317
Archived Theses
0
DOIs Assigned
0%
DOI Rate
Discipline
Leptin ve leptin reseptör antagonistinin glioblastoma temozolomid direncindeki rolü
Glioblastoma (GB) bilinen en malin beyin tümörüdür. GB, radyoterapi ve kemoterapi uygulamalarına moleküler ve klinik özellikleri açısından sıklıkla dirençlidir. Kemoterapide kullanılan en yaygın ilaç Temozolomid (TMZ)'dir. Son yıllarda yapılan çalışmalarda, leptinin kanser tedavisinde gelişen kemoterapötik dirençte rol oynayabileceği belirtilmektedir. Bu tez çalışmasında; Glioblastoma'da TMZ'ye karşı gelişen kemoterapötik dirençte, leptin ve/veya leptin antagonistinin (SHLA) olası rolünün araştırılması amaçlanmıştır. Çalışmada T98G, U373 MG ve LN-405 GB hücre serileri kullanılmıştır. Bu hücrelerde TMZ, leptin ve SHLA'nın sitotoksisitesi MTT ile saptanmıştır. TMZ, leptin ve SHLA'nın tekli kullanımlarının ve ikili, üçlü kombinasyonlarının TMZ direnç yolağında yer alan MGMT, MLH1, MSH2, MSH6, PMS2 genlerinin ekspresyonları üzerine etkisi RT-PZR ile saptanmıştır. Moleküllerin genomik DNA hasar etkisi COMET ve hücre döngüsüne olan etkileri ise akım sitometri ile belirlenmiştir. TMZ, leptin ve SHLA'nın TMZ direnç yolağındaki genlerin ekspresyonlarına olan etkileri birbirinden farklılık göstermektedir. Genomik DNA hasarı ve hücre döngüsü açısından hücre serileri arasında anlamlı farklılıklar saptanmıştır. Elde edilen veriler TMZ, leptin ve SHLA'nın hücre tipine göre kemoterapötik dirence farklı düzeyde katkı sağladığı, leptinin özellikle MGMT ekspresyonunu arttırdığı, MMR genlerinde ise genel olarak değişikliğe neden olmadığı tespit edilmiştir. Leptin ve SHLA'nın tek başlarına genomik DNA'da hasar oluşturabildiği ve hücrelerin G1 fazında birikmesine neden olduğu ancak kombinasyonlarda bu etkinin hücre tiplerine göre farklılık gösterdiği saptanmıştır. Sonuçlarımız, leptin ve SHLA'nın tek ve kombine kullanımlarının TMZ kemoterapötik direncinde rol alabileceğini ve bu etkinin hücre tipine göre ve gen spesifik olarak değiştiğini göstermektedir. Bu tez çalışması, leptin ve SHLA'nın TMZ direncindeki etkisinin araştırıldığı ilk çalışmadır.
İn vitro ortamda insülin reseptör substrat 1 (IRS1) bağımlı sinyal iletim ağının glioblastoma multiforme gelişimindeki rolünün belirlenmesi
Beynin temel enerji kaynağı glukozdur ve beyin, glukozu yoğun bir şekilde kullanmaktadır. Dolayısıyla beynin fizyolojik rolünü yerine getirmesi, glukoz metabolizmasının sıkı bir şekilde kontrolü ile sağlanmaktadır. İnsülin Reseptör Substrat (IRS) proteinleri, glukoz metabolizmasının regülasyonunda rol alan en önemli adaptör proteinlerdir. IRS1 bu protein ailesinin üzerinde en çok çalışılan elemanıdır. IRS1, kanserle ilgili birçok reseptörle etkileşime geçmektedir ve literatürde IRS1'in meme, akciğer, prostat, böbrek gibi birçok kanser türünde ekspresyon artışı gösterilmiştir. Yapılan çalışmalarda merkezi sinir sistemi tümörlerinden