermal büyüme faktörü (EGF) gibi büyüme faktörleri, FAK'ı tirozin kinaz sinyal iletim yolları aracılığıyla aktifleştirerek hücresel yanıtlara yol açabilir. Bu nedenle, FAK, doğrudan mekanik uyarım olmaksızın bile hücresel süreçleri regüle edebilir. Benzer şekilde, bazı mekanosensitif proteinler, hücre içi sinyalleşmede rol oynar ve farklı uyarıcılara yanıt olarak tetiklenebilirler. Bir örnek, mekanosensitif proteinler tarafından hücre içi kalsiyum sinyalinin regülasyonudur. Bu proteinler, hücre zarındaki mekanosensitif kanallar aracılığıyla hücre dışı ortamdan mekanik stresi algılayabilir ve buna yanıt olarak hücreye kalsiyum iyonlarının akışını tetikleyebilir. Ancak, bu proteinler aynı zamanda hücre içi sinyalleşme moleküllerinin aktivasyonunu da düzenleyebilirler. Bu nedenle, mekanik uyarıcılar olmamasına rağmen, bu proteinler hücresel sinyal iletimine katkıda bulunabilirler. Sonuç olarak, bu tez, iskelet kası hücrelerinde Desmin'in çok yönlü rolüne dair değerli veriler sunmaktadır. Elde edilen sonuçlar, Desmin'in iskelet kası üzerindeki etkisini kontrol eden karmaşık moleküler mekanizmaları ortaya çıkarmak için gelecekteki araştırmalara temel oluşturur ve kas ile ilgili hasarlara yönelik terapötik çalışmalara zemin oluşturur. Ancak Desmin'in bir ara filament proteini olarak monomer, dimer ve tetramer şeklinde farklı aşamalardan geçerek sonunda filamentler oluşturması göz önünde bulundurulmalı ve çekirdekte bulunan Desmin'in hangi aşamada olduğu araştırılması gereken konular arasında yer alır. Çekirdekte bulunan Desmin'in yapısını incelemek, homodimer oluşturup oluşturmadığını veya başka proteinlerle heterodimerik bir durumda olup olmadığını belirlemek son derece önemlidir. Bu bulgu, yalnızca Desmin'in çekirdeğe taşınımı altında yatan mekanizmaları değil, aynı zamanda Desmin'in çekirdek içinde farklı rollerini de ortaya çıkarabilir. Bu roller, RNA veya proteinler için bir taşıyıcı olarak hizmet etmekten, bir sinyal kaskadının bir parçası olmaya veya çekirdek içinde tamamen yapısal bir rol üstlenmeye kadar çeşitli olabilir. Bunun yanında dikkate alınması gereken bir diğer konu, farklı fizyolojik koşullar altında, örneğin mekanik stres altında, ChIP-Seq aracılığıyla daha detaylı bir araştırmanın yapılmasıdır. Bu yöntem, DNA ile ilişkili proteinlerin etkileşim bölgelerinin belirlenme şansını artırabilir. Bu yöntemle, Desmin'in global bağlanma bölgeleri kapsamlı bir şekilde haritalanabilir, böylece farklı hücresel durumlarında söz konusu etkileşimleri hakkında kapsamlı bir fikir sağlayabilir. Ayrıca, Desmin'in transkripsiyon faktörlerinin denge durumlarını nasıl etkilediği konusundaki kesin mekanizma henüz spekülatif niteliktedir. Gelecek çalışmalar, Desmin'in mRNA ile ilişkisini dikkate almalı ve gen ifadesini düzenleyen karmaşık ağlardaki rolünün daha geniş bağlamını araştırmalıdır. Miyojenik farklılaşma üzerinde Desmin'in regülatör etkisinin moleküler mekanizmaları ve sinyal yolaklarını aydınlatmak için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır. Özellikle, miyogenezde rol oynayan önemli regülatör proteinlerle Desmin arasındaki etkileşimi araştırmak, iskelet kası gelişimini düzenleyen karmaşık moleküler olaylar hakkında önemli bilgi sağlayabilir. Ayrıca, Desmin'in mekanik stres veya büyüme faktörleri gibi dış uyarıcılara karşı oluşan hücresel yanıtların düzenlenmesindeki rolünü araştırmak, regülatör işlevi ile ilişkili olan yeni yolakları ortaya çıkarabilir. Dahası, Desmin'in çekirdek bileşenleriyle etkileşim dinamiklerini, özellikle transkripsiyon faktörleri ve kromatin modifiye edici enzimlerle olan etkileşimlerini incelemek, miyojenik farklılaşma sırasında transkripsiyonel regülasyondaki katkısını aydınlatabilir. Desmin'in ifade olmadığı durumlarda farklı fizyolojik koşullar altında ChIP-Seq ve RNA dizileme gibi ileri tekniklerden elde edilen verilerin entegrasyonu, iskelet kası hücrelerinde Desmin'in regülatör ağı hakkında kapsamlı bilgi sunabilir. Genel olarak, Desmin'in moleküler etkileşimlerinin ve sinyal kaskatlarının daha derinlemesine incelenmesi, miyojenik farklılaşmadaki kesin rolünün açığa çıkarılması ve kas ile ilgili hasarlar için hedefe yönelik terapötik stratejilerin geliştirilmesini vaat eder. Anahtar kelimeler: Desmin, çekirdek translokasyonu, RNA stabilitesi, miyojenik
Mitokondri hasarı ile ilişkili nöromüsküler hastalıklarda mitokondriyal protein import mekanizmasının araştırılması
Mitokondrilerin işlevlerini doğru olarak yerine getirebilmeleri için, gDNA tarafından kodlanan ve sitozoldeki serbest ribozomlarda sentezlenen mitokondriyal proteinlerin organele taşınımının hatasız gerçekleşmesi gerekmektedir. Anormal mitokondri morfolojisinin, membran potansiyeli ve ATP üretimi azalışının, ROS artışının mitokondriyal protein importunu etkilediği gösterilmiştir. Bunun yanı sıra, nadir nöromüsküler hastalıklarda gözlenen sekonder mitokondri hasarının düzenlenmesinde rol alan ortak miRNA'ların olası hedef genlerinin mitokondriyal protein importu ile ilişkili olduğu saptanmıştır. Bu amaçla tez çalışmasında DMD, Megakoniyal KMD ve Ullrich KMD etiyopatogenezinde ortak ve sekonder bir bulgu olarak iskelet kasında gözlenen mitokondri hasarının mitokondriyal protein import mekanizması ile ilişkisi araştırılmıştır. İlk aşamada; mitokondriyal sinyal dizisi içeren pcDNA3/Mito-GFP plazmidi kontrol ve hasta gruplarına ait primer miyoblastlarına transfekte edilmiş ve tüm hastalarda MitoGFP-TOM20 eş yerleşiminde istatistiksel olarak anlamlı şekilde azalma gözlenmiştir. Sekonder mitokondri hasarı ile direkt ilişkilendirdiğimiz miR-382-5p, pcDNA3/mito-GFP ile birlikte C2C12 hücrelerine transfekte edildiğinde, MitoGFP-TOM20 eş yerleşiminde kontrole kıyasla anlamlı şekilde azalma saptanmıştır. İkinci aşamada; primer miyoblastlardan mitokondri izolasyonu sonrasında, LC-MS/MS ile proteomik analizler gerçekleştirilmiştir. Aday proteinler arasında, ATP/ADP transporter olarak görev yapan SLC25A4'ün total hücrede RNA ve protein seviyesinde ifadesinin değişmediği, ancak mitokondriyal fraksiyondaki miktarının tüm hastalarda azaldığı qRT-PCR ve Western Blot ile gösterilmiştir. Hastalara ait primer miyoblastlarda SLC25A4'ün mitokondrilerde yerleşiminin azaldığı SLC25A4-TOM20 eş immünfloresan boyaması ile doğrulanmıştır. Tez çalışması ile, patogenezinde sekonder mitokondri hasarının görüldüğü nadir nöromüsküler hastalıklarda mitokondriyal import mekanizmasının potansiyel rolü aydınlatılmış, organel hasarının önlenmesi/geriye döndürülmesi amacıyla yeni ve farklı hastalık grupları için ortak tedavi hedefleri tanımlanabilmesine olanak sağlanmıştır.
Yenilikçi bir SMAD bildirici yaklaşımı geliştirilmesi
Dönüştürücü Büyüme Faktörü-β (Transforming growth factor-𝛽/ TGF-β) yara iyileşmesi başta olmak üzere hücre farklılaşması, apoptozis, immün cevabın düzenlenmesi gibi birçok fizyolojik süreçte düzenleyici role sahip olan bir sinyal molekülüdür. İnaktif yapıda sentezlenen TGF-β, yapısında bulunan Gizli TGF-β Bağlayıcı Protein (Latent TGF-β Binding Protein / LTBP) aracılığıyla hücre dışı matriks (Extracellular matrix / ECM) proteinleriyle kovalent bağlar kurarak ECM'de inaktif bir şekilde tutulur. TGF-β çeşitli uyaranlar tarafından uyarılıp aktifleştikten sonra hücre yüzeyinde bulunan reseptör kompleksine bağlanarak sinyal yolağını uyarır. Aktifleşme sürecinin kontrolsüz bir şekilde süreklilik kazanması, ECM elemanlarının geri dönüşümsüz bir şekilde birikmesiyle sonuçlanan "fibrozis" ile ilişkilidir. Ayrıca bu yolak kanser, otoimmün hastalıklar ve ateroskleroz patolojisinde de rol almaktadır. Bu nedenle TGF-β sinyal yolağının, özellikle de molekülün hücrede transkripsiyonu düzenleyen bir yanıtı tetikleyip tetiklemediğinin takip edilebilmesi bu yolağı hedefleyen yeni tedavi yöntemlerinin geliştirilebilmesi için önemlidir. Bu tez çalışması kapsamında, TGF-β sinyalinin in vitro takibini sağlamak için Salgılanan Alkalen Fosfataz (Secreted Alkaline Phosphatase / SEAP) ve Yeşil Floresan Protein'lerinden (Green Fluorescent Protein /GFP) oluşan bildirici nitelikte bir füzyon proteini geliştirilmiştir. TGF-β etkisi ile bu yapının ifadesini sağlamak amacıyla TGF-β'ya özgü transkripsiyon cevabını oluşturan SMAD (Suppressor of Mothers Against Decapentaplegic) proteinlerinin bağlanma dizisi kullanılmış, yenilikçi bir dual bildirici vektör sistemi geliştirilmesi planlanmıştır. Yapılan çalışmalar sonucunda geliştirilen bildirici vektörün aktarıldığı hücrelerde TGF-β uygulanmayan kontrol grubuna kıyasla TGF-β uygulanan grupta akış sitometri analizi ile artan GFP sinyali gösterilmiştir. Bunun yanı sıra GFP sinyalinin TGF-β konsantrasyonuna bağıntılı ölçüde artışı gözlenmiştir. Çalışma sonucunda, elde edilen bildirici vektör yapısının beklenen işlevsel SEAP aktivitesini sergilemediği gözlemlenmiştir. Bu doğrultuda SEAP işlevselliği için optimizasyon çalışmalarının yapılmasına ihtiyaç vardır.
Kistik fibrozis hastalığında belirlenen aday miRNA'ların hasta nazal ve serum örneklerinde analizi
Kistik fibrozis transmembran regülatör (CFTR) genindeki mutasyonların sebep olduğu kistik fibrozis (KF), otozomal resesif kalıtılan ve yaygın görülen genetik bir hastalıktır. Bir klor kanalı olan CFTR proteini, cAMP ve protein kinaz A'ya bağımlı çalışmaktadır. Epitel yüzeyindeki sıvı homeostazisini sağlayan CFTR proteini, diğer klor kanallarının ve epitel sodyum kanallarının düzenlenmesinden sorumludur. Günümüze kadar yapılan çalışmalarda CFTR geninde 2100'den fazla mutasyon olduğu saptanmıştır. CFTR proteininin fonksiyonuna bağlı olarak sınıflandırılan mutasyonlar, CFTR proteininin sentezi, katlanması, taşınması, yerleşmesi ve doğru fonksiyon göstermesi gibi aşamalarına etki ederek hastalık ciddiyetinde önemli rol oynamaktadır. CFTR mutasyonlarının tanımlanması, hastalığın teşhis edilmesini sağlamakta ancak hastalık ciddiyeti, fenotipi ve ilerleyişi hakkında bilgi vermemektedir. Son yıllarda yapılan çalışmalar ile birlikte immün ve inflamatuar cevap, protein katlanması, iyon taşınımı ve oksidatif stres ile ilişkili genlerin ifadelerinin yanı sıra miRNA ifadelerinde gözlenen farklılıkların da hastalık patogenezini etkilediğine dair bulgular artmıştır. Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı ve Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Anabilim Dalı Göğüs Hastalıkları Ünitesi iş birliği ile gerçekleştirilen ön çalışmalar sonucunda, aynı mutasyonu taşımasına rağmen ağır ve hafif klinik ciddiyete sahip kardeşler saptanmıştır. F508del mutasyonuna sahip ağır (n=2) ve hafif (n=2) seyir gösteren hasta kardeşlerden nazal sürüntü örnekleri alınmıştır. Nazal epitel hücreler kullanılarak elde edilen RNA'lar ile miRNA Array yöntemi gerçekleştirilmiş ve elde edilen ham veriler Transcriptome Analysis Console (TAC) programı ile analiz edilmiştir. Yapılan analiz sonrası ifadesi 2 kat ve üzeri artan ya da 2 kat üzeri azalan ortak, miR-449c-5p, miR-34c-3p, miR-34c-5p ve miR-4793-3p olmak üzere 4 miRNA tanımlanmıştır. Önerilen tez çalışmasında amacımız; grubumuzun ön veri olarak elde ettiği 4 miRNA'nın F508del mutasyonuna sahip ağır ve hafif seyirli KF hastalarının serum ve nazal sürüntü örneklerinde valide edilmesi, ekspresyonlarının karşılaştırılması, valide edilen miRNA'ların hedef genlerinin belirlenmesi ve hedef genler ile ilişkili yolakların tanımlanmasıdır. Elde edilen veriler KF'de hastalık seyrinin erken dönemde belirlenmesine kolaylık sağlayacak prognostik miRNA'ların belirlenebilmesini sağlayacak ve KF patogenezi ile ilişkili olan yeni yolaklar aydınlatılabilecektir.
Kistik fibrozis hastalarında mitokondriyal DNA mutasyonları ile aminoglikozit ototoksisitesi arasındaki ilişkinin araştırılması
Kistik fibrozis beyaz ırkta görülen, CFTR genindeki mutasyonların sebep olduğu otozomal resesif kalıtılan genetik bir hastalıktır. Kistik fibrozis tedavisinde kullanılan aminoglikozitler, hastalarda yan etki olarak işitme kaybına neden olmaktadır. Mitokondriyal DNA'da MTRNR1 genindeki m.1555A>G, m.1494C>T ve m.1095T>C mutasyonlarının aminoglikozit ilişkili işitme kaybına neden olduğu bilinmektedir. Bu sebeple hastalara aminoglikozit tedavisi uygulanmadan önce hastaların mutasyonlar açısından taranması kistik fibrozis hastalarında büyük önem taşımaktadır. Bu tez çalışmasındaki amacımız, kistik fibrozis hastalarında MTRNR1 geninde aminoglikozit ototoksisitesi ile ilişkili mutasyonların sıklığını araştırmaktır. Çalışmamıza aminoglikozit kullanım öyküsü olan/olmayan retrospektif olarak seçilen 119 hasta dahil edildi. Hastalar otorinolaringolojik bulgular, odyolojik bulgular ve aminoglikozit kullanımı gibi klinik özelliklere göre sınıflandırıldı. Mutasyonlar PCR-RFLP yöntemi kullanılarak analiz edildi. 119 hastanın 97'si aminoglikozit kullanmış olup; 22 hasta için aminoglikozit kullanım öyküsü bulunmamaktadır. Aminoglikozit kullanan 13 hastada yüksek frekanslı sensörinöral işitme kaybı tespit edilmiştir. 119 hasta mutasyonlar açısından taranmış ve mutasyon saptanmamıştır. Aminoglikozit ototoksisitesine rağmen MTRNR1 gen mutasyon taramaları ülkemizde rutin olarak yapılmamaktadır, aminoglikozit tedavisinden önce kistik fibrozis hastalarında mutasyon taramalarının hasta tanı ve izleme rehberlerinde yer alması planlanmaktadır. Klinik parametrelerin birlikte değerlendirilmesi ile kistik fibrozis hastalarında kişiye özgü tedavi yaklaşımı geliştirilmiş olacaktır. Anahtar Kelimeler: Kistik Fibrozis, CFTR geni, Aminoglikozitler, Ototoksisite, MTRNR1
Alzheimer hastalığı'nın beyin anjiyotensin reseptörleri ile ilişkisi ve anjiyotensin reseptör blokörlerinin bu ilişkiye etkisi
Alzheimer Hastalığı sıklığı giderek artan ve bilişsel işlevlerde azalma ile seyreden etiyolojisi henüz netleşmemiş nörodejeneratif bir hastalıktır. Günümüzde henüz kür sağlayacak bir tedavisi yoktur. Alzheimer Hastalığı (AH) insidansının Anjiyotensin tip 1 reseptör blokör (ARB) kullananlarda daha düşük olduğu çeşitli çalışmalarda gösterildikten sonra, beyin renin-anjiyotensin sistemi (RAS) ve Alzheimer Hastalığı ilişkisi önem kazanmıştır. Beyin renin anjiyotensin sistemi esas olarak üç reseptör alt tipi aracılığıyla hareket eder: AT1R, AT2R ve AT4R. AT1R, inflamasyonu ve oksidatif stresi destekler. AT2R nitrik oksidi arttırır. AT4R, dopamin ve asetilkolin salınımı için önemlidir ve hafıza konsolidasyonuna aracılık ettiği gösterilmiştir. Bu tezde, kognitif olarak normal ve AH olan bireylerin postmortem frontal-korteks beyin örnekleri kullanılarak AH ile ilişkili beyin RAS farklılıklarının incelenmesi, bu farklılıkların beyin oksidatif stresi, inflamasyon, ayrıca amiloid-beta ve tangle patolojileri ile ilişkisi ve son olarak ARB'lerin bu ilişkiye etkisinin değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Beyin RAS reseptörlerinin gen ve protein ifadeleri, oksidatif stres belirteci olarak protein karbonil seviyeleri ve inflamasyon belirteci olarak IL-6, TNF-α, IFN-γ ve IL-1β seviyeleri ölçülmüştür. Sonuç olarak, Alzheimer hastalarının beyinlerinde AT1R protein seviyeleri daha yüksek bulunmuştur. Beyin AT1R seviyesinin, daha yüksek oksidatif stres ve amiloid-beta skorları ile korele olduğu saptanmıştır. Ayrıca, ARB kullanımı, kognitif olarak normal katılımcılarda daha yüksek AT4R protein seviyeleri ve daha düşük oksidatif stres ve amiloid-beta skorları ile ilişkilendirilmiştir. ARB'lerle tedavi edilen Alzheimer hastalarının beyinlerinde oksidatif stres, inflamasyon veya tangle ve amiloid-beta yükünde anlamlı bir fark gözlenmemiştir. Bu çalışma, AH ile ilişkili beyin patolojilerinde beyin RAS'ın rolü hakkında literatüre katkı sağlarken, kognitif bozukluğu olmayan bireylerde ARB'lerin olası koruyucu etkilerine AT4R'ün aracılık ediyor olabileceğini göstermiştir.
Periodontitise yatkınlıkta rol oynadığı düşünülen RSPO4 genine ait putatif bir düzenleyici bölgenin gen ifadesini hızlandırıcı etkisinin gösterilmesi
Periodontitis genetik, çevresel ve hayat tarzı faktörlerinin bir arada rol oynadığı, dişe özgü destek yapıların yıkımıyla karakterize kompleks hastalıklardan birisidir. Patogenezi ve yatkınlığı ile ilişkili genetik mekanizmalar henüz tam olarak aydınlatılamamıştır. RSPO4 özellikle tırnak ve ekstremite gelişimi ile ilişkili mekanizmalarda rolünün yanı sıra kemik oluşumu ve olgun iskelette görev alan bir gendir. Porphyromonas gingivalis (majör periodontopatojen) kaynaklı oral enfeksiyona direnç gösteren spesifik fare hatlarında RNA dizi analizi sonucu RSPO4 ifadesinin arttığını gösteren bulgular RSPO4 gen regülasyonunun periodontal yıkıma dirençte rol oynadığını düşündürmüştür. Genom boyu ilişkilendirme çalışmaları, ENCODE verileri ve çeşitli hücre tiplerinde ChIP-dizileme analizleri; RSPO4'ün 3'UTR bölgesinde yer alan, transkripsiyon faktörü bağlanma bölgeleri olan, H3K4Me1 ve H3K27Ac histon modifikasyonlarına ve DNAz I aşırı duyarlılığına sahip, güçlü linkage disequilibrium değeri gösteren tek nükleotit polimorfizmleri görülen bir haplotip bloğun aşağı yönünde gen ifadesini hızlandırıcı etkisi olduğunu düşündürmüştür. Bu bilgiler ışığında ilgili kromozom bölgesinin periodontitis etiyolojisinde işlevi olan düzenleyici elemanlar içerdiği düşünülmüştür. Araştırmanın amacı bu putatif düzenleyici elemanların gen ifadesini hızlandırdığını doğrulamaktır. Bu amaçla putatif gen ifadesini düzenleyen bölge amplifiye edilip DNA dizi analizi ile doğrulanmış, firefly luciferase reporter vektörü (pgl4.24) içerisine klonlanıp ardından kompetan bakteriler içerisinde yüksek düzeyde ifadesi sağlandıktan sonra RSPO4'ün güçlü bir şekilde ifade edildiği SaOs-2 hücrelerine transfeksiyonu gerçekleştirilmiş ve putatif dizinin promotör aktivitesine olan etkisi lusiferaz assay ile incelenmiştir. İnceleme sonucunda dizinin promotör aktivitesini azalttığı belirlenmiştir. Mevcut sonuçlar incelenen bölgenin gen ifadesini azaltıcı (repressör) bir bölge olduğunu ortaya koymuştur.
SMN eksikliğinde RHO-ilişkili protein kinazın (Rock) mikrotübül stabilitesi üzerine etkisinin araştırılması
Spinal müsküler atrofi (SMA) nadir görülen ve otozomal resesif kalıtım modeli gösteren genetik hastalıklardan biridir. SMA, omurilikteki alfa (α) motor nöronların kaybı ve ilerleyici kas atrofisi göstermesi nedeniyle nörodejeneratif ve nöromüsküler hastalıklar gruplarında yer almaktadır. SMA hastalığına Survival of motor neuron 1 (SMN1) genindeki mutasyonlar neden olmaktadır. Bu genin ürünü olan survival motor neuron (SMN) proteini tam uzunlukta sentezlenememektedir. SMN proteini eksikliğinde mikrotübüller üzerine yapılan çalışmalarda gözlenen değişimlerin moleküler mekanizması tam olarak açıklanmamıştır. Anabilim Dalı'mızda daha önce gerçekleştirilen çalışmalarda SMN eksikliğinde mikrotübül stabilitesinde azalma saptanmıştır. Mikrotübül stabilitesini düzenleyici sinyal yolaklarından biri RhoA/ROCK yolağı olup, SMA modellerinde ROCK aktivitesinin arttığı gösterilmiş ancak mikrotübül stabilitesi üzerine etkisi araştırılmamıştır. Bu tez çalışmasında ROCK'ın ve hedefi olan mikrotübül asosiye proteinlerden Collapsin response mediator 2 (CRMP2)'nin mikrotübül stabilitesine etkisi araştırılmıştır. Tez çalışmalarında motor nöron benzeri NSC34 hücre hattı kullanılmış, Western blot çalışmaları sonucunda, SMN gen ifadesi siRNA ile baskılanan hücrelerde CRMP2 protein düzeyinde kontrole göre bir değişiklik saptanmamış; fosforile formunun ise azalma gösterdiği belirlenmiştir. Hücrelerde ROCK aktivitesi fasudil bileşiği uygulanarak inhibe edildiğinde, kontrol hücrelerde mikrotübül stabilite belirteci olan detirozinlenmiş α tübülin düzeyinde bir fark saptanmazken, SMN baskılanan hücrelerde, kontrole göre düşük düzeyde olan α tübülin detirozinasyonunda artış görülmüş, ancak istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır. Bu tez çalışması ile in vitro SMA modelinde ROCK-CRMP2 ve mikrotübül stabilitesi arasındaki ilişki ilk defa araştırılmıştır. Elde edilen sonuçlar, ROCK'ın mikrotübül stabilite kaybında rolü olabileceğine işaret etmekte olup sonraki araştırmalara yol gösterici olacaktır.
Alkol'ün sigara dumanı ekstresi varlığında ve yokluğunda primerbronş epitel hücrelerinde proinflamatuvar sitokin genlerinin ekspresyonuna etkisi
Alkol, dünya genelinde yaygın biçimde tüketilen, bağımlılık potansiyeline sahip psikoaktif bir maddedir ve yalnızca ekonomik ve sosyal sonuçlar doğurmakla kalmayıp insan sağlığı üzerinde de önemli olumsuz etkiler yaratmaktadır. Merkezi sinir sistemi ve gastrointestinal sistem üzerindeki etkileri görece iyi incelenmiş olsa da, hava yolları ve akciğerler üzerindeki etkileri yeterince aydınlatılamamıştır. Bu çalışma, alkol maruziyetinin, sigara dumanı ekstresi (SDE) varlığında ve yokluğunda, insan bronşiyal epitel hücrelerinde proinflamatuvar sitokin genlerinin (IL6, IL8, TNFα) ekspresyonuna etkisini ortaya koymayı amaçlamıştır.Çalışmada insan bronşiyal epitel kökenli BEAS-2B hücre hattı ve primer bronşiyal epitel hücreleri (PBEH) kullanılmıştır. Hücreler tek başına etanol ile(1 ve 5 mM) veya tek başına SDE ile (%2,5 ve %5) ya da kombine (etanol + SDE) biçimde 12 saat ve 24 saat süreyle muamele edilmiştir. Hücresel toksisite ve canlılık, BEAS-2B hücrelerinde 0,1–100 mM aralığındaki etanol konsantrasyonlarına ek olarak %2,5 ve %5 SDE ile (ve bunların kombinasyonlarıyla) yapılan maruziyetlerden sonra MTT testi ile değerlendirilmiştir. Proinflamatuvar sitokin genlerinin (IL6, IL8, TNFα) mRNA düzeyleri, toplam RNA izolasyonunu takiben cDNA sentezi yapılarak, kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) ile analiz edilmiştir. Primer bronş epitelinde (sağlıklı, sigara içen ve KOAH) sitokin dinamikleri zamana ve eş maruziyet koşullarına bağlı olarak belirgin biçimde farklılaşmıştır. Sağlıklı hücrelerde IL-8 ekspresyonu 12. saatte geçici bir artış göstermiş, 24. saatte ise çoğunlukla bazal düzeylere dönmüştür; sigara içen ve KOAH kaynaklı hücrelerde IL-8 yanıtı 12–24 saat boyunca genel olarak düşük kalmıştır. IL-6 için üç grupta da qPCR'da özgül ve tekrarlanabilir amplifikasyon elde edilememesi, bu genin karşılaştırmalı analizini kısıtlamıştır. TNF-α açısından sağlıklı epitelde yalnızca sınırlı dalgalanma izlenmiş, 24. saate doğru belirgin bir yükseliş saptanmamıştır; sigara içen ve KOAH epitelinde ise ekspresyon çoğunlukla baskılanmıştır. Eş maruziyet koşullarında, %2,5 SDE ile 1 mM etanol kombinasyonu 24. saatte IL-8'i anlamlı biçimde yükseltirken, aynı SDE düzeyinde 5 mM etanol artışı sınırlamış; IL-6 ve TNF-α için de 1 mM etanolde geç dönemde artış eğilimi, 5 mM etanolde ise baskılanma öne çıkmıştır. Bu bulgular, alkol ve sigara dumanının birlikte etkisinin hava yolu epitelinde proinflamatuvar yanıtı doz–zaman bağımlı olarak yeniden ayarladığını; orta yükte proinflamasyonun güçlenirken, daha yüksek etanol dozlarında baskılanmanın belirginleştiğini göstermektedir. Klinik yorumun güçlendirilmesi için protein düzeyi doğrulamaları ve epitel bariyer fonksiyonuna ilişkin ölçümlerin eklenmesi gerekmektedir.
Yeni salen grup içeren bor bileşiklerinin sentezi, yapılarının farklı analitiksel tekniklerle aydınlatılması ve meme kanserine karşı etkilerinin incelenmesi
Kanser, genetik ve çevresel faktörlerin tetiklediği malign fenotip kazanmış hücrelerin organizmada kontrolsüz bir şekilde bölünmesi, birikmesi, çoğalması ve yayılması ile meydana gelen ve her geçen yıl sıklığı giderek artan heterojen bir hastalık grubudur. Meme kanseri dünya çapında kadınlar arasında en sık görülen kanser olup aynı zamanda önemli ölüm nedenlerinden biridir. Bu alanda günümüzde genel ve hedefe yönelik çeşitli tedaviler kullanılarak sağkalım oranı arttırılmaktadır. Son yıllarda bor içeren bileşiklerin sağlık alanında kullanımı giderek yaygınlaşmaktadır. Özellikle yapılan çalışmalar kapsamında bor bileşiklerinin anti-kanser etkileri de araştırılmakta ve hatta elde edilen bazı bor bileşikleri ilaç olarak tedavide kullanılmaktadır. Güncel çalışmalar bor bazlı bileşiklerin lösemi, meme kanseri, akciğer kanseri, prostat kanseri, yumurtalık kanseri ve glioblastoma multiforme gibi belirli kanser türlerine karşı etkili olabileceğini göstermiştir. Bu nedenle, bazı bor içeren bileşiklerin anti-kanser ajanlar olarak potansiyele sahip olduğunun bilinmesinden yola çıkılarak, çalışmamızda yeni salen grup içeren altı farklı (SB1-SB6) bor bileşikleri sentezlendi. Bu bileşiklerin; FT-IR, NMR, UV-Vis, LC-MS/MS ve elementel analiz gibi spektroskopik tekniklerle yapıları aydınlatıldıktan sonra, anti-kanser aktiviteleri MDA-MB231, MCF-7 ve CRL-4010 hücreleri üzerindeki sitotoksik etkisi MTT yöntemiyle ve apoptotik etkisi Annexin-V yöntemiyle hücre kültürü ortamlarında incelendi. Sentezlenen yeni bor bileşiklerinden SB6 bileşiğinin MDA-MB-231 meme kanseri hücre hattında IC50 değeri 47,3 μg/ml olarak ölçüldü. SB6 bileşiğinin 50 µg/ml dozunun morfolojik olarak incelendiğinde MDA-MB-231 meme kanseri hücre hattında %30,6 oranında apoptozise neden olduğu gözlendi. Elde ettiğimiz bulgulara göre SB6 bileşiğinin MDA-MB-231meme kanseri hücre hattında sitotoksik etki göstermesi sebebiyle daha kapsamlı araştırmalar yapılarak farklı çalışmalara yön verme potansiyeline sahip olabileceği sonucuna varıldı.
Türkiye'nin Doğu Anadolu popülasyonunda özofagus kanseri ve P21 polimorfizmleri arasındaki ilişki
Özofagus kanseri dünya genelinde en yaygın sekizinci kanser türüdür. Türkiye'nin Doğu Anadolu Bölgesinde özofagus kanserine yakalanma oranı oldukça yüksektir. Hücre büyüme döngüsünü düzenleyen p21, normal büyüme ve farklılaşma için çok önemlidir. Birçok epidemiyolojik çalışma, p21'deki polimorfizmlerin özofagus ve diğer kanserler ile ilişkisini incelemiştir. Bu çalışmanın amacı, Türkiye'nin Doğu Anadolu bölgesinde özofagus kanserli hastalarda p21 polimorfizmlerinin (rs1059234 C/T, rs1801270 C/A ve rs3176352 G/C ) görülme sıklığını ve muhtemel ilişkisini araştırmaktır. Bu polimorfizmler protein ekspresyonunu etkileyebilir ve kanser duyarlılığında rol oynayabilir. Literatürde diğer popülasyonlarda bazı çalışmalara rastlanmış, ama Türkiye'de bu polimorfizmler ile özofagus kanseri arasındaki ilişkiyi gösteren bir çalışmaya rastlanmamıştır. Bu çalışma, 2017-2018 yılları arasında 69 hasta ve 101 sağlıklı kontrol grubundan toplanan örnekler üzerinde gerçekleştirilmiştir. Gerçek zamanlı PCR'da Taqman Assay yöntemi ile genotipleme yapılmış ve istatistiksel analizler yapılarak sonuçlar belirlenmiştir. p21 polimorfizmlerinin allel ve genotip frekanslarında hasta ve kontroller arasında istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık gözlenmemiştir. Ayrıca bu polimorfizmler ve diğer klinik özellikler arasında da bir ilişki görülmemiştir. Bununla birlikte özofagus kanser riskinin ailede kanser, sigara kullanımı, Van otlu peyniri, tandır dumanı ve reflü gibi diğer faktörler ile ilişkili olduğunu gözlemledik (p<0,05). Bulgularımız Türkiye'nin Doğu Anadolu popülasyonunda diğer demografik faktörlerin özofagus kanser riskini arttırabileceğini, fakat p21 polimorfizmleri (rs1059234 C/T, rs1801270 C/A ve rs3176352 G/C) ve özofagus kanseri riski arasında bir ilişki olmadığını göstermiştir (p>0,05). Bu sonucun doğrulanması için diğer genetik faktörlerin ve daha fazla vakanın incelenmesine ihtiyaç vardır. Anahtar Kelimeler: Genotipleme, gerçek zamanlı PZR, Özafagus kanseri, p21, polimorfizm,
Leptin ve leptin reseptör antagonistinin glioblastoma temozolomid direncindeki rolü
Glioblastoma (GB) bilinen en malin beyin tümörüdür. GB, radyoterapi ve kemoterapi uygulamalarına moleküler ve klinik özellikleri açısından sıklıkla dirençlidir. Kemoterapide kullanılan en yaygın ilaç Temozolomid (TMZ)'dir. Son yıllarda yapılan çalışmalarda, leptinin kanser tedavisinde gelişen kemoterapötik dirençte rol oynayabileceği belirtilmektedir. Bu tez çalışmasında; Glioblastoma'da TMZ'ye karşı gelişen kemoterapötik dirençte, leptin ve/veya leptin antagonistinin (SHLA) olası rolünün araştırılması amaçlanmıştır. Çalışmada T98G, U373 MG ve LN-405 GB hücre serileri kullanılmıştır. Bu hücrelerde TMZ, leptin ve SHLA'nın sitotoksisitesi MTT ile saptanmıştır. TMZ, leptin ve SHLA'nın tekli kullanımlarının ve ikili, üçlü kombinasyonlarının TMZ direnç yolağında yer alan MGMT, MLH1, MSH2, MSH6, PMS2 genlerinin ekspresyonları üzerine etkisi RT-PZR ile saptanmıştır. Moleküllerin genomik DNA hasar etkisi COMET ve hücre döngüsüne olan etkileri ise akım sitometri ile belirlenmiştir. TMZ, leptin ve SHLA'nın TMZ direnç yolağındaki genlerin ekspresyonlarına olan etkileri birbirinden farklılık göstermektedir. Genomik DNA hasarı ve hücre döngüsü açısından hücre serileri arasında anlamlı farklılıklar saptanmıştır. Elde edilen veriler TMZ, leptin ve SHLA'nın hücre tipine göre kemoterapötik dirence farklı düzeyde katkı sağladığı, leptinin özellikle MGMT ekspresyonunu arttırdığı, MMR genlerinde ise genel olarak değişikliğe neden olmadığı tespit edilmiştir. Leptin ve SHLA'nın tek başlarına genomik DNA'da hasar oluşturabildiği ve hücrelerin G1 fazında birikmesine neden olduğu ancak kombinasyonlarda bu etkinin hücre tiplerine göre farklılık gösterdiği saptanmıştır. Sonuçlarımız, leptin ve SHLA'nın tek ve kombine kullanımlarının TMZ kemoterapötik direncinde rol alabileceğini ve bu etkinin hücre tipine göre ve gen spesifik olarak değiştiğini göstermektedir. Bu tez çalışması, leptin ve SHLA'nın TMZ direncindeki etkisinin araştırıldığı ilk çalışmadır.
İn vitro ortamda insülin reseptör substrat 1 (IRS1) bağımlı sinyal iletim ağının glioblastoma multiforme gelişimindeki rolünün belirlenmesi
Beynin temel enerji kaynağı glukozdur ve beyin, glukozu yoğun bir şekilde kullanmaktadır. Dolayısıyla beynin fizyolojik rolünü yerine getirmesi, glukoz metabolizmasının sıkı bir şekilde kontrolü ile sağlanmaktadır. İnsülin Reseptör Substrat (IRS) proteinleri, glukoz metabolizmasının regülasyonunda rol alan en önemli adaptör proteinlerdir. IRS1 bu protein ailesinin üzerinde en çok çalışılan elemanıdır. IRS1, kanserle ilgili birçok reseptörle etkileşime geçmektedir ve literatürde IRS1'in meme, akciğer, prostat, böbrek gibi birçok kanser türünde ekspresyon artışı gösterilmiştir. Yapılan çalışmalarda merkezi sinir sistemi tümörlerinden biri olan medulloblastomda da IRS1 ekspresyonunun arttığı gösterilmiştir. Bizde bu bilgiler ışığında, IRS1'in merkezi sinir sisteminin bir diğer önemli tümörü olan glioblastoma multiforme (GBM) gelişiminde de böyle bir ekspresyon artışı olabileceğini düşündük. Buradan yola çıkarak in vitro ortamda IRS1 bağımlı sinyal iletim ağının GBM gelişimindeki rölünü belirlemeyi amaçladık. Çalışmada, U-87 MG hücre hattı kullanıldı. IRS1 proteinin ekspresyonunu U-87 MG hücrelerinde arttırmak amacıyla pcDNA3.1-flag tagged-insan IRS1 ekspresyon vektörü lipofektamin aracılığı ile hücrelere transfekte edildi. Ektopik IRS1 ekspresyon artışının GBM hücrelerinin sağkalımı üzerindeki fonksiyonel etkisi MTT analizi, insülin sinyali üzerindeki moleküler etkisi western blot analizi ile belirlendi. Elde ettiğimiz sonuçlar, ektopik IRS1 ekspresyon artışının GBM hücre sağkalımını arttırdığını göstermektedir. Ayrıca, IRS1 ekspresyon artışının, insülin indüklü Grb2, ERK ve AKT proteinlerinin aktivasyonlarında artış gerçekleştirdiği saptanmıştır. Çalışmamız, GBM hücrelerinde IRS1 ekspresyon ve aktivasyon artışının, hücre sağkalımını AKT aktivasyonu aracılığıyla arttırdığını ortaya koymaktadır. Anahtar Kelimeler: Beyin Tümörleri, Glioblastoma Multiforme, IRS1, İnsülin Reseptör Substrat Proteinleri (IRS), İnsülin Sinyali.
Sodyum deoksikolat maddesinin meme kanser hücre hattinda apoptotik, sitotoksik ve DNA hasari üzerine etkisi
Sodyum Deoksikolat Maddesinin Meme Kanser Hücre Hattında Apoptotik, Sitotoksik ve DNA Hasarı Üzerine Etkisi. Van Yüzüncü Yıl Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı, Yüksek Lisans Tezi, Van, 2019. Meme kanseri kadınlarda en sık görülen kanserdir ve dünya çapında kanser ölümlerinin önde gelen nedenidir. Kemoterapi genellikle metastaz azaltmak ve tümörün küçülmesi için uygulanan antineoplastik ilaçlar ile yapılan bir tedavidir. Bu çalışmanın amacı Sodyum deoksikolat maddesinin meme kanser hücre hattında (MCF-7) sitotoksik, apoptotik ve DNA hasarının moleküler mekanizmaları üzerine etkisini araştırmaktır. Bu çalışmada kanser hücrelerini etkileme potansiyeline sahip olduğu hipotezine dayanarak Sodyum deoksikolatın meme kanser hücre hattında farklı dozları kullanılmıştır. Antikanser özellik tespiti için Sodyum deoksikolat maddesinin MCF-7 meme kanser hücreleri ile kontrol grubu olarak sağlıklı normal meme hücreleri (CRL- 4010) üzerindeki sitotoksik etkisi MTT yöntemiyle incelendi. Sitotoksik etkinin belirlenmesinden sonra, Sodyum deoksikolatın aktif dozunun apoptoz ve DNA hasarı üzerindeki etkinliği apoptotik DNA ladder ve Western Blot metodu ile incelenmiştir. Bunu yanı sıra oksidetif stres indeksi ve hücre göçü testleri yapıldı. Sonuç olarak Sodyum deoksikolat maddesinin MCF-7 ve CRL-4010 hücreleri üzerinde sitotoksik etkisi gösterdiği ama hücrelerin DNA'larına zarar vermediği tespit edildi ve apoptozise yol açan birkaç proApoptotik proteinlerin varlığı tespit edildi. Sodyum deoksikolatın MCF-7 kanser hücrelerinde, kanser için bir prediktif risk faktörü olarak değerlendirebileceğimiz paraoksonaz ve arilesteraz enzim aktivitesini önemli ölçüde azalttığı tespit edildi. Ayrıca Sodyum deoksikolatın hücre göçünü zamana bağlı olarak geciktirdiği belirlendi. Sonuçlar, Sodyum deoksikolatın meme kanseri hücrelerinde antimetastatik bir etkiye sahip olduğunu ve daha ileri kanser çalışmaları için potansiyel bir ajan olduğunu göstermiştir.
Karvakrol'ün melanoma hücre hatlarında olası antikanserojenik etkilerinin araştırılması
TAYSI ML, Karvakrol'ün Melanoma Hücre Hatlarında Olası Antikanserojenik Etkilerinin Araştırılması, Van Yüzüncü Yıl Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı, Yüksek Lisans Tezi, Van, 2024. Cilt kanseri, dünyada giderek artan vaka sayıları ile dikkat çekmektedir. Kanser tedavisinde antioksidan içerikli doğal bileşiklerin rolünün araştırılması son yıllarda önem kazanmıştır. Daha önce yapılan bazı çalışmalarda karvakrol (KRV)'ün antioksidan, antimikrobiyal ve antikanser gibi etkilere sahip olduğu bildirilmiştir. Bu çalışmamızda KRV'nin A2058 insan ve B16F10 fare melanoma hücrelerinde antikanserojenik etkileri literatüre göre ilk kez araştırıldı. Bu amaçla yukarıda belirtilen melanom hücre hatlarına in vitro olarak farklı dozlarda (1 µM, 10 µM, 20 µM, 40 µM ve 100 µM) KRV uygulandı ve IC50 değeri MTT sitotoksisite testi ile hesaplandı. Hesaplanan IC50 sonucuna göre KRV'nin melanoma kanser hücreleri üzerinde sitotoksik etki gösterdiği tespit edilmiştir. KRV'nin melanoma hücrelerinin göçü (migrasyon) üzerindeki etkisinin analizi için yara iyileştirme deneyi, hücrelerin koloni oluşturabilme potansiyelini tespit etmek için ise koloni oluşturma deneyi gerçekleştirilmiştir. Söz konusu hücrelerin tutunabilme kabiliyetini test etmek için hücre adezyon deneyi yerine getirilmiş olup CD44 ve CD133 kanser kök hücre yüzey markerlarının ekspresyon seviyelerinin belirlenmesi için ise flow sitometri analizi yapılmıştır. Bunlara ilaveten BAX, BCL-2, TGF-β, CD4 ve CD133 genlerinin ekspresyon düzeylerinin belirlenmesi için RT-PCR analiz yöntemine başvurulmuştur. Elde edilen sonuçlar KRV'nin hücre proliferasyonunu, koloni oluşumunu, hücre adezyonunu azalttığını, hücre göçünü ise yavaşlattığını ortaya koymuştur. KRV uygulanmasıyla CD44 ve CD133 kanser kök hücre yüzey belirteçlerinin hem mRNA hem de protein düzeyinde ekspresyon seviyelerinin düştüğü not edilmiştir. Apoptotik gen olan BAX'ın ekspresyonunun (mRNA düzeyinde) arttığı, antiapoptotik gen olan BCL-2'nin azaldığı görülmüş olup bu da apoptozun indüklediğini işaret etmiştir. Sonuç olarak bu çalışmada KRV'nin hem A2058 insan hem de B16F10 fare melanoma kanser hücre hatlarında sitotoksik ve antikarsinojenik etkiye sahip olduğu gösterilmiştir.Anahtar Kelimeler: Cilt Kanseri, Sitotoksisite, Antikanserojen, Karvakrol.
Kafeik asit fenetil esterin tiroit kanseri hücre hattında sitotoksisite, antimetastaz, antiproliferatif aktivite, apoptoz, oksidatif stres ve mitokondriyal membran potansiyeli üzerindeki etkileri
Küresel kanser insidans verilerinin kapsamlı bir analizi, tüm ırk ve cinsiyet gruplarında tiroit kanseri vakalarında önemli bir artış olduğunu ortaya koymaktadır. Özellikle tiroit kanseri insidansı artarak kadınlar arasında en sık görülen beşinci kanser haline gelmiştir. Bu çalışmanın amacı, hücresel penetrasyonu kolaylaştıran lipofilik bir moleküler yapıya sahip Apis mellifera bal arılarından elde edilen doğal bir bileşik olan Kafeik Asit Fenetil Ester'in (CAPE) mitokondriyal membran potansiyeli (MMP, Δψm) yolu üzerinden TPC-1 insan papiller tiroit kanseri hücre hattı üzerindeki sitotoksik etkisini incelemektir. CAPE'nin TPC-1 hücre hattı üzerindeki sitotoksik etkisi MTT ve kristal viyole deneyleri kullanılarak değerlendirilmiştir. Apoptotik aktivitenin derecesi, Bax, Bcl-2, Kaspaz-3, Kaspaz-8, Kaspaz-9 ve Apaf-1 seviyelerini analiz etmek için kullanılan bir yöntem olan ELISA ile belirlenmiştir. Tiroit kanseri hücre mitokondrisi üzerindeki etki, JC-1 floresan problu-MMP, ROMO-1 ve mitokondriyal ATP-sentaz aktivitelerinin analizi yoluyla araştırılmıştır. Oksidatif stres ve DNA hasarının derecesini değerlendirmek için ROS ve 8-OHdG analizi yapılmıştır. Laktat dehidrojenaz (LDH) analizi hem sitotoksisite hem de hücresel membran hasarının bir belirteci olarak kullanılmıştır. Anti-metastatik aktiviteyi tespit etmek için hücre göçü ve koloni oluşumu deneyleri yapılmıştır. Sitomorfolojik analiz için Giemsa boyama yöntemi seçilmiştir. CAPE uygulamasının 48 saatlik bir süre boyunca değişen dozlarda TPC-1 hücrelerinde sitotoksik aktivite gösterdiğini belirten bulgular ışığında, 25 µM IC50 değeri sonraki deneyler için etkili doz olarak seçilmiştir. Bcl-2 seviyelerinde azalma ve Bax, Kaspaz-3, -8, -9 ve Apaf-1 anahtar bileşenlerinin aktivasyonunda istatistiksel olarak anlamlı bir artış, CAPE kaynaklı hücre ölümünün apoptoza bağımlı olduğunu göstermiştir. Bu çalışma CAPE'nin erken apoptozun bir belirteci olan mitokondriyal membran potansiyelinde (Δψm) mitokondriyal depolarizasyona ve mitokondriyal ATP-sentazda önemli bir düşüşe neden olduğunu göstermiştir. Ayrıca, CAPE hücre içi ROS, ROMO-1 seviyeleri ve 8-OHdG DNA hasarında önemli bir artışa neden olmuş, buna hücresel membranlardan sızan hücre dışı LDH konsantrasyonunda önemli bir artış eşlik etmiştir. Özellikle hücre göçü ve koloni oluşumu üzerinde belirgin bir inhibitör etki göstererek anti-metastatik özellikler sergileyen CAPE, sitomorfolojik değişikliklere de neden olmuştur. Sonuç olarak, bulgular CAPE'nin TPC-1 hücrelerinde MMP depolarizasyonu ve ATP sentaz blokajı ile ilişkili mitokondriyal yolakların modülasyonu yoluyla artan ROS, ROMO-1 ve hücre dışı LDH tarafından tetiklenen hem intrinsik hem de ekstrinsik apoptotik yolaklarda aktivite gösterdiğini ortaya koymuştur. Bununla birlikte, insan papiller tiroit karsinom hücrelerinde sitomorfolojik değişikliklere neden olduğu gözlemlenen CAPE'nin potansiyel etkileşimlerini ve güvenliğini kapsamlı bir şekilde değerlendirmek için daha fazla in vivo araştırma yapılması gerekmektedir.
Otoinflamatuvar hastalıklarda rolü olan MRNA ve MİRNA moleküllerinin meta-analizi
Otoinflamatuvar hastalıklar, doğal bağışıklık sisteminin etkilenmesi sonucunda inflamasyon yanıtlarının arttığı bir hastalık grubudur. Bu hastalıklar genetik özellikleri açısından monogenik ve poligenik olarak gruplandırılabilmektedir. Bu hastalıklar içerisinde tez kapsamında incelenen; PFAPA poligenik olarak, AAA, CAPS, TRAPS, MKD hastalıkları ise farklı genlerde oluşan mutasyonlar sonucunda ortaya çıkmaktadır, ancak bu hastalıklarda görülen benzer fenotip, benzer yolakların ve moleküllerin etkilendiğini düşündürmektedir. Literatürde otoinflamatuvar hastalıklar ile ilişkili omik temelli çalışmalar mevcuttur. Tez kapsamında, bu verilerin birlikte değerlendirilmesi amaçlanmış, mRNA ve miRNA temelli omik çalışmaların mikrodizin veri setleri R (4.0.5), BRB-ArrayTools ve MeV gibi programlar kullanılarak analiz edilmiştir. İfadesi değişen genler, DAVID ve InnateDB programlarıyla analiz edilerek inflamasyonla ilişkili olanlar belirlenmiştir. Sonrasında, bu hastalıklarda ortak olarak ifadesi değişen mRNA'lar, ifadesi değişen miRNA'ların hedef genleri olabileceğinden, veri setlerinden elde edilen mRNA ve miRNA'ların bağlanma olasılıkları TargetScan veri tabanı kullanılarak gösterilmiştir. Son aşamada, anlamlı olarak ifadesi değişen mRNA ve miRNA'ların hedeflediği proteinler tanımlanmış, bu proteinlerin arasındaki protein-protein ilişkileri STRING analizleri ile belirlenmiştir. Analizler sonucunda, inflamasyon açısından önemli proteinler olan STAT1, NAIP, FAS, MAPK14 proteinleri öne çıkmış ve seçilen hastalıklara sebep olan genlerin kodladığı proteinler ile ilişkisi oldukları gösterilmiştir. Elde edilen bu ön bilgiler, seçilen hastalıklarda ortak moleküllerin patogenezi etkilediği hipotezini desteklemiş, bu bulguların laboratuvar ortamında incelenmesi önem kazanmıştır. Bu tez, otoinflamatuvar hastalıklarda inflamasyona sebep olan yolakların aydınlatılarak hastalıkların daha iyi sınıflandırılması ve uzun vadede tedavi hedefi olabilecek moleküllerin belirlenmesine yönelik önemli katkılar sağlayabilecektir.
Kolşisin direnci olan ailevi akdeniz ateşi hastalarında ifadesi değişen miRNA'ların inflamasyon ve ilaç direnci ile ilişkisinin belirlenmesi
Ailevi Akdeniz ateşi klinik heterojenitenin görüldüğü monogenik bir sistemik otoinflamatuvar hastalıktır. Ailevi Akdeniz ateşinde en yaygın tedavi yöntemi günlük kolşisin kullanımıdır. Fakat hastaların %2-5'lik kısmında kolşisin direnci görülmektedir. İlaç direncinin gelişiminde epigenetik mekanizmaların özellikle kodlamayan RNA'lardan mikroRNA'ların rol oynadığına dair çalışmalar mevcuttur. Bu sebeple kolşisin dirençli hastalarda ifadesi değişen mikroRNA'ların ilaç direnci ve inflamasyon ile muhtemel ilişkisinin değerlendirilmesi gerektiği düşünülmüştür. Grubumuz tarafından daha önce gerçekleştirilen miRNA 4.0 array ile mikroRNA ifade analizi yeniden değerlendirilmiş; kolşisin dirençli ve duyarlı hasta grupları arasında ifadesi en az 2 kat değişen 25 mikroRNA bulunmuştur. Bu mikroRNA'lardan ilaç direnci ile yüksek oranda ilişkili bulunanlar hasta grubunda kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu ile valide edilmiş, miR-183-5p ve miR-15b-5p'nin ifadesinin kolşisin dirençli hastalarda anlamlı şekilde azaldığı, miR-125a-5p'nin ifadesinin anlamlı olmayan bir azalış gösterdiği bulunmuştur. Biyoinformatik araçlar kullanılarak hem inflamasyon hem de ilaç direnci ile ilişkili genlerin listesi oluşturmuş, kolşisin dirençli hastalarda anlamlı azalış gösteren mikroRNA'ların ilaç direnci ve inflamasyonla ilişkili olası hedef genleri belirlenmiştir. Genlerin ifade analizi için yapılan kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu deneylerinde, kolşisin dirençli hastalarda azaldığı görülen mikroRNA'ların olası hedef genleri olarak seçilen NR3C1 ve NFKB1'in ifadesinin, aynı hasta grubunda arttığı gösterilmiştir. Grubumuzun önceki projeleri sırasında oluşturulmuş kolşisin dirençli hücre hattında da aynı mikroRNA'ların ve hedef genlerinin hasta grubuyla benzer değişim gösterdiği saptanmıştır. Bu çalışma sonucunda belirlenen ifadesi değişen mikroRNA'ların, ileride kolşisin direncinin erken tanısı için biyobelirteç olma potansiyeli taşıdığı düşünülmektedir. Anahtar kelimeler: AAA, kolşisin direnci, mikroRNA
Hepatoselüler karsinomda mitofajik genlerin rolü ile genetik ve epigenetik profilinin araştırılması
Hepatoselüler karsinom (HCC) en sık ve mortalite oranı en yüksek olan karaciğer kanseridir ve dünyada kansere bağlı ölümlerde 2. Sırada yer alır. Normal süreçte hücrenin genetik materyalinde bir hasar olduğunda ve bu hasar tamir edilemezse hücre ölüm mekanizmaları aktifleşir. Bu mekanizmalardan biri olan otofajinin alt tipi olan ve mitokondriyal kalite kontrolü sağlayan mitofaji ise hücrede kanser oluşumunu engelleyen bir olaydır. Karsinogenez süreci içerisinde genetik değişiklikler dışında DNA dizilerinde kalıcı değişikliklere yol açmayan Epigenetik mekanizmalarda oluşan anomaliteler de kansere neden olmaktadır. Epigenetik mekanizmalardan birisi olan DNA metilasyonu karsinogenez sırasında hipermetile olarak tümör baskılayıcı genleri susturarak kanserleşmeye sebep olabilir. Mitofajide rol alan AMBRA1, FUNDC1, PGAM5 ve LC3 genlerinin HCC karsinogenezindeki rollerini aydınlatmayı amaçladığımız çalışmada HepG2 ve HUVEC hücre hatlarına ait örneklerde AMBRA1, FUNDC1, PGAM5 ile LC3 genlerinin mRNA ekspresyonu, metilasyon ve protein seviyeleri qRT-PCR, QMSP ve ELISA yöntemleriyle incelenmiştir. AMBRA1 için tümör örnekleri ile normal örnekler kıyaslandığında protein seviyesinde azalma ile birlikte mRNA ekspresyonu açısından örneklerin %60 (3/5)'ında artış, %20'sinde (1/5) azalma gözlenirken %20 (1/5)'sinde ise değişiklik gözlemlenmedi. Tümör örneklerinin %40 (2/5)'ında ve normal örneklerin %80 (4/5)'inde AMBRA1 geninin promotör bölgesine ait hipermetilasyon tespit edilmiştir. FUNDC1 için protein seviyesi istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde azalma gözlemlenirken (p=0.024), mRNA ekspresyonunda %80 (4/5) ekspresyon artışı, %20 (1/5) azalma gözlemlendi. Promotör hipermetilasyonuna bakıldığında yalnızca tümör örneklerinin %20 (1/5)'sinde promotör hipermetilasyonu gözlemlendi. Tümör örneklerinde PGAM5'in hem protein seviyesi de anlamlı şekilde azalırken (p=0.0005) hem de mRNA ekspresyonunda %80 (4/5) PGAM5 ekspresyonunda artış gözlemlendi. Promotör metilasyonu ise hem tümör hem normal örneklerin %40 (2/5) ve %40 (2/5)'ında tespit edildi. LC3 geninin tümör hücrelerinin %60(3/5)'ında mRNA ekspresyonunda azalma gözlemlenirken %20 (1/5)'sinde ekspresyon artışı gözlemlendi ve %20(1/5)'sinde ise ekspresyonda değişim gözlemlenmedi. Protein seviyelerine bakıldığında tümör grubundaki protein seviyesi normal gruba kıyasla artmıştır. Tümör örneklerinin %40 (2/5)'ında, normal örneklerin ise %80 (4/5)'inde LC3 geninin promotör bölgesine ait hipermetilasyon tespit edilmiştir. AMBRA1, FUNDC1, PGAM5 ve LC3'ün protein ve metilasyon seviyeleri arasında istatistiksel anlamlılık bulunmuştur (sırasıyla p<0.0001, p=0.001, p=0.002, p<0.0001). İn vitro olarak incelenen bu mitofajik genlerin diğer genlerle olan etkileşimlerinin daha geniş hasta kohortlarında çalışılması hem terapötik hem de biyobelirteç stratejilerin oluşturulmasında kullanılabilir
Baş boyun kanserlerinde radyasyon tedavisine cevap ve radyotoksisitede uzun kodlamayan RNA (lncRNA)'ların rolü
Baş boyun kanseri (BBK) dünya çapında en çok rastlanan kanser tiplerinden biridir. Genellikle tümör yerleşimi larenks, nazofarenks, orofarenks, nazal kavite olan bu hastalığın tedavisi cerrahi, radyoterapi ve kemoradyoterapidir. Hastalığın ilerlemesinde ve tedaviye yanıtta uzun kodlamayan RNA (lncRNA), mikroRNA (miRNA) gibi etkenlerin rolü vardır. Bu çalışmada, birçok kanser türünde onkogenik etkisi olduğu bilinen bir lncRNA olan PCAT6'nın BBK'deki ifadesini ve radyasyon yanıtına etkisini araştırmayı amaçladık. Çalışmaya, BBK tanısıyla, radyoterapi ve kemoradyoterapi uygulanan 15 hasta ve 12 sağlıklı birey dahil edildi. Hastalardan tedavi öncesi, ortası ve sonunda ve kontrol grubunu oluşturan bireylerden alınan kan örneklerinden RNA izolasyonu yapıldı. RNA örneklerinden tek adım enzim sistemi kullanılarak cDNA sentezi ve gerçek zamanlı polimeraz zincir tepkimesi (GZ-PZT) yapılarak PCAT6 geninin ifadesi analiz edildi. PCAT6 ifadesinin hastalarda tedavi öncesinde kontrol grubuna göre 3,07 kat arttığı, tedavi sırasında da artmaya devam ettiğini gözlemlendi. PCAT6 ifadesi tedavi ortasında tedavi öncesine göre %6,5; tedavi sonunda tedavi ortasına göre %11,9 ve tedavi sonunda da tedavi başlangıcına göre %19,2 artmıştır. Sonuç olarak, PCAT6'nın diğer kanserlerde olduğu gibi BBK'de de onkogenik etkisi olabileceği ve radyasyon yanıtında ifadesinin değişebileceği öne sürülebilir.
Meme ve kolon kanser hücre hatlarında quercetin ve CD3254 kombinasyonunun NR4A1/RXR üzerinden apoptoza etkisinin araştırılması
Meme kanseri, meme hücrelerinin değişime uğraması ve kontrolsüz olarak çoğalması nedeniyle tümör oluşumuyla ortaya çıkan bir hastalıktır. Kolon kanseri, kolon veya rektumda (kalın bağırsak) meydana gelen anormal hücre büyümesidir. NR4A1,nükleer reseptörlerin NR4A alt ailesinin bir üyesi olup, olgunlaşmamış T hücreleri, nöronlar ve kanser dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerinin gelişimi, farklılaşması ve hayatta kalmasında ve apoptozda önemli roller oynar. Kuersetin (quercetin), polifenollerin flavonoid grubundan bir bitki flavonolüdür. Anti-enflamatuar ve anti-kanserojen etkilerinden dolayı tedavi amaçlı da kullanılan kuersetin,birçok meyve, sebze, yaprak, tohum ve tahılda bulunur. RXR, retinoik asit reseptörlerinden biri olup nükleer reseptörlerle de (NR) bağlanarak uygun gen bölgesini aktive ederler. Bu çalışmada, kuersetin ve RXR agonisti CD3254 uygulanan insan MCF-7 meme ve HCT-116 kolon kanser hücrelerinde NR4A1 ve RXR heterodimerinin apoptoza ve NR4A1, RXR, ve apoptotik proteinlerden Cyt-C ve Bcl-2 miktarlarına etkisinin araştırılması amaçlanmıştır. Kuersetin ve CD3254 uygulanan MCF-7 ve HCT-116 hücrelerinde sitotoksisite CCK-8 yöntemiyle incelendi ve MCF-7 hücre hattında 24 saatlik IC50 değeri 68.3 µM, 48 saatlik ise 97.74 µM olarak saptandı. Fakat HCT-116 hücrelerinde kuersetinin etkinliği gözlenmedi. CD3254`ün de her iki hücre hattında etkinliği gösterilmemiştir. MCF-7 hücrelerinde 20 ve 100 µMkuersetin uygulaması sonrasında NR4A1, RXR, Bcl-2, Cyt-C, Ki-67 ve Grp-78 proteinleri, immünofloresan (İF), immünositokimya (İSK) yöntemleri kullanılarak incelendi. Western blot yöntemi ile MCF-7 hücre lizatlarında NR4A1 ve Bcl-2 proteinlerinin seviyelerindeki değişiklikler saptandı. TUNEL boyama ile apoptotik pozitiflik istatiksel olarak değerlendirildi. Elde ettiğimiz veriler, kuersetinin NR4A1`i azalttığı, RXR`ı arttırdığını gösterdi. TUNEL boyama sonuçları apoptotik pozitiflik düşük oranda gözlendi. Ancak, kuersetinin 100 µM doz uygulaması sonucu hücre sayısında azalma olduğu izlendi. Ayrıca farklı hücre ölüm yolaklarına işaret eden hücre morfolojileri de gösterildi.
Alzheimer hastalarında Jun, Fos, RELA transkripsiyon faktörlerinin mRNA seviyelerinin ve PCK2 proteininin seviyesinin araştırılması
Amyloid Öncül Proteini (APP), Alzheimer hastalığının (AH) patogenezinde önemli bir rol oynayan bir protein olarak öne çıkmaktadır. APP'nin çeşitli transkripsiyon faktörleriyle (TF'ler) etkileşimi vardır. Yaptığımız protein-protein etkileşim analizleri sonucu Jun, Fos ve RELA transkripsiyon faktörlerinin APP ile etkileşime geçebileceği saptanmıştır. Ayrıca bu üç TF de PCK2 ekspresyonunu düzenlemektedir. Bu amaçla Alzheimer, hafif kognitif bozukluk (HKB) ve frontotemporal demans (FTD) hastalarının ve kognitif olarak sağlıklı bireylerin kan örneklerinde Jun, Fos ve RELA göreceli mRNA seviyeleri gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu ile araştırılmıştır. Ek olarak çalışmaya dahil edilen bireylerin beyin omurilik sıvılarında (BOS) PCK2 seviyesi ELISA yöntemiyle incelenmiştir. Bu deney setinin sonuçlarına göre, AH'de Fos TF'sinin sağlıklı kontrol bireylerine göre istatiksel olarak anlamlı şekilde arttığı gözlemlenmiştir. Ancak diğer gruplarda anlamlı bir ilişki saptanamamıştır. Ayrıca, FTD hasta grubunda BOS PCK2 seviyelerinin azalmasıyla Aβ1-42 seviyelerinin arttığı bulunurken, AH grubunda PCK2 proteininin Aβ1-42 ile pozitif bir korelasyon gösterdiği saptanmıştır. Çalışmalar AH'nin ilerleyen aşamalarında, beyindeki nöronal stres ve hasarın artmasıyla c-Fos'un aktivasyonunun tetiklenebileceğini göstermektedir. Araştırılan TF'ler tarafından ekspresyonu düzenlenen PCK2, hücrelerin enerji metabolizmasında ve glukoneogenez gibi önemli süreçlerde kritik bir rol oynar. Özellikle FTD hasta grubunda PCK2 proteininin Aβ1-42 ile negatif fakat AH grubunda pozitif bir korelasyon göstermesi, bu iki nörodejeneratif hastalıkta glikoz metabolizması ve mitokondrial disfonksiyon açısından farkların anlaşılmasını sağlayacak bir bulgu olabilir.
Behçet hastalığında dna hasarları ve OGG1 gen ifade düzeyleri
Behçet Hastalığı (BH) 1937 yılında ilk kez Türk dermatolog Dr. Hulusi Behçet tarafından tanımlanan, tekrarlayan oral aft, genital ülserlerle birlikte oküler, cilt, gastrointestinal ve sinir sistemi bulguları ile karakterize otoimmün bir hastalıktır. BH, evrensel bir hastalık olmakla birlikte yapılan çalışmalarla Türkiye'nin BH görülen diğer ülkelere kıyasla en yüksek prevalansa sahip olduğu gösterilmiştir. Behçet Hastalığı genellikle genç erişkinleri etkilemesi ve tedavisinin zor olması, organ tutulumları ile ciddi bir morbiditeye neden olması bakımından gün geçtikçe önemi artan bir hastalık haline gelmiştir. İnflamasyonun yol açtığı artan reaktif oksijen türleri (ROT), organizmanın oksidan/antioksidan dengesini bozarak DNA gibi biyomoleküllerde hasara neden olmaktadır. ROT'ların DNA'da yol açtığı en sık görülen DNA hasarlarından biri 8-Oxo-2'-deoksiguanozin (8-oksoG)'dir. Behçet hastalığında tekrarlayan inflamasyon ile karakterize bir hastalık olduğundan, ROT kaynaklı oksidatif stresin yüksek olması ve DNA hasarlarına yol açması muhtemeldir. Yapılan birçok çalışmada, biyolojik materyallerde tespit edilen 8-OHdG'nin kanser, parkinson hastalığı, sistemik lupus eritematozus, romatoid artrit gibi hastalıklardaki mevcut DNA hasarının belirlenmesinde kullanılan iyi bir biyobelirteç olduğunu göstermiştir. DNA'daki 8-OHdG hasarlarının onarımı baz çıkarma onarım (BER) yolağında görev alan OGG1 enzimi ile gerçekleşmektedir. Çalışmamızın amacı, BH'da muhtemel DNA hasar düzeyini ve bu hasarların tamirinde rol oynayan OGG1 gen ifade düzeyini belirleyerek, BH'nın patogenezinde DNA hasar yanıtının önemini ortaya çıkarmaktır. Yapmış olduğumuz bu çalışmada, OGG1 gen ifade düzeyini gerçek-zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qPZR; qPCR) ile tespit edildi. Oksidatif DNA hasarının göstergesi olan 8-OHdG miktarını ölçmek için ise ELISA yöntemi uygulandı. Çalışmalar, toplam 70 BH ve benzer yaş ve cinsiyetteki 30 sağlıklı kontrolde çalışma gerçekleştirildi. OGG1 mRNA ifade düzeyleri açısından kontrol grubu ile tüm BH grubu karşılaştırıldığında, iki grup arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark gözlemlenmedi (p=0.20). Benzer şekilde kontrol grubu ile D-BH (Derin Ven Tromboz-BH) grubu (p=0.59) ve M-BH (Mukokutanöz BH) grubu (p=0.18) grubu karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı bir fark tespit edilmedi. Diğer yandan, D-BH grubu (0.0040±0006) ile M-BH (0.0024±0.0002) grubu karşılaştırıldığında da iki grup arasında OGG1 mRNA ifade düzeyleri açısından istatistiksel anlamda bir fark tespit edildi (p=0.024); M-BH grubundaki OGG1 ifade düzeyi daha düşük olarak tespit edildi. 8-OHdG düzeylerine bakıldığında kontrol grubu ile tüm BH grubu arasında anlamlı bir fark gözlemlenmedi (p=0.27). Benzer şekilde, kontrol grubu ile karşılaştırıldığında D-BH grubu (p=0.42) ve M-BH grubu (p=0.28) arasında 8-OHdG düzeyi açısından istatistiksel olarak bir fark tespit edilmedi. D-BH grubu ile M-BH grubu arasında da, 8-OHdG düzeyleri açısından anlamlı bir farklılık görülmedi (p=0.85). DNA tamir mekanizmasının Behçet hastalığı ile ilişkisini araştırmış olduğumuz literatürdeki bu ilk çalışma, bu alanda yapılacak birçok çalışmaya yol gösterici olabilir.
Normal ve kanser kromozomlarında histon modifikasyonlarının ı̇mmunfloresan yöntem ile ı̇ncelenmesi
Bir organizmanın genel epigenetik durumu olan epigenom, normal gelişimde genom kadar önemlidir. Epigenetik, DNA dizisinden ziyade kromatin yapı ve organizayonundaki değişiklikler yoluyla meydana gelen gen ifadesindeki kalıtsal değişikliklerin incelenmesidir. Kromatin iki durumda bulunabilir: gevşek, transkripsiyonel olarak aktif ökromatin veya yoğun, transkripsiyonel olarak inaktif heterokromatin. Histon proteinlerindeki kimyasal modifikasyonlar, transkripsiyon faktörlerinin ve enzimlerin DNA ile etkileşime girmesine izin vererek gen ekspresyonunu kolaylaştıran açık ökromatin durumunun veya transkripsiyonun başlamasını önleyerek gen ekspresyonunu baskılayan kapalı heterokromatin durumunun oluşumunu indükleyebilir. Kanser hem genetik, hem de epigenetik mekanizmalardaki düzensizliklerin rol oynadığı karmaşık bir hastalıktır. İmmünofloresan boyama, biyolojik örneklerdeki çeşitli molekülleri tespit etmek ve görselleştirmek için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Bu çalışmanın amacı açık ve kapalı kromozom yapısı oluşturan histon modifikasyonlarının normal ve kanser kromozomlarında immunfloresan yöntemlerle incelemek ve aralarında bu açıdan fark olup olmadığını belirlemektir. Çalışmaya normal kromozom elde etmek için sağlıklı bireyler, kanser kromozomları elde etmek için ise K562 hücre hattı dahil edilmiştir. K562 hücre hattının kromozom yapısı laboratuvardan laboratuvara değişebildiğinden, çalışmaya dahil ettiğimiz K562 hücre hattının karyotipi GTL bantlama ve FISH yöntemi ile belirlenmiştir. Sağlıklı olgular ve K562 hücre hattına ait örneklerden elde edilen kromozomlarda açık kromatin işareti olan H3K27ac ve kapalı kromatin işareti H3K27me3 modifikasyonlarının immunfloresan boyama bant paternleri elde edildi ve her iki modifikasyonun gen açısından zengin bölgelerde yoğunlaştığı görüldü. Hem normal, hem de kanser örneklerinde değerlendirilebilen kromozomlarda (1, 12 ve 19. kromozomlar) immunfloresan bant paternlerinde belirgin bir fark gözlemlenmedi.
Periferik arter hastalığında pelaton geni ile RNA hasarı arasındaki ilişkinin araştırılması
Ateroskleroz; kronik inflamasyon, oksidatif stres, epigenetik ve metabolik disfonksiyonu içeren immüno-metabolik bir hastalıktır. Periferik arter hastalıkları (PAH), koroner arterler ve aort dışındaki arter hastalıklarını ifade etmektedir. PAH'ın ana nedenleri arasında ateroskleroz, vasküler darlık, inflamasyon ve endotelyal fonksiyon bozukluğu bulunmaktadır. Son yıllarda, uzun kodlanmayan RNA (lncRNA)'ların kardiyovasküler hastalıklardaki rolleri önem kazanmıştır. Yapılan çalışmalarda, bir lncRNA olan PELATON ekspresyonunun aterosklerotik plakların nekrotik, inflamatuvar ve makrofajdan zengin bölgelerinde konumlandığı gösterilmiştir. PELATON'un in vitro olarak makrofajlarda yıkımı sonucu, hücrenin fagositoz gerçekleştirme yeteneğinin önemli ölçüde azaldığı bildirilmiştir. Lipoproteinlerin veya eritrositlerin fagositozu, aterom plak ilerlemesinin ayrılmaz bir parçasıdır ve plak instabilitesinin gelişimi ile güçlü bir şekilde ilişkilidir. PELATON gibi fagositozu pozitif olarak düzenleyen bir lncRNA, bu hızı ve plak ilerlemesini azaltmada potansiyel bir hedef olabilir. Çalışmamızın amacı, PAH ve sağlıklı kontrollerde PELATON geninin ekspresyon düzeyini belirlemek ve DNA/RNA'nın oksidatif hasarında rol oynayan belirteçlerden 8-Hidroksi-2′-deoksiguanozin (8-OHdG), 8-hidroksiguanozin (8-OHG) ve 8-hidroksiguaninin plazma düzeylerini tespit etmektedir. Çalışmamızda PAH tanısı alan 100 hasta ve 100 sağlıklı kontrolde gen ekspresyonu düzeyleri Kantitatif Gerçek Zamanlı-Polimeraz Zincir Reaksiyonu (qRT-PCR), DNA/RNA oksidatif hasar düzeyleri ELISA yöntemi ile belirlendi. Çalışmamızda, lncRNA PELATON ekspresyon düzeyi, PAH grubu ve sağlıklı kontrol grubu arasında kıyaslandığında anlamlı bir fark gözlenmedi (p=0.119). 8-OHG, 8-OHdG ve 8-hidroksiguanin düzeyleri iki grup arasında karşılaştırıldığında anlamlı bir fark tespit edilmedi (p = 0.31). PAH grubunda PELATON gen ekspresyonu ile CRP (r=0.024, p=0.83), total kolesterol (r=0.014, p=0.91), LDL kolesterol (r=0.117, p=0.36), kreatin kinaz MB (r= 0.273, p=0.391) düzeyleri arasında pozitif yönde korelasyon saptandı, ancak sonuçlarımız istatistiksel anlamlılık sınırına ulaşmadı. Bu durum sınırlı hasta sayısından kaynaklı olabilir. Çalışmamız, PAH hastalarında PELATON ekspresyonunun gerçekleştirildiği ilk çalışma özelliğini taşımaktadır. Sonuç olarak, PELATON ekspresyonunun PAH hasta grubunda yüksek bulunmasına rağmen istatistiksel anlamlılık sınırına ulaşmaması, PELATON geni ile PAH patogenezi arasında kuvvetli bir ilişki bulunmadığını düşündürmektedir.
Fruktoz ve streptozotocin ile oluşturulan diyabetik sıçan modelinde resveratrolün karaciğer hasarı ve ferroptoz üzerine etkileri
Bu çalışmada %10'luk yüksek fruktoz ile düşük doz streptozotocin (40mg/kg) uygulanarak modifiye Tip 2 diyabet modeli oluşturuldu ve resveratrol tedavisinin olası karaciğer hasarı ve ferroptoz üzerine etkileri araştırıldı. Deney hayvanları ile 4 deney grubu oluşturuldu. Diyabetik grup (F), Resveratrol tedavisi uygulanan diyabetik grup (FR), Resveratrol tedavisi uygulanan kontrol grubu (KR), Sağlıklı kontrol grubu (K). Deneyin sonunda tüm hayvanlar sakrifiye edilerek karaciğerleri alındı. Deney süresince deney gruplarının kan şekeri, günlük kalori alımı ve vücüt ağırlıkları ölçüldü. Karaciğer doku kesitlerine morfolojik değerlendirilmesi için Hematoksilen-Eosin, Prusya Mavisi ve Van Gieson boyamaları, ayrıca SIRT1, COX2, HO-1, GPX4, γH2AX, 4HNE, 8-OHdG, Nrf2 antikorları kullanılarak immünohistokimyasal boyama yapıldı. ALOX5, FASN, GPX4 protein seviyelerinin ve GSH/GSSG oranı biyokimyasal yöntemler ile ölçülerek tüm sonuçlar istatistiksel olarak değerlendirildi. YF grubunda açlık kan şekeri düzeyleri artarken YF-R grubunda açlık kan şekeri düzeyinin azaldı. Deney sonunda YF grubunun vücüt ağırlığında düşüş gözlendi (p≤0.05). Dokuların morfolojik değerlendirilmesinde YF grubunda fibrozis ve demir birikmesi gözlemlenirken YF-R gruplarında ise fibrozisin gerilediği ve demir birikimini gözlenmediği saptandı. İmmünohistokimya sonuçlarından elde edilen verilerde SIRT1 (p<0.0001), GPX4 (p<0.0001) ve Nrf2 (p≤0.05) ekspresyonları YF grubunda kontrol grubuna kıyasla azaldığı anlaşıldı. COX2, HO-1, γH2AX, 4HNE ve 8-OHdG ekspresyonları ise YF grubunda diğer gruplara göre arttığı belirlendi. ELISA sonuçlarına bakıldığında, ALOX5 ve FASN seviyelerinde gruplar arasında anlamlı fark yokken GPX4 seviyeleri YF grubunda diğer gruplara göre daha düşük olduğu anlaşıldı (p≤0.05). GSH/GSSG testinde ise bu proteinin düzeylerinin kontrol gruplarına göre YF (p<0.01) ve YF-R (p<0.001) gruplarında arttığı saptandı. Çalışmada yüksek fruktoz diyeti ve düşük doz STZ uygulamasının kan şekeri düzeylerini artırdığı, oksidatif stresi uyararak karaciğerde fibrozise, demir birikimine, hücrelerde DNA hasarına ve ferroptoz yolağında görevli proteinlerin ekspresyonunda artışa neden olarak karaciğer hasarına yol açtığı saptandı. Resveratrol uygulamasının kan şekeri düzeylerini düşürdüğü, oksidatif stres üzerinde olumlu etki yaptığı ve hepatositlerde demir birikimini önleyerek karaciğer dokusunu ferroptozdan koruduğu gözlendi.
JAK2+ kronik miyeloproliferatif neoplazi'li ve JAK2+ sekonder miyelofibroz'a dönüşümü olan hastalarda miRNA'ların incelenmesi
Kronik Miyeloproliferatif Neoplaziler (KMPN), olgun miyeloid hücrelerin çoğalması ve kemik iliği fibrozunun gelişmesi ile karakterize olan klonal hematopoetik bozukluklardır. KMPN'ler Philadelphia kromozomu negatif Esansiyel Trombositemi (ET), Polisitemi Vera (PV), Primer Miyelofibroz (PMF) gibi hastalık gruplarını içerir. Klinik olarak yaşlı hastalarda daha belirgindir, ET, PV, PMF için ortalama tanı yaşı 53-60 arasıdır. KMPN hastalarının %90'dan fazlasını oluşturan ortak özellikleri Janus Kinaz 2 (JAK2), Kalretikülin (CALR) veya trombopoietin reseptörünü (TPOR, MPL) kodlayan genlerde sürücü mutasyonların bulunmasıdır. KMPN türü olan PV ve ET zamanla Sekonder Miyelofibroza (SMF) dönüşebilir. Fibrotik dönüşüm PV ve ET'de sırasıyla %12-21 ve %9-10 oranlarında görülür. SMF'yi tanımlayan klinik özellikler arasında ileri yaş, lökositoz, anemi gelişimi, yüksek LDH seviyeleri, splenomegali, ASXL1 mutasyonları ve JAK2V617F alel mutasyonu gibi çeşitli faktörler bulunabilir. Yapılan çalışmalarda epigenetik mekanizmaların, özellikle miRNA'ların KMPN gelişiminde rolü olduğu gösterilmiştir. Çalışmamızda miR-135a-5p'nin JAK2 pozitif (JAK2+) olan KMPN'lerin SMF'ye dönüşümündeki etkisini araştırmayı hedefledik. İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa, Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Hastanesinde Hematoloji Polikliniği'ne başvuran ve KMPN tanısı konan 40 hastanın kan örnekleri ve kontrol grubu olarak yaş ve cinsiyet uyumlu 10 sağlıklı bireyin kan örnekleri kullanıldı. Periferik kandan plazma izolasyonunu takiben miRNA izolasyonu yapıldı, elde edilen örnekler cDNA'ya dönüştürüldükten sonra miRNA-135a-5p'nin ifadesi gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (GZ-PZR) yöntemi ile analiz edildi. Çalışmamız sonucunda miR-135a-5p ifadesinin PV'li hastalarda kontrollere oranla %43, ET+PV'li hastalarda ise yaklaşık %50 arttığını, bu hastalarda miR-135a-5p'nin bir onkomiR gibi davrandığını gösterdik. Son olarak, miR-135a-5p ifadesinin PV'li hastalarda sigara (p=0,056) ve glukoz seviyeleri(p=0,021) ilişkili olduğunu gösterdik. Sigara içindeki zararlı maddeler ve glukoz seviyeleri miRNA ifadesini etkileyip kanser oluşumunu destekliyor olabilir.
Yüksek karbohidrat diyet ile beslenen sıçanlarda delta 9-tetrahidrokannabinolün kolon dokusu üzerine etkileri
Yüksek karbohidratlı diyetin enerji dengesi üzerindeki zararlı etkisi metabolik hastalıkların gelişmesine ve ilerlemesine yol açmaktadır. İşlevsiz insülin salgılanması hiperinsülinemi (HI) olarak bilinen metabolik bir bozukluğa neden olmaktadır. Araştırmacılar delta 9- tetrahidrokannabinolün (THC) metabolik bozukluklarda terapötik bir ajan olarak kullanılabileceğini bildirmişlerdir. Bu çalışmanın amacı, THC uygulanan Sprague-Dawley sıçan kolon dokusunda yüksek karbohidratlı diyetle ilişkili oksidatif stres, inflamasyon, apoptoz ve kannabinoid reseptörlerinin moleküler mekanizmalarına açıklık getirmektir. Her grupta 7 sıçan olmak üzere toplam 28 adet erkek sıçan, kontrol (K), HI, THC uygulanan K (THC) ve THC uygulanan HI (HI+THC) gruplarına ayrıldı. HI sıçan modeli 12 hafta boyunca içme suyuna %10 fruktoz katılarak oluşturuldu. Deneyin son dört haftasında HI+THC ve THC gruplarındaki sıçanlara intraperitoneal yolla 1.5 mg/kg/gün THC uygulandı. Bu çalışmada, biyokimyasal analizler ile glutatyon seviyesinin HI grubuna göre HI+THC grubunda arttığını bulduk fakat malondialdehit, protein karbonil, katalaz, glutatyon-Stransferaz gibi diğer reaktif oksijen türlerinde önemli bir değişiklik saptanmadı. Kannabinoid reseptörleri, inflamasyon ve apoptoz belirteçlerini tespit etmek için qRT-PCR metodu uygulandığında, G proteinine bağlı reseptör 55 (Gpr55), tümör nekroz faktör-α, nükleer faktör- κB, kaspaz-3, kaspaz-8 ve kaspaz-9 mRNA ifadelerinin HI'ye göre HI+THC grubunda önemli ölçüde arttığı bulundu. Sonuç olarak THC'nin yüksek karbohidrat ile beslenen sıçan kolon dokusunda antioksidan, inflamatuvar ve apoptotik özelliklerinin yanı sıra GPR55 reseptörü üzerinden etki ettiğini söyleyebiliriz.
3 boyutlu (3B) biyoyazıcı ile cilt dokusu modelinin geliştirilmesi ve yara iyileşmesiyle ilgili bazı genlerin ifade düzeylerinin karşılaştırılmalı olarak değerlendirilmesi
Oldukça karmaşık bir süreç olan yara iyileşmesindeki gen ifadelerinin düzeylerindeki değişimleri analiz etmek hem mekanizmaları ortaya çıkarmak hem de yaraların tedavisinin değerlendirilmesinde önem teşkil etmektedir. Son yıllarda 3 boyutlu biyoyazıcı teknolojileri ile in vitro cilt modellerinin geliştirilmesi in vivo yaklaşımlara önemli bir alternatif oluşturmuştur. Ancak gen ifade değişikleri açısından bu tekniklerin verilerinin in vivo çalışmalardan elde edilenlerin yerini ne kadar tutabileceği yönünde çalışmalara ihtiyaç duyulmaktadır. Bu doğrultuda çalışmamızda 3 boyutlu (3B) biyoyazıcı teknolojisi kullanılarak geliştirilen cilt yara modellerinin, in vivo çalışmalar için bir değerlendirme kriteri olarak kullanılan gen ifadelenmesi düzeyleri ile ne kadar taklit edebileceği araştırılmıştır. Bu amaçla öncelikle 3 boyutlu biyoyazıcı kullanılarak oluşturulan iki katmanlı cilt modeli oluşturulmuş ve oluşturulan çizik modeli sonrası iyileşme sürecinin 0, 3, 7 ve 10. günleri örnekler alınarak, histolojik ve yara iyileşmesi ile ilişkilendirilmiş ve yara iyileşme sürecin farklı evrelerinde ifade düzeylerinin değiştiği bilinen 7 kritik genin (KRT6A, KRT16, KRT17, KRT1, KRT10, COL1A1 ve IL-6) ifade düzeyleri gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu ile değerlendirilmiştir. Elde edilen veriler aynı zamanda literatürde yer alan yara iyileşmesi ile ilgili in vivo ve in vitro çalışmalar ile karşılaştırılmıştır. Histolojik bulgularımız 3 boyutlu cilt modelinin başarı ile oluştuğunu, moleküler bulgularımız ise ilgili genlerin ifade düzeylerinin yara iyileşme sürecinde günlere göre farklı değişim gösterdiğini ortaya koymaktadır. Literatür karşılaştırmamız, 3 B cilt yara modelinin in vivo hayvan modeli ile büyük ölçüde uyumlu olduğunu ortaya koymaktadır. Ancak çalışmanın tek bir yara modeline kısıtlı olması da dikkate alınarak, farklı yara modellerinin de değerlendirildiği ilişkili çalışmaların sayısının artırılması ile hayvan modellerine olan bağımlılığı azaltarak daha etik ve etkili in vitro modellerin geliştirilmesine mümkün olabileceğini umuyoruz.
Ekstraselüler matriksin hücre yaşlanması üzerindeki etkisinin hücre kültürü temelli modelle değerlendirilmesi
İnsan diploid fibroblastları, büyümenin durması, morfolojideki değişiklikler ve değişmiş gen ifadesi ile karakterize edilen replikatif senesens durumuna girmeden önce sonlu sayıda hücre bölünmesini tamamlama kapasitesine sahip olup, bu süreçte ekstraselüler matris (ECM) ile etkileşim, hücrelerin yaşlanma ve senesens sürecine girmelerinde önemli bir rol oynamaktadır. Hücre yaşlanmasının altında yatan biyolojik süreçlerin anlaşılması, doku mühendisliği ve yaşlanmaya karşı geliştirilen tedavi yöntemleri için kritik bir öneme sahiptir. Ancak, yaşlanma sürecinde çevresel faktörlerin etkisi ve özellikle hücresel mikroçevrenin bu süreçteki rolü henüz tam olarak aydınlatılamamıştır. Bu bağlamda, yaşlı hücreleri görünüşte genç bir duruma geri döndürmek için genç dermal dokudan gelen ekstraselüler matris (ECM) ile etkileşimin senesens sürecini tersine çevirdiği öne sürülmüş ve ayrıca, yaşlı ECM'nin genç hücreler üzerindeki etkisi de ek olarak incelenmiştir. Bu çalışmada, üç boyutlu biyoyazıcı teknolojisi kullanılarak üretilmiş hücresizleştirilmiş ECM (dECM) modeli yardımıyla fibroblast hücrelerinin yaşlanma süreci incelenmiştir. Çalışmamızda, fibroblast hücrelerinin yaşlanma sürecini daha doğal bir hücresel mikroçevrede gözlemlemek amacıyla üç boyutlu kültür modeli kullanılmıştır. Bu model, hücrelerin in vivo benzeri bir ortamda yaşlanma mekanizmalarını daha gerçekçi bir şekilde incelemeye olanak tanımıştır. Genç ve yaşlı sıçan derisinden elde edilen dECM, yaşlı ve genç hücrelerle birlikte kullanılarak ECM'nin biyokimyasal özelliklerinin yaşlanma üzerindeki etkisi araştırılmıştır. Bu kapsamda, dECM'nin kimyasal yapısı Fourier dönüşümlü kızılötesi spektroskopi (FTIR) ve DNA miktarı ölçümü ile doğrulanmış, yaşlanmaya etki eden SIRT1, p53, GLB1, COL1A1, NF-κB ve MMP1 gibi genlerin ekspresyon seviyeleri, 0, 3, 7 ve 10. günlerdeki örneklerden alınan verilerle gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PZR) kullanılarak analiz edilmiştir. Çalışmanın sonuçları, dECM'nin yaşlı hücrelerin bazı genç fenotip özelliklerini geri kazanabilme kapasitesine sahip olduğunu ve ECM'nin genç özelliklerinin yaşlanmış hücrelere aktarılabileceğini göstermiştir. Bu bulgular, ECM'nin yaşlanmayı yavaşlatma veya kısmen tersine çevirme potansiyeli üzerine yeni bir bakış açısı sunarak, hücre-mikroçevre etkileşimlerinin yaşlanma sürecine etkisini ortaya koymaktadır. Çalışmamız, ECM'nin hücre yaşlanması üzerindeki etkilerini açıklayarak, doku mühendisliği ve rejeneratif tıp alanında yaşlanma karşıtı stratejilere katkı sağlayacak veriler sunmaktadır.
Aterosklerozlu hastalarda uzun kodlayıcı olmayan RNA coromarker ile okside LDL kolesterol düzeyleri arasındaki ilişkinin araştırılması
Ateroskleroz; kronik inflamasyon, oksidatif stres ve metabolik fonksiyon bozukluğunu içeren immüno-metabolik bir hastalıktır. Aterosklerozun karmaşık patolojik ilerleyişinde potansiyel biyobelirteçlerin bulunması, aterosklerozun önlenmesi ve tedavisi için büyük önem taşımaktadır. Çalışmalar, ateroskleroz ile epigenetik mekanizmalar arasında kuvvetli bir ilişki olduğunu göstermektedir. Dolaşımdaki lncRNA'lar ve ateroskleroz gelişimi arasındaki ilişkilere odaklanan çalışmalar giderek önem kazanmaktadır. Ayrıca ateroskleroz gelişiminde inflamatuvar süreçler ile LDL oksidasyonu arasında bir ilişki bulunmaktadır. Çalışmamızda, CoroMarker (AC100865.1) geninin ateroskleroz gelişim süreçlerindeki rolü ile okside LDL kolesterol düzeyleri arasındaki ilişkinin araştırılması amaçlanmıştır. Aterosklerozlu hastalarda (n=50 koroner arter hastalığı (KAH), n=44 periferik arter hastalığı (PAH)) ve sağlıklı kontrollerde (n=97) uzun kodlayıcı olmayan RNA CoroMarker geninin ekspresyon düzeyleri kantitatif Gerçek Zamanlı-Polimeraz Zincir Reaksiyonu (qRT-PCR), plazma ox-LDL düzeyleri Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) yöntemleri ile belirlendi. Çalışmamızda, lncRNA CoroMarker geninin ekspresyon düzeyleri hasta ve kontrol grupları arasında karşılaştırıldığında hasta grubunda kontrol grubuna kıyasla yüksek bulundu ancak istatistiksel anlamlılık sınırına ulaşamadı (p=0,32). Hasta ve kontrol grupları arasında ox-LDL düzeyleri karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunmadı (p=0,189). CoroMarker gen ekspresyon düzeyleri hasta ve kontrol gruplarında cinsiyet değişkenine göre karşılaştırıldığında hem kontrol hem de hasta grubunda istatistiksel olarak anlamlı bir sonuç bulunamadı (p>0,05). Hasta grubunda CoroMarker gen ekspresyon düzeyleri ile ox-LDL arasında pozitif yönlü, zayıf bir korelasyon olduğu tespit edildi, ancak sonuçlar istatistiksel olarak anlamlılık sınırına ulaşamadı (rs=0.06, p=0,71). CoroMarker gen ekspresyonu ile açlık kan şekeri düzeyleri karşılaştırıldığında düşük düzeyde pozitif yönlü bir korelasyon tespit edildi ancak istatistiksel anlamlılık sınırına ulaşamadı (rs=0,18, p=0,086). Hasta grubunda ox-LDL ile HDL-kolesterol düzeyleri arasında ters yönde, orta düzeyde ve anlamlı bir korelasyon olduğu gözlendi (rs=- 0.421, p=0,009). Araştırma sonucunda aterosklerozlu hasta grubunda sağlıklı kontrollere göre lncRNA CoroMarker ekspresyon düzeyinin yüksek olmasına rağmen istatistiksel anlamlılık sınırına ulaşamaması, lncRNA CoroMarker ile hastalık etiyolojisi arasında zayıf bir ilişki olduğunu düşündürmektedir. Bulguların anlamlı olmaması, sınırlı örneklem büyüklüğü ve hasta grubunda kolesterol düşürücü ilaç kullanımının etkisiyle açıklanabilir.
Prostat kanserinde ner tamir mekanizması enzim ifade değişimlerinin incelenmesi
Prostat kanseri, erkeklerde en sık görülen malignitelerden biri olup kansere bağlı ölümler arasında ikinci sırada yer almaktadır. Prostat kanserinin patogenezinde genetik ve epigenetik değişimlerin yanı sıra DNA hasar onarım mekanizmalarındaki bozukluklar önemli bir rol oynamaktadır. Bu mekanizmalardan biri olan nükleotid eksizyon tamiri (NER), UV ışınları, kimyasal ajanlar ve sigara dumanı gibi çevresel etkenlerin neden olduğu geniş çaplı DNA hasarlarını onarır. NER mekanizmasında görev alan ERCC2 ve ERCC5 proteinleri, DNA onarım sürecinde merkezi roller üstlenmektedir. ERCC2 geni, DNA'nın hasarlı bölgesini açan bir helikazı kodlarken, ERCC5 geni, hasarlı DNA'nın kesilmesini sağlayan bir endonükleazı kodlar. Bu çalışmada, prostat kanseri hastaların tümörlü ve normal dokularında ERCC2 ve ERCC5 gen ifadeleri incelenmiştir. Çalışmada toplam 50 hastadan alınan ve pataoljik olarak teyit edilen biyopsi örnekleri RT-PCR yöntemiyle analiz edilmiştir. Elde edilen bulgulara göre, ERCC2 gen ifadesi tümör dokusunda normal dokulara kıyasla 2,25 kat artış göstermiş, ancak bu artış istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır (p=0.12). ERCC5 gen ifadesi ise tümör dokusunda normal dokulara göre anlamlı bir şekilde artış göstermiş (p=0.005) ve bu artış 5,94 kat olarak hesaplanmıştır. Ayrıca, ERCC2 ve ERCC5 gen ifadeleri arasında istatistiksel olarak anlamlı bir korelasyon tespit edilmemiştir. Sigara kullanımı, diyabet, hipertansiyon, nodül varlığı, Gleason skoru ve PIRADS skoru gibi klinik değişkenlerin gen ifadeleri üzerinde herhangi bir etkisinin olmadığı gözlemlenmiştir. Sonuç olarak, prostat kanserinde ERCC5 geninin yüksek ifadesi, NER yolağının bu hastalıkta önemli bir role sahip olduğunu ve ERCC5'in potansiyel bir biyobelirteç olarak değerlendirilebileceğini göstermektedir. Çalışmamızın, DNA tamir mekanizmalarının prostat kanseri gelişimindeki rolünü anlamaya yönelik literatüre katkı sağlayacağı düşünülmektedir.
Lucilia sericata ekstraktının biyokararlılığı ve biyolojik etkileri üzerine farklı ortam şartlarının etkilerinin değerlendirilmesi
Lucilia sericata sineğinin larvaları, iyileşmesi zor ve kronik yaraların tedavisinde etkili bir yöntem olarak kullanılmaktadır. Larvaların salgılarında bulunan bileşikler, nekrotik dokuları eritmekte, mikroorganizmaların üremesini engellemekte ve doku granülasyonunu teşvik ederek yara iyileşmesini hızlandırmaktadır. Ancak, canlı larva kullanımı bazı hastalarda rahatsızlık yaratabileceğinden, larvaların izotonik çözeltiye bıraktıkları salgılar da tedavide kullanılabilmektedir. Bununla birlikte, taze larva salgılarına erişim zorluğu, önceden elde edilen ve saklanabilen salgı materyallerine olan ihtiyacı artırmaktadır. Literatür incelemeleri, yaygın olarak kullanılan bazı saklama koşullarının, salgının biyokararlılığı ve biyolojik etkileri üzerindeki sonuçlarının tam olarak bilinmediğini ortaya koymaktadır. Bu tez çalışmasında, Lucilia sericata 1. evre larvalarından elde edilen salgıların, +4°C ve -20°C'de 24 ve 48 saat boyunca saklanmasının biyokararlılığı ve biyolojik aktiviteleri üzerindeki etkileri değerlendirilmiştir. Çizme deneyi kullanılarak 3T3 murin fibroblast hücreleri üzerinde yapılan yara iyileştirme aktivitesi ölçümleri, -20°C'de 48 saat boyunca saklanan salgının, +4°C'de ve oda sıcaklığında muhafaza edilen salgılara kıyasla daha etkili olduğunu göstermiştir. Ayrıca, -20°C'de 48 saat saklanan salgının, 24 saat saklanan salgıya göre daha başarılı olduğu tespit edilmiştir. FTIR yöntemiyle yaptığımız ön değerlendirme sonuçları, stabilite bulgularımızın biyolojik etkinlik bulgularıyla uyumlu olduğunu ortaya koymaktadır. Bulgularımız, değerlendirilen saklama koşullarının etkilerini açığa çıkarırken, diğer saklama koşullarının etkilerinin ve çalışmamızda gözlenen bazı sonuçların daha iyi anlaşılması için ileri araştırmalara ihtiyaç duyulduğunu göstermektedir.
Meme kanserinde ETV5 geninin östrojen reseptör (ER) ile ilişkisi
Meme kanseri, dünya çapında kadın sağlığı için ciddi bir tehdit oluşturmakta ve en sık rastlanan kanser türlerinden biri olarak kabul edilmektedir. Her sekiz kadından birinin hayatının belli bir döneminde bu hastalıkla karşılaşma riski vardır. Meme kanseri, akciğer kanserinden sonra kadınlarda ikinci en yüksek ölüm oranına sahip kanser türüdür. Ancak, erken teşhis ve müdahale, tedavi başarısını önemli ölçüde artırabilir. Bu çalışma, meme kanserinin moleküler patogenezinde kritik bir rol oynayan E26 transformation-specific (ETS) transkripsiyon faktörleri ailesi üzerine odaklanmaktadır. Bu faktörler, hücre büyümesi, farklılaşma ve gelişim gibi temel biyolojik süreçlerde etkili olup, kanser gelişimi ve ilerlemesi üzerinde önemli etkilere sahiptir. ETS faktörleri arasında yer alan ETV5 geni, hücre büyümesi ve farklılaşmasında önemli roller üstlenmektedir. Meme kanseri dahil olmak üzere çeşitli kanser türlerinde ETV5 gen ifade düzeylerindeki değişiklikler, hastalığın seyri ve prognozu açısından değerli bilgiler sunabilir. Bu çalışma, ETV5 gen ifadesinin östrojen reseptörü (ER) pozitif (ER+) ve üçlü negatif meme kanseri (TNBC) dokularında farklılık gösterip göstermediğini araştırmaktadır. İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa Tıbbi Patoloji Anabilim Dalında saklanan invaziv duktal meme karsinomu dokuları kullanılarak ETV5 gen ifade düzeyleri, gerçek zamanlı polimeraz zincir tepkimesi (GZ-PZT) yöntemiyle ölçülmüştür. Sonuçlar ETV5 ifadesinin meme kanseri dokularında normal meme dokularına kıyasla önemli ölçüde azaldığını ortaya koymuştur. Ayrıca, ETV5 ifadesi, ER (+) meme kanseri dokularında TNBC dokularına kıyasla daha düşük bulunmuştur. Bu bulgular, ETV5 geninin ER (+) meme kanserinde bir onkogen olarak değil, aksine bir tümör baskılayıcı gen olarak işlev görebileceğini düşündürmektedir, ancak bu etki TNBC kanserlerde görülmemektedir. Yani, ER varlığı, ETV5 ifadesini azaltıyor olabilir. Bu da bir transkripsiyon faktörü olan ETV5'in reseptörü kodlayan genlerle ilişkili olabileceğini düşündürebilir. ETV5 ifadesindeki azalma; transkripsiyonel düzenleme, tümör mikroçevresinin etkileri, kanser hücrelerinin moleküler özellikleri ve post-transkripsiyonel süreçler gibi çeşitli faktörlere bağlı olabilir. Anahtar kelimeler: ER pozitif, üçlü negatif, meme kanseri, duktal karsinom
Amfiregülinin melanom gelişimindeki rolü
Melanom, iklim değişikliği ile birlikte insidansı hızla artan en agresif deri kanseri türüdür. Mevcut tedavi stratejilerine karşı direnç geliştirmesi nedeniyle melanomun gelişim mekanizmasını açıklamak ve alternatif moleküler hedefler bulmak önemlidir. EGFR ligandlarından biri olan amfiregülin (AREG)'in birçok kanser türünde onkogenik bir aktivite gösterdiği tespit edilmiştir. Bununla birlikte AREG'in melanom gelişim mekanizmasına etkisi henüz detaylandırılmamıştır. Bu nedenle çalışmada, AREG'in canlılık, çoğalma, inflamasyon, hücre hareketliliği ve hücre ölümü üzerindeki etkilerinin CRISPR-Cas9 metodu ile AREG proteini baskılanmış B16F10 ve normal B16F10 hücrelerinde araştırılması amaçlandı. Bu hücrelere canlılık analizi ve akridin oranj/etidyum bromür boyaması yapıldı, hücre çoğalması ise tripan mavisi ile analiz edildi. İnvazyon için Boyden chamber ve hücre göçü için yara iyileşmesi deneyi yapıldı. CRISPR-Cas9 ile AREG geninde meydana getirilen nükleotit değişiklikleri SANGER dizileme ile incelendi ve AREG gen ifadesi kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PZR), protein ifadesi ise immünositokimya yöntemi ile değerlendirildi. Apoptoz; kaspaz-3,-8,-9 ile, inflamasyon; interlökin 6 (IL-6), tümör nekroz faktör-alfa (TNF-α) ve nuklear faktör kappa B ile; hücre hareketliliği, matriks metalloproteinaz (MMP) -2 ve -9 ile qRT-PZR yöntemi kullanılarak değerlendirildi. Ayrıca MMP-2 ve MMP-9 enzim aktiviteleri jelatin yıkım analizi ile incelendi. Bulgularımız, CRISPR-Cas9'un nükleotit değişikliklerine neden olarak AREG'in gen ve protein ifadesini baskıladığını gösterdi. AREG'in baskılanması melanom invazyonunda ve göçünde rol alan MMP-2 ve -9, inflamasyonunda rol alan TNF-α ve IL-6'yı azalttı. Ayrıca, kaspaz-3, -8 ve -9 gen ifadelerinin artması apoptoz ile hücre ölümünü destekledi. Sonuç olarak melanom hücrelerinde CRISPR-Cas9 ile AREG'in baskılanması canlılığı, çoğalmayı, inflamasyonu ve hücre hareketliliğini azaltıcı, apoptozu ise artırıcı etki göstermiştir. Bu nedenle AREG'in melanom tedavisinde etkili bir terapötik hedef olarak değerlendirilebileceği öngörülmektedir.
Vitamin D'nin akson gelişiminde ve rejenerasyonundaki rolünün incelenmesi
Merkezi sinir sisteminde akson rejenerasyonunun kontrolü nörobiyolojide çözülmemiş bir sorun olarak kalmıştır. Primer nöron kültürü, nöronal polarizasyon, nörit büyümesi, akson rehberliği (yol bulma), sinaptogenez ve nöronal ağ oluşumu gibi MSS gelişiminin yanı sıra nöronal olgunlaşma ve fonksiyonel aktiviteyi incelemek için altın standart olarak kabul edilmektedir. Literatürde vitamin D'nin MSS'de akson rejenerasyonu üzerine etkisini gösteren sınırlı sayıda çalışma bulunmaktadır. Uygun nörotrofik faktörler ile akson ve nöronların uyarılması yoluyla MSS aksonlarının rejenerasyonunun bir dereceye kadar teşvik edilebildiği gösterilmiştir. Çalışmamızda primer nöron kültüründe nöronların olgunlaşma sürecini temsil eden kültürün 1. ile 7. günleri arasında vitamin D'nin nöronal gelişim üzerindeki etkileri değerlendirilmiştir.Vitamin D'nin rejeneratif süreçler üzerindeki etkisi ise, 7. günden itibaren olgun nöron fenotipi kazanan ve yetişkin nöronlarla benzer özellikler sergileyen hücreler üzerinde incelenmiştir. Bu doğrultuda elde ettiğimiz sonuçlar; nöronal gelişim sürecinde uygulanan vitamin D'nin nörit uzunluğunu, nörit uzama hızını ve dinamik mikrotübül yoğunluğunu artırdığını; DLK-MAPK sinyal yolağında görev alan DLK proteininin seviyesini yükselttiğini, buna karşılık DCX ve fosforile DCX (pDCX) protein seviyelerini ise azalttığını gösterdik. Bununla birlikte nöronal gelişim, aksonal yol bulma ve sinaptik plastisite gibi süreçlerde işlev gördüğü bilinen GAP43, STMN2 ve 14-3-3 zeta/delta protein seviyelerinde de vitamin D uygulamasına bağlı bir artış gözlemledik. Ayrıca, vitamin D uygulamasını takiben vitamin D reseptörü (VDR) ile DLK ve STMN2 proteinlerinin bir arada bulunabileceğini gösterdik. Aksonal hasar sonrasında gerçekleştirilen rejenerasyon deneylerinde ise, vitamin D'nin, rejeneratif süreçler ile ilişkili GAP43 ve STMN2 proteinlerinin ekspresyon düzeylerini arttırdığını belirledik. Bulgularımız, vitamin D'nin yalnızca gelişimsel süreçlerde değil, aynı zamanda rejeneratif yanıtların düzenlenmesinde de etkin bir rol oynayabileceğini göstermektedir.
Pankreas kanseri hücrelerine lifirafenib uygulaması ile hücre ölüm yolaklarının değerlendirilmesi
Pankreatik duktal adenokarsinom (PDAC), kötü prognoz ile ilişkilendirilen metastatik bir kanser türüdür. PDAC gelişimi, onkogenlerde ve tümör baskılayıcı genlerdeki somatik mutasyonlarla ilişkilendirilmiştir. Özellikle Kirsten RAS genindeki (KRAS) mutasyonlar, pankreas kanseri hastalarının yaklaşık %95'inde görülmektedir. Epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) ve KRAS gibi onkogenleri baskılamak amacıyla geliştirilen ve klinik faz çalışmaları devam eden inhibitörlerden biri olan lifirafenib bu çalışmanın odak noktasını oluşturmuştur. Ayrıca lifirafenib apoptoz, asidoz, hipoksi gibi koşulların kanser tedavilerine karşı direnç geliştirmesiyle bağlantılıdır. Bu nedenle hipoksiye bağlı tümör mikroçevresi ile ilişkili moleküler hedeflerin araştırılması büyük önem taşımaktadır. Karbonik anhidraz9 (KA9), hipoksiye ve asidoza karşı gelişen adaptasyonlarda görev alan, kanser gelişiminde rol oynayan bir hücre yüzey glikoproteinidir. Bu çalışmada, lifirafenib'in Panc02 hücrelerine olan etkilerini inceleyerek, alkaliptoz ve apoptoz ile ilişkili gen ifadelerini değerlendirip, pankreas kanserinde tedavi ajanı olarak kullanılabilmesi için moleküler mekanizmasına açıklık getirilmesi amaçlandı. Apoptoz ve alkaliptoz belirteçlerini tespit etmek için gerçek zamanlı kantitatif polimeraz reaksiyonu (qRT-PZR) ve immünositokimya (ICC) yöntemleri uygulandı. Farklı dozlarda uygulanan lifirafenib Panc02 hücrelerinin canlılık oranlarını %50'den fazla düşürdü. qRT-PZR sonuçlarında apoptoz belirteçlerinde düşüş saptanırken, protein düzeylerinde kontrol grubuna göre artmış olduğu bulundu. Sonuç olarak lifirafenib'in Panc02 hücrelerini programlı ve programsız olarak ölüme götürdüğünü ve protein düzeyinde farklı ölüm yollarını aktive ettiğini söyleyebiliriz. Bu bulgular, hedefe yönelik tedavi yaklaşımlarının pankreas kanseri yönetiminde umut vadettiğini göstermektedir.
Prematür kromozom kondensasyonuyla elde edilmiş interfaz kromozomları ile mitotik kromozomlardaki histon modifikasyonlarının immünfloresan yöntemle incelenmesi
DNA dizisini değiştirmeden gen ekspresyonunu düzenleyen ve hücre bölünmelerinde kalıtılabilen "Epigenetik" değişimler; DNA metilasyonu, posttranslasyonel histon modifikasyonları ve kodlamayan RNA'lar aracılığıyla meydana getirilir. Histon modifikasyonları, immünfloresan yöntemlerle spesifik antikorlar kullanılarak kromozomlar üzerinde gösterilebilmektedir. Sitogenetik tekniklerle epigenetik çalışmaları birleştiren, dolayısıyla "Sitoepigenetik" olarak adlandırılabilecek bu yöntemlerle metafaz kromozomları üzerinde yapılan –az sayıda- çalışma bulunmakla birlikte, PCC yöntemiyle elde edilmiş interfaz kromozomlarında henüz bu tür çalışmalar bildirilmemiştir. PCC, kalikulin A gibi fosfataz inhibitörleri kullanılarak interfazda kromozom elde edilebilmesini sağlayan bir yöntemdir. Sağlıklı yetişkin gönüllülerden elde edilen izole lenfositler üzerinde gerçekleştirilen bu çalışmada H3K79me2 ve H3K27me3 histon modifikasyonları spesifik antikorlar kullanılarak hem metafaz, hem de PCC yöntemiyle elde edilmiş interfaz kromozomları üzerinde gösterilmiştir. İnterfaz ve metafaz kromozomları elde etmek için yapılan kültürlerin çıkış aşamasında asitli fiksatifler içermeyen ve histon proteinlerini koruyan yöntemler kullanılarak kromozom yaymaları yapılmıştır. Hazırlanan preparatlara, seçilen histon modifikasyonlarına özgü antikorlarla immunofluoresan yöntem uygulanmış ve preparatlar floresan mikroskobunda incelenmiştir. H3K79me2 ve H3K27me3 modifikasyonlarının hem interfaz, hem de metafaz kromozomları üzerinde özgün bant desenleri sergilediği gösterilmiştir. H3K27me3 ve H3K79me2 modifikasyonlarına özgü bant paternlerinin genel olarak birbirlerine benzer olduğu ve PCC ve metafaz kromozomlarında genellikle değişmediği tespit edilmiştir. Ancak PCC kromozomlarının interfaz kromatininin histon modifikasyon paternini koruyup korumadığını anlamak için farklı modifikasyonları hedef alan çalışmalar yapılması gerekmektedir. Çalışmamız, interfaz kromatininindeki histon modifikasyonlarını tek hücre düzeyinde ve kromozomlar üzerinde gösteren ilk çalışmadır ve hücre döngüsü ile hücre farklılaşma mekanizmalarının epigenetik altyapısının aydınlatılmasına katkı sağlayacaktır.
Yüksek moleküler ağırlıklı hyaluronik asit ile uyarılmış WWOX''un baş ve boyun kanserindeki rolünün araştırılması
Bu tez çalışmasında, yüksek moleküler ağırlıklı hyaluronik asit (HMW-HA)'in baş ve boyun kanserindeki biyolojik etkileri ve bu etkinin tümör baskılayıcı WWOX geni ile ilişkisi araştırılmıştır. SCC-25 kanser ve HET-1A normal hücre hatlarında yapılan uygulamalarda, HMW-HA'nın hücre canlılığı, sitotoksisite, apoptoz göstergeleri ve hyaluronidaz (HYAL1) düzeyleri üzerindeki etkileri analiz edilmiştir. Moleküler yerleştirme çalışmaları ile HMW-HA'nın WWOX proteini ile olası bağlanma bölgeleri belirlenmiş; RT-qPCR ve Western blot analizleri ile WWOX ve ilişkili genlerin ifade düzeyleri değerlendirilmiştir. Bulgular, HMW-HA'nın WWOX ifadesini artırdığını ve bazı apoptozla ilişkili genlerin ifadesini değiştirdiğini göstermiştir. Bu sonuçlar, HMW-HA ve WWOX'un birlikte hedeflenmesinin baş ve boyun kanserlerinde potansiyel bir tedavi stratejisi olabileceğine işaret etmektedir.
Asendan aort anevrizmalı hastalarda lncRNA LUCAT1 ekspresyonu ile inflamasyon belirteçleri arasındaki ilişkinin araştırılması
Aort anevrizmaları, aort duvarının zayıflamasından kaynaklanan ve aortun ≥%50 (1,5 kat) anormal genişlemesine yol açan ciddi damar hastalıkları olup aort diseksiyonu gibi hayatı tehdit eden komplikasyonlara yol açabilmektedir. Aort anevrizmalarının başlıca nedenleri arasında sigara kullanımı, beyaz ırk, erkek cinsiyet, aile öyküsü, hipertansiyon, hiperlipidemi, biküspid aort valfi yer almaktadır. Diğer nedenler arasında ateroskleroz, travma, bağ dokusu bozuklukları, enfeksiyonlar ve inflamatuvar hastalıklar yer almaktadır. Son yıllarda lncRNA'lar kardiyovasküler hastalıkların gelişiminde önem kazanmıştır. LncRNA LUCAT1, sitoplazmada transkripsiyon sonrası ve translasyonel süreçlerin düzenleyicisi olarak tanımlanırken, çekirdekteki varlığı epigenetik ve transkripsiyonel düzenlemedeki rollerle ilişkilendirilmiştir. Aort anevrizmalarının gelişiminde yer alan inflamatuvar süreçler, LUCAT1'in ekspresyonunu etkileyerek hastalığın ilerlemesine katkıda bulunabilmektedir. Ayrıca, LUCAT1 vasküler düz kas hücrelerinin fenotipik değişiminin düzenlenmesinde rol oynamaktadır. Çalışmamızın amacı, asendan aort anevrizması (AsAA) olan hastalarda ve sağlıklı kontrollerde lncRNA LUCAT1'in ekspresyon düzeylerini ve inflamatuvar sitokinlerden IL-6 ve TNF-α'nın plazma düzeylerini belirlemektir. Çalışmamızda AsAA tanısı alan 56 hasta ve 74 sağlıklı kontrolde LUCAT1 ekspresyonu kantitatif gerçek zamanlı-polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR), IL-6 ve TNF-α sitokin düzeyleri ise ELISA yöntemi ile belirlendi. LUCAT1 ekspresyon düzeyleri AsAA grubunda sağlıklı kontrollere kıyasla anlamlı derecede düşük bulundu (p<0.001). AsAA ve kontrol grupları arasında plazma IL-6 ve TNF-α düzeyleri karşılaştırıldığında, IL-6 ekspresyonu hasta grubunda kontrol grubuna kıyasla yüksek bulundu ancak sonuçlarımız istatistiksel anlamlılık sınırına ulaşamadı (p=0.070), hasta ve kontrol grupları arasında TNF-α düzeyleri açısından anlamlı bir fark tespit edilmedi (p=0.535). LUCAT1 ekspresyonu ile biyokimyasal parametreler arasındaki ilişki Spearman's korelasyon testi ile değerlendirildiğinde, AsAA grubunda LUCAT1 ekspresyonu ile ürik asit arasında pozitif yönde (rs=0.251, p=0.062), CK-MB arasında ise negatif yönde bir korelasyon tespit edildi (rs=-0.242, p=0.076). Ancak sonuçlarımız istatistiksel anlamlılık sınırına ulaşamadı. Sonuç olarak, AsAA grubunda kontrol grubuna kıyasla LUCAT1 ekspresyon düzeyinin anlamlı derecede düşük bulunması AsAA patogenezinde lncRNA LUCAT1'in önemli bir rolü olduğunu düşündürmektedir. LUCAT1'in aşağı yönde regülasyonu vasküler düz kas hücrelerinin fenotipik değişiminde ve dolayısıyla vasküler tonusta rol oynayabilir.
Radyasyon uygulanan baş boyun kanseri hücre hatlarında uzun kodlamayan RNA PCAT6 ifadesinin incelenmesi
Baş-boyun kanserleri (BBK), üst solunum ve sindirim sistemlerinin mukozal yüzeylerinden ve altındaki yapıların epitel dokularından köken alan yassı hücreli karsinomlar olup, dünya genelinde en sık görülen kanser türleri arasında yer almakta ve yüksek mortalite oranlarıyla dikkat çekmektedir. BBK vakalarının çoğu ileri evrelerde teşhis edilmekte; bu durum, tedavi etkinliğini sınırlamaktadır. Cerrahi, radyoterapi ve kemoterapi gibi multimodal tedavilere rağmen, özellikle radyodirenç ve tedaviye bağlı toksisite hala önemli engeller olarak karşımıza çıkmaktadır. Bu durum, bireysel tedavi yanıtlarını öngörebilmek için moleküler biyobelirteçlere dayanan kişiselleştirilmiş tedavi stratejilerinin gerekliliğini ortaya koymaktadır. Son yıllarda, gen ifadesinin epigenetik ve transkripsiyonel düzeyde düzenlenmesinde görev alan uzun kodlamayan RNA'ların (lncRNA) kanser biyolojisinde önemli roller üstlendiği gösterilmiştir. Bazı lncRNA'lar onkogenik olarak hücrelerinin proliferasyonunu, invazyonunu ve metastatik kapasitesini artırabiliyorken, bazılarının ise tümör baskılayıcı işlevlerle hücre çoğalmasını engelediği ve apoptozu tetiklediği görülmüştür. Bu çalışmada, çeşitli kanser türlerinde onkogenik etkisi bildirilmiş olan lncRNA PCAT6'yı kodlayan genin BBK hücrelerindeki ifadesi ve radyasyona verdiği yanıt araştırılmıştır. İnsan hipofarenks yassı hücreli karsinom hücre hattı (FaDu) ve normal insan özofagus epitelyal hücre hattı (HET-1A) kullanılarak PCAT6'nın temel ifade düzeyleri karşılaştırılmıştır. Ardından, FaDu hücreleri 0, 2, 4 ve 6 Gy dozlarında radyasyona maruz bırakılmış ve 0, 24, 48 ve 72 saatlik zaman noktalarında PCAT6 ifadesindeki değişimler değerlendirilmiştir. PCAT6 ifadesi, HET-1A hücre hattına göre FaDu hücre hattında %127 oranında artış göstermiştir. Bu bulgu, PCAT6'nın BBK hücrelerinde onkogenik bir rol oynayabileceğini düşündürmektedir. Radyasyon uygulanmış FaDu hücrelerinde ise net bir ifade paterni gözlemlenmemekle birlikte, her doz kendi içinde farklı zaman noktalarında anlamlı ifade değişiklikleri göstermiştir. PCAT6 ifadesi, 2 ve 4 Gy dozlarında radyasyona maruz bırakılan hücrelerde 48–72 saatlik zaman aralığında azalma göstermiş; bu baskılanma en belirgin şekilde 4 Gy doz uygulanan hücrelerde gözlemlenmiştir. Buna karşın, 6 Gy uygulanmış grupta 72. saatte PCAT6 ifadesinde yeniden bir artış saptanmış ve bu durum, tedaviye dirençli hücre alt popülasyonlarının varlığına ve PCAT6'nın radyodirençle ilişkili olabileceğine işaret etmektedir. Sonuç olarak, bu çalışma PCAT6'nın baş-boyun kanseri hücrelerinde onkogenik bir rol üstlendiğini ortaya koymaktadır. Ayrıca, PCAT6 ifadesinin uygulanan radyasyon dozlarına bağlı olarak değişkenlik gösterdiği ve kompleks bir ifade profili sergilediği belirlenmiştir.
Prostat kanserinde BER tamir mekanizması enzim ifade değişimlerinin incelenmesi
Prostat kanseri, erkeklerde en sık görülen malignitelerden biridir ve kansere bağlı ölümler arasında ikinci sırada yer almaktadır. Prostat kanser insidansı ve mortalite oranları yaşla güçlü bir şekilde ilişkilidir ve en yüksek insidans, yaşlı erkeklerde (>65 yaş) görülmektedir. Hastalık süreci, genetik yatkınlık, hormonlar ve çevresel faktörler gibi birçok risk faktörüne bağlı değişkenlik gösterebilir. Oksidatif stres nükleik asitler, proteinler ve lipitler gibi çeşitli hücresel biyomoleküllerde hasarlara ve hücre içi proto-onkojenik sinyallemenin aktivasyonuna neden olur. Oksidatif stresin prostat karsinogenezinde önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Baz kesip-çıkarma tamir (BER) mekanizması, özellikle oksidatif stres kaynaklı DNA hasarlarının giderilmesinde temel bir rol oynar. BER yolunda APE1, PARP1, XRCC1, UNG ve OGG1 gibi enzimler, hasarlı bazların tanınması, çıkarılması ve yeniden sentezlenmesinde görev almaktadır. Çalışmamızda prostat kanseri hastalığı olan 50 hastasının APE1, PARP1, XRCC1, UNG ve OGG1 mRNA ifade düzeyleri, tümörlü ve normal dokularda tespit edildi ve bu iki doku arasındaki gen ifade değişiklikleri karşılaştırıldı. Ayrıca bu mRNA'ların ifade düzeyleri ile hastaların klinik değerleri arasındaki ilişkide incelendi. Çalışmamızda Genlerin ifade düzeyleri, kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (Quantitative Reverse Transcription PCR) yöntemiyle tespit edildi. APE1, PARP1, XRCC1, OGG1 genlerinin tümörlü dokudaki ifade düzeyleri ile normal dokudaki ifade düzeyleri karşılaştırıldığında, istatiksel olarak anlamlı bir fark tespit edilmedi (p>0.05). Diğer yandan UNG geninin tümörlü dokusundaki (4.11±0.98) ifade düzeyleri, normal dokudaki (3.13±0.98) ifade düzeylerine göre istatiksel olarak yüksek bulundu (p=0.02). Gen ifade düzeyleri, hastaların klinik verileri ile birlikte değerlendirildiğinde, tümör dokusundaki PSA düzeyi ile UNG (r: 0.341, p=0.01) ve APE1 (r: 0.287, p=0.04) gen ifade düzeyi arasında istatiksel olarak anlamlı bir korelasyon tespit edildi. Tümör dokusundaki PARP1 gen ifade düzeyinin, diyabeti olan hastalarda istatiksel olarak anlamlı derecede düşük olduğu görüldü (p=0.005). Ayrıca, tümör dokusundaki XRCC1 gen ifade düzeyi ile yaş arasında ters bir korelasyon olduğu tespit edilmiştir (r: -0.359, p=0.01). Bulgularımızın, prostat kanser patogenezi ile BER tamir mekanizmasındaki ilişkilerin aydınlatılmasına faydalı olacağını umuyoruz.
Prostat kanserinde DNA tamir enzim gen ifadelerini etkileyen miRNA ifade değişimlerinin incelenmesi
Prostat kanseri, küresel ölçekte dikkat çeken bir sağlık sorunudur. Erkeklerde en sık görülen kanser türleri arasında ikinci sırada yer almaktadır. Prostat kanser patogenezi, DNA tamir mekanizmaları ile de ilişkili olabilen genetik ve epigenetik değişimlerin yanı sıra hormonal dengesizlikler, çevresel faktörler ile ilişkilendirilmiştir. Özellikle çift zincir kırıkları tamir mekanizmalarındaki bozukluklar, prostat kanserinin gelişimi ve ilerlemesinde önemli bir rol oynadığı bilinmektedir. MikroRNA'lar, intronik veya ekzonik DNA dizilerinden kopyalanan küçük tek sarmallı, kodlamayan dizilerdir. Ggen ifadesinin post-transkripsiyonel düzenlenmesinde çok önemli rol oynarlar. Bu çalışmada, 50 prostat kanser hastasının patolojik olarak teyit edilen tümörlü ve normal dokularında, çift zincir kırık tamir mekanizması ile ilişkili rolleri olan miR-155, miR-1246, miR-210, miR-34c ve miR-421 gen ifade düzeyleri kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) yöntemiyle analiz edip, hastaların klinik bulguları ile birlikte değerlendirdik. miR-155, miR-1246, miR-210 ve miR-421'in tümörlü ve normal dokulardaki ifade düzeyleri arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark tespit edilmemiştir (P:0.05). Buna xv karşın, miR-34c'nin tümörlü dokulardaki ifade düzeyinin, normal dokulara kıyasla anlamlı düzeyde düştüğünü tespit ettik (p=0.001). Gen ifade düzeyindeki kat değişimi (2 –ΔΔCT ) 0.31 olarak tespit edildi. miRNA'lar arasındaki ilişki incelendiğinde hem normal dokuda hem de tümör dokusunda farklı miRNAlar arasında ilişki tespit edildi. Tümör dokularda yaş ile miR 34c ifade düzeyi arasında ters bir korelasyon olduğu tespit edilmiştir (r: -0.362, p=0.008). Yaş arttıkça miR-34c ifade düzeyi düşmektedir. Diğer yandan tümör dokusunda PSA ile miR-210 (r: 0.353, p=0.011) ve miR-1246 arasında (r: 0.594, P:0.0001) istatiksel olarak anlamlı bir korelasyon olduğu tespit edildi. PSA arttıkça miR-210 ve miR-1246 ifade düzeyi de artmaktadır. Elde edilen bulgular, miR-34c'nin prostat kanseri gelişiminde ve ilerlemesinde önemli bir rol oynayabileceğini düşündürmektedir. Çalışmanın, prostat kanseri ile DNA tamir mekanizmaları ve DNA hasarlarının onarımı arasındaki ilişkilerin aydınlatılmasına katkı sağlayacağını umuyoruz.