biri olan medulloblastomda da IRS1 ekspresyonunun arttığı gösterilmiştir. Bizde bu bilgiler ışığında, IRS1'in merkezi sinir sisteminin bir diğer önemli tümörü olan glioblastoma multiforme (GBM) gelişiminde de böyle bir ekspresyon artışı olabileceğini düşündük. Buradan yola çıkarak in vitro ortamda IRS1 bağımlı sinyal iletim ağının GBM gelişimindeki rölünü belirlemeyi amaçladık. Çalışmada, U-87 MG hücre hattı kullanıldı. IRS1 proteinin ekspresyonunu U-87 MG hücrelerinde arttırmak amacıyla pcDNA3.1-flag tagged-insan IRS1 ekspresyon vektörü lipofektamin aracılığı ile hücrelere transfekte edildi. Ektopik IRS1 ekspresyon artışının GBM hücrelerinin sağkalımı üzerindeki fonksiyonel etkisi MTT analizi, insülin sinyali üzerindeki moleküler etkisi western blot analizi ile belirlendi. Elde ettiğimiz sonuçlar, ektopik IRS1 ekspresyon artışının GBM hücre sağkalımını arttırdığını göstermektedir. Ayrıca, IRS1 ekspresyon artışının, insülin indüklü Grb2, ERK ve AKT proteinlerinin aktivasyonlarında artış gerçekleştirdiği saptanmıştır. Çalışmamız, GBM hücrelerinde IRS1 ekspresyon ve aktivasyon artışının, hücre sağkalımını AKT aktivasyonu aracılığıyla arttırdığını ortaya koymaktadır. Anahtar Kelimeler: Beyin Tümörleri, Glioblastoma Multiforme, IRS1, İnsülin Reseptör Substrat Proteinleri (IRS), İnsülin Sinyali.
Kafeik asit fenetil esterin tiroit kanseri hücre hattında sitotoksisite, antimetastaz, antiproliferatif aktivite, apoptoz, oksidatif stres ve mitokondriyal membran potansiyeli üzerindeki etkileri
Küresel kanser insidans verilerinin kapsamlı bir analizi, tüm ırk ve cinsiyet gruplarında tiroit kanseri vakalarında önemli bir artış olduğunu ortaya koymaktadır. Özellikle tiroit kanseri insidansı artarak kadınlar arasında en sık görülen beşinci kanser haline gelmiştir. Bu çalışmanın amacı, hücresel penetrasyonu kolaylaştıran lipofilik bir moleküler yapıya sahip Apis mellifera bal arılarından elde edilen doğal bir bileşik olan Kafeik Asit Fenetil Ester'in (CAPE) mitokondriyal membran potansiyeli (MMP, Δψm) yolu üzerinden TPC-1 insan papiller tiroit kanseri hücre hattı üzerindeki sitotoksik etkisini incelemektir. CAPE'nin TPC-1 hücre hattı üzerindeki sitotoksik etkisi MTT ve kristal viyole deneyleri kullanılarak değerlendirilmiştir. Apoptotik aktivitenin derecesi, Bax, Bcl-2, Kaspaz-3, Kaspaz-8, Kaspaz-9 ve Apaf-1 seviyelerini analiz etmek için kullanılan bir yöntem olan ELISA ile belirlenmiştir. Tiroit kanseri hücre mitokondrisi üzerindeki etki, JC-1 floresan problu-MMP, ROMO-1 ve mitokondriyal ATP-sentaz aktivitelerinin analizi yoluyla araştırılmıştır. Oksidatif stres ve DNA hasarının derecesini değerlendirmek için ROS ve 8-OHdG analizi yapılmıştır. Laktat dehidrojenaz (LDH) analizi hem sitotoksisite hem de hücresel membran hasarının bir belirteci olarak kullanılmıştır. Anti-metastatik aktiviteyi tespit etmek için hücre göçü ve koloni oluşumu deneyleri yapılmıştır. Sitomorfolojik analiz için Giemsa boyama yöntemi seçilmiştir. CAPE uygulamasının 48 saatlik bir süre boyunca değişen dozlarda TPC-1 hücrelerinde sitotoksik aktivite gösterdiğini belirten bulgular ışığında, 25 µM IC50 değeri sonraki deneyler için etkili doz olarak seçilmiştir. Bcl-2 seviyelerinde azalma ve Bax, Kaspaz-3, -8, -9 ve Apaf-1 anahtar bileşenlerinin aktivasyonunda istatistiksel olarak anlamlı bir artış, CAPE kaynaklı hücre ölümünün apoptoza bağımlı olduğunu göstermiştir. Bu çalışma CAPE'nin erken apoptozun bir belirteci olan mitokondriyal membran potansiyelinde (Δψm) mitokondriyal depolarizasyona ve mitokondriyal ATP-sentazda önemli bir düşüşe neden olduğunu göstermiştir. Ayrıca, CAPE hücre içi ROS, ROMO-1 seviyeleri ve 8-OHdG DNA hasarında önemli bir artışa neden olmuş, buna hücresel membranlardan sızan hücre dışı LDH konsantrasyonunda önemli bir artış eşlik etmiştir. Özellikle hücre göçü ve koloni oluşumu üzerinde belirgin bir inhibitör etki göstererek anti-metastatik özellikler sergileyen CAPE, sitomorfolojik değişikliklere de neden olmuştur. Sonuç olarak, bulgular CAPE'nin TPC-1 hücrelerinde MMP depolarizasyonu ve ATP sentaz blokajı ile ilişkili mitokondriyal yolakların modülasyonu yoluyla artan ROS, ROMO-1 ve hücre dışı LDH tarafından tetiklenen hem intrinsik hem de ekstrinsik apoptotik yolaklarda aktivite gösterdiğini ortaya koymuştur. Bununla birlikte, insan papiller tiroit karsinom hücrelerinde sitomorfolojik değişikliklere neden olduğu gözlemlenen CAPE'nin potansiyel etkileşimlerini ve güvenliğini kapsamlı bir şekilde değerlendirmek için daha fazla in vivo araştırma yapılması gerekmektedir.
Kolşisin direnci olan ailevi akdeniz ateşi hastalarında ifadesi değişen miRNA'ların inflamasyon ve ilaç direnci ile ilişkisinin belirlenmesi
Ailevi Akdeniz ateşi klinik heterojenitenin görüldüğü monogenik bir sistemik otoinflamatuvar hastalıktır. Ailevi Akdeniz ateşinde en yaygın tedavi yöntemi günlük kolşisin kullanımıdır. Fakat hastaların %2-5'lik kısmında kolşisin direnci görülmektedir. İlaç direncinin gelişiminde epigenetik mekanizmaların özellikle kodlamayan RNA'lardan mikroRNA'ların rol oynadığına dair çalışmalar mevcuttur. Bu sebeple kolşisin dirençli hastalarda ifadesi değişen mikroRNA'ların ilaç direnci ve inflamasyon ile muhtemel ilişkisinin değerlendirilmesi gerektiği düşünülmüştür. Grubumuz tarafından daha önce gerçekleştirilen miRNA 4.0 array ile mikroRNA ifade analizi yeniden değerlendirilmiş; kolşisin dirençli ve duyarlı hasta grupları arasında ifadesi en az 2 kat değişen 25 mikroRNA bulunmuştur. Bu mikroRNA'lardan ilaç direnci ile yüksek oranda ilişkili bulunanlar hasta grubunda kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu ile valide edilmiş, miR-183-5p ve miR-15b-5p'nin ifadesinin kolşisin dirençli hastalarda anlamlı şekilde azaldığı, miR-125a-5p'nin ifadesinin anlamlı olmayan bir azalış gösterdiği bulunmuştur. Biyoinformatik araçlar kullanılarak hem inflamasyon hem de ilaç direnci ile ilişkili genlerin listesi oluşturmuş, kolşisin dirençli hastalarda anlamlı azalış gösteren mikroRNA'ların ilaç direnci ve inflamasyonla ilişkili olası hedef genleri belirlenmiştir. Genlerin ifade analizi için yapılan kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu deneylerinde, kolşisin dirençli hastalarda azaldığı görülen mikroRNA'ların olası hedef genleri olarak seçilen NR3C1 ve NFKB1'in ifadesinin, aynı hasta grubunda arttığı gösterilmiştir. Grubumuzun önceki projeleri sırasında oluşturulmuş kolşisin dirençli hücre hattında da aynı mikroRNA'ların ve hedef genlerinin hasta grubuyla benzer değişim gösterdiği saptanmıştır. Bu çalışma sonucunda belirlenen ifadesi değişen mikroRNA'ların, ileride kolşisin direncinin erken tanısı için biyobelirteç olma potansiyeli taşıdığı düşünülmektedir. Anahtar kelimeler: AAA, kolşisin direnci, mikroRNA
Baş boyun kanserlerinde radyasyon tedavisine cevap ve radyotoksisitede uzun kodlamayan RNA (lncRNA)'ların rolü
Baş boyun kanseri (BBK) dünya çapında en çok rastlanan kanser tiplerinden biridir. Genellikle tümör yerleşimi larenks, nazofarenks, orofarenks, nazal kavite olan bu hastalığın tedavisi cerrahi, radyoterapi ve kemoradyoterapidir. Hastalığın ilerlemesinde ve tedaviye yanıtta uzun kodlamayan RNA (lncRNA), mikroRNA (miRNA) gibi etkenlerin rolü vardır. Bu çalışmada, birçok kanser türünde onkogenik etkisi olduğu bilinen bir lncRNA olan PCAT6'nın BBK'deki ifadesini ve radyasyon yanıtına etkisini araştırmayı amaçladık. Çalışmaya, BBK tanısıyla, radyoterapi ve kemoradyoterapi uygulanan 15 hasta ve 12 sağlıklı birey dahil edildi. Hastalardan tedavi öncesi, ortası ve sonunda ve kontrol grubunu oluşturan bireylerden alınan kan örneklerinden RNA izolasyonu yapıldı. RNA örneklerinden tek adım enzim sistemi kullanılarak cDNA sentezi ve gerçek zamanlı polimeraz zincir tepkimesi (GZ-PZT) yapılarak PCAT6 geninin ifadesi analiz edildi. PCAT6 ifadesinin hastalarda tedavi öncesinde kontrol grubuna göre 3,07 kat arttığı, tedavi sırasında da artmaya devam ettiğini gözlemlendi. PCAT6 ifadesi tedavi ortasında tedavi öncesine göre %6,5; tedavi sonunda tedavi ortasına göre %11,9 ve tedavi sonunda da tedavi başlangıcına göre %19,2 artmıştır. Sonuç olarak, PCAT6'nın diğer kanserlerde olduğu gibi BBK'de de onkogenik etkisi olabileceği ve radyasyon yanıtında ifadesinin değişebileceği öne sürülebilir.
Behçet hastalığında dna hasarları ve OGG1 gen ifade düzeyleri
Behçet Hastalığı (BH) 1937 yılında ilk kez Türk dermatolog Dr. Hulusi Behçet tarafından tanımlanan, tekrarlayan oral aft, genital ülserlerle birlikte oküler, cilt, gastrointestinal ve sinir sistemi bulguları ile karakterize otoimmün bir hastalıktır. BH, evrensel bir hastalık olmakla birlikte yapılan çalışmalarla Türkiye'nin BH görülen diğer ülkelere kıyasla en yüksek prevalansa sahip olduğu gösterilmiştir. Behçet Hastalığı genellikle genç erişkinleri etkilemesi ve tedavisinin zor olması, organ tutulumları ile ciddi bir morbiditeye neden olması bakımından gün geçtikçe önemi artan bir hastalık haline gelmiştir. İnflamasyonun yol açtığı artan reaktif oksijen türleri (ROT), organizmanın oksidan/antioksidan dengesini bozarak DNA gibi biyomoleküllerde hasara neden olmaktadır. ROT'ların DNA'da yol açtığı en sık görülen DNA hasarlarından biri 8-Oxo-2'-deoksiguanozin (8-oksoG)'dir. Behçet hastalığında tekrarlayan inflamasyon ile karakterize bir hastalık olduğundan, ROT kaynaklı oksidatif stresin yüksek olması ve DNA hasarlarına yol açması muhtemeldir. Yapılan birçok çalışmada, biyolojik materyallerde tespit edilen 8-OHdG'nin kanser, parkinson hastalığı, sistemik lupus eritematozus, romatoid artrit gibi hastalıklardaki mevcut DNA hasarının belirlenmesinde kullanılan iyi bir biyobelirteç olduğunu göstermiştir. DNA'daki 8-OHdG hasarlarının onarımı baz çıkarma onarım (BER) yolağında görev alan OGG1 enzimi ile gerçekleşmektedir. Çalışmamızın amacı, BH'da muhtemel DNA hasar düzeyini ve bu hasarların tamirinde rol oynayan OGG1 gen ifade düzeyini belirleyerek, BH'nın patogenezinde DNA hasar yanıtının önemini ortaya çıkarmaktır. Yapmış olduğumuz bu çalışmada, OGG1 gen ifade düzeyini gerçek-zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qPZR; qPCR) ile tespit edildi. Oksidatif DNA hasarının göstergesi olan 8-OHdG miktarını ölçmek için ise ELISA yöntemi uygulandı. Çalışmalar, toplam 70 BH ve benzer yaş ve cinsiyetteki 30 sağlıklı kontrolde çalışma gerçekleştirildi. OGG1 mRNA ifade düzeyleri açısından kontrol grubu ile tüm BH grubu karşılaştırıldığında, iki grup arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark gözlemlenmedi (p=0.20). Benzer şekilde kontrol grubu ile D-BH (Derin Ven Tromboz-BH) grubu (p=0.59) ve M-BH (Mukokutanöz BH) grubu (p=0.18) grubu karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı bir fark tespit edilmedi. Diğer yandan, D-BH grubu (0.0040±0006) ile M-BH (0.0024±0.0002) grubu karşılaştırıldığında da iki grup arasında OGG1 mRNA ifade düzeyleri açısından istatistiksel anlamda bir fark tespit edildi (p=0.024); M-BH grubundaki OGG1 ifade düzeyi daha düşük olarak tespit edildi. 8-OHdG düzeylerine bakıldığında kontrol grubu ile tüm BH grubu arasında anlamlı bir fark gözlemlenmedi (p=0.27). Benzer şekilde, kontrol grubu ile karşılaştırıldığında D-BH grubu (p=0.42) ve M-BH grubu (p=0.28) arasında 8-OHdG düzeyi açısından istatistiksel olarak bir fark tespit edilmedi. D-BH grubu ile M-BH grubu arasında da, 8-OHdG düzeyleri açısından anlamlı bir farklılık görülmedi (p=0.85). DNA tamir mekanizmasının Behçet hastalığı ile ilişkisini araştırmış olduğumuz literatürdeki bu ilk çalışma, bu alanda yapılacak birçok çalışmaya yol gösterici olabilir.
Normal ve kanser kromozomlarında histon modifikasyonlarının ı̇mmunfloresan yöntem ile ı̇ncelenmesi
Bir organizmanın genel epigenetik durumu olan epigenom, normal gelişimde genom kadar önemlidir. Epigenetik, DNA dizisinden ziyade kromatin yapı ve organizayonundaki değişiklikler yoluyla meydana gelen gen ifadesindeki kalıtsal değişikliklerin incelenmesidir. Kromatin iki durumda bulunabilir: gevşek, transkripsiyonel olarak aktif ökromatin veya yoğun, transkripsiyonel olarak inaktif heterokromatin. Histon proteinlerindeki kimyasal modifikasyonlar, transkripsiyon faktörlerinin ve enzimlerin DNA ile etkileşime girmesine izin vererek gen ekspresyonunu kolaylaştıran açık ökromatin durumunun veya transkripsiyonun başlamasını önleyerek gen ekspresyonunu baskılayan kapalı heterokromatin durumunun oluşumunu indükleyebilir. Kanser hem genetik, hem de epigenetik mekanizmalardaki düzensizliklerin rol oynadığı karmaşık bir hastalıktır. İmmünofloresan boyama, biyolojik örneklerdeki çeşitli molekülleri tespit etmek ve görselleştirmek için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Bu çalışmanın amacı açık ve kapalı kromozom yapısı oluşturan histon modifikasyonlarının normal ve kanser kromozomlarında immunfloresan yöntemlerle incelemek ve aralarında bu açıdan fark olup olmadığını belirlemektir. Çalışmaya normal kromozom elde etmek için sağlıklı bireyler, kanser kromozomları elde etmek için ise K562 hücre hattı dahil edilmiştir. K562 hücre hattının kromozom yapısı laboratuvardan laboratuvara değişebildiğinden, çalışmaya dahil ettiğimiz K562 hücre hattının karyotipi GTL bantlama ve FISH yöntemi ile belirlenmiştir. Sağlıklı olgular ve K562 hücre hattına ait örneklerden elde edilen kromozomlarda açık kromatin işareti olan H3K27ac ve kapalı kromatin işareti H3K27me3 modifikasyonlarının immunfloresan boyama bant paternleri elde edildi ve her iki modifikasyonun gen açısından zengin bölgelerde yoğunlaştığı görüldü. Hem normal, hem de kanser örneklerinde değerlendirilebilen kromozomlarda (1, 12 ve 19. kromozomlar) immunfloresan bant paternlerinde belirgin bir fark gözlemlenmedi.
Fruktoz ve streptozotocin ile oluşturulan diyabetik sıçan modelinde resveratrolün karaciğer hasarı ve ferroptoz üzerine etkileri
Bu çalışmada %10'luk yüksek fruktoz ile düşük doz streptozotocin (40mg/kg) uygulanarak modifiye Tip 2 diyabet modeli oluşturuldu ve resveratrol tedavisinin olası karaciğer hasarı ve ferroptoz üzerine etkileri araştırıldı. Deney hayvanları ile 4 deney grubu oluşturuldu. Diyabetik grup (F), Resveratrol tedavisi uygulanan diyabetik grup (FR), Resveratrol tedavisi uygulanan kontrol grubu (KR), Sağlıklı kontrol grubu (K). Deneyin sonunda tüm hayvanlar sakrifiye edilerek karaciğerleri alındı. Deney süresince deney gruplarının kan şekeri, günlük kalori alımı ve vücüt ağırlıkları ölçüldü. Karaciğer doku kesitlerine morfolojik değerlendirilmesi için Hematoksilen-Eosin, Prusya Mavisi ve Van Gieson boyamaları, ayrıca SIRT1, COX2, HO-1, GPX4, γH2AX, 4HNE, 8-OHdG, Nrf2 antikorları kullanılarak immünohistokimyasal boyama yapıldı. ALOX5, FASN, GPX4 protein seviyelerinin ve GSH/GSSG oranı biyokimyasal yöntemler ile ölçülerek tüm sonuçlar istatistiksel olarak değerlendirildi. YF grubunda açlık kan şekeri düzeyleri artarken YF-R grubunda açlık kan şekeri düzeyinin azaldı. Deney sonunda YF grubunun vücüt ağırlığında düşüş gözlendi (p≤0.05). Dokuların morfolojik değerlendirilmesinde YF grubunda fibrozis ve demir birikmesi gözlemlenirken YF-R gruplarında ise fibrozisin gerilediği ve demir birikimini gözlenmediği saptandı. İmmünohistokimya sonuçlarından elde edilen verilerde SIRT1 (p<0.0001), GPX4 (p<0.0001) ve Nrf2 (p≤0.05) ekspresyonları YF grubunda kontrol grubuna kıyasla azaldığı anlaşıldı. COX2, HO-1, γH2AX, 4HNE ve 8-OHdG ekspresyonları ise YF grubunda diğer gruplara göre arttığı belirlendi. ELISA sonuçlarına bakıldığında, ALOX5 ve FASN seviyelerinde gruplar arasında anlamlı fark yokken GPX4 seviyeleri YF grubunda diğer gruplara göre daha düşük olduğu anlaşıldı (p≤0.05). GSH/GSSG testinde ise bu proteinin düzeylerinin kontrol gruplarına göre YF (p<0.01) ve YF-R (p<0.001) gruplarında arttığı saptandı. Çalışmada yüksek fruktoz diyeti ve düşük doz STZ uygulamasının kan şekeri düzeylerini artırdığı, oksidatif stresi uyararak karaciğerde fibrozise, demir birikimine, hücrelerde DNA hasarına ve ferroptoz yolağında görevli proteinlerin ekspresyonunda artışa neden olarak karaciğer hasarına yol açtığı saptandı. Resveratrol uygulamasının kan şekeri düzeylerini düşürdüğü, oksidatif stres üzerinde olumlu etki yaptığı ve hepatositlerde demir birikimini önleyerek karaciğer dokusunu ferroptozdan koruduğu gözlendi.
JAK2+ kronik miyeloproliferatif neoplazi'li ve JAK2+ sekonder miyelofibroz'a dönüşümü olan hastalarda miRNA'ların incelenmesi
Kronik Miyeloproliferatif Neoplaziler (KMPN), olgun miyeloid hücrelerin çoğalması ve kemik iliği fibrozunun gelişmesi ile karakterize olan klonal hematopoetik bozukluklardır. KMPN'ler Philadelphia kromozomu negatif Esansiyel Trombositemi (ET), Polisitemi Vera (PV), Primer Miyelofibroz (PMF) gibi hastalık gruplarını içerir. Klinik olarak yaşlı hastalarda daha belirgindir, ET, PV, PMF için ortalama tanı yaşı 53-60 arasıdır. KMPN hastalarının %90'dan fazlasını oluşturan ortak özellikleri Janus Kinaz 2 (JAK2), Kalretikülin (CALR) veya trombopoietin reseptörünü (TPOR, MPL) kodlayan genlerde sürücü mutasyonların bulunmasıdır. KMPN türü olan PV ve ET zamanla Sekonder Miyelofibroza (SMF) dönüşebilir. Fibrotik dönüşüm PV ve ET'de sırasıyla %12-21 ve %9-10 oranlarında görülür. SMF'yi tanımlayan klinik özellikler arasında ileri yaş, lökositoz, anemi gelişimi, yüksek LDH seviyeleri, splenomegali, ASXL1 mutasyonları ve JAK2V617F alel mutasyonu gibi çeşitli faktörler bulunabilir. Yapılan çalışmalarda epigenetik mekanizmaların, özellikle miRNA'ların KMPN gelişiminde rolü olduğu gösterilmiştir. Çalışmamızda miR-135a-5p'nin JAK2 pozitif (JAK2+) olan KMPN'lerin SMF'ye dönüşümündeki etkisini araştırmayı hedefledik. İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa, Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Hastanesinde Hematoloji Polikliniği'ne başvuran ve KMPN tanısı konan 40 hastanın kan örnekleri ve kontrol grubu olarak yaş ve cinsiyet uyumlu 10 sağlıklı bireyin kan örnekleri kullanıldı. Periferik kandan plazma izolasyonunu takiben miRNA izolasyonu yapıldı, elde edilen örnekler cDNA'ya dönüştürüldükten sonra miRNA-135a-5p'nin ifadesi gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (GZ-PZR) yöntemi ile analiz edildi. Çalışmamız sonucunda miR-135a-5p ifadesinin PV'li hastalarda kontrollere oranla %43, ET+PV'li hastalarda ise yaklaşık %50 arttığını, bu hastalarda miR-135a-5p'nin bir onkomiR gibi davrandığını gösterdik. Son olarak, miR-135a-5p ifadesinin PV'li hastalarda sigara (p=0,056) ve glukoz seviyeleri(p=0,021) ilişkili olduğunu gösterdik. Sigara içindeki zararlı maddeler ve glukoz seviyeleri miRNA ifadesini etkileyip kanser oluşumunu destekliyor olabilir.
Yüksek karbohidrat diyet ile beslenen sıçanlarda delta 9-tetrahidrokannabinolün kolon dokusu üzerine etkileri
Yüksek karbohidratlı diyetin enerji dengesi üzerindeki zararlı etkisi metabolik hastalıkların gelişmesine ve ilerlemesine yol açmaktadır. İşlevsiz insülin salgılanması hiperinsülinemi (HI) olarak bilinen metabolik bir bozukluğa neden olmaktadır. Araştırmacılar delta 9- tetrahidrokannabinolün (THC) metabolik bozukluklarda terapötik bir ajan olarak kullanılabileceğini bildirmişlerdir. Bu çalışmanın amacı, THC uygulanan Sprague-Dawley sıçan kolon dokusunda yüksek karbohidratlı diyetle ilişkili oksidatif stres, inflamasyon, apoptoz ve kannabinoid reseptörlerinin moleküler mekanizmalarına açıklık getirmektir. Her grupta 7 sıçan olmak üzere toplam 28 adet erkek sıçan, kontrol (K), HI, THC uygulanan K (THC) ve THC uygulanan HI (HI+THC) gruplarına ayrıldı. HI sıçan modeli 12 hafta boyunca içme suyuna %10 fruktoz katılarak oluşturuldu. Deneyin son dört haftasında HI+THC ve THC gruplarındaki sıçanlara intraperitoneal yolla 1.5 mg/kg/gün THC uygulandı. Bu çalışmada, biyokimyasal analizler ile glutatyon seviyesinin HI grubuna göre HI+THC grubunda arttığını bulduk fakat malondialdehit, protein karbonil, katalaz, glutatyon-Stransferaz gibi diğer reaktif oksijen türlerinde önemli bir değişiklik saptanmadı. Kannabinoid reseptörleri, inflamasyon ve apoptoz belirteçlerini tespit etmek için qRT-PCR metodu uygulandığında, G proteinine bağlı reseptör 55 (Gpr55), tümör nekroz faktör-α, nükleer faktör- κB, kaspaz-3, kaspaz-8 ve kaspaz-9 mRNA ifadelerinin HI'ye göre HI+THC grubunda önemli ölçüde arttığı bulundu. Sonuç olarak THC'nin yüksek karbohidrat ile beslenen sıçan kolon dokusunda antioksidan, inflamatuvar ve apoptotik özelliklerinin yanı sıra GPR55 reseptörü üzerinden etki ettiğini söyleyebiliriz.
3 boyutlu (3B) biyoyazıcı ile cilt dokusu modelinin geliştirilmesi ve yara iyileşmesiyle ilgili bazı genlerin ifade düzeylerinin karşılaştırılmalı olarak değerlendirilmesi
Oldukça karmaşık bir süreç olan yara iyileşmesindeki gen ifadelerinin düzeylerindeki değişimleri analiz etmek hem mekanizmaları ortaya çıkarmak hem de yaraların tedavisinin değerlendirilmesinde önem teşkil etmektedir. Son yıllarda 3 boyutlu biyoyazıcı teknolojileri ile in vitro cilt modellerinin geliştirilmesi in vivo yaklaşımlara önemli bir alternatif oluşturmuştur. Ancak gen ifade değişikleri açısından bu tekniklerin verilerinin in vivo çalışmalardan elde edilenlerin yerini ne kadar tutabileceği yönünde çalışmalara ihtiyaç duyulmaktadır. Bu doğrultuda çalışmamızda 3 boyutlu (3B) biyoyazıcı teknolojisi kullanılarak geliştirilen cilt yara modellerinin, in vivo çalışmalar için bir değerlendirme kriteri olarak kullanılan gen ifadelenmesi düzeyleri ile ne kadar taklit edebileceği araştırılmıştır. Bu amaçla öncelikle 3 boyutlu biyoyazıcı kullanılarak oluşturulan iki katmanlı cilt modeli oluşturulmuş ve oluşturulan çizik modeli sonrası iyileşme sürecinin 0, 3, 7 ve 10. günleri örnekler alınarak, histolojik ve yara iyileşmesi ile ilişkilendirilmiş ve yara iyileşme sürecin farklı evrelerinde ifade düzeylerinin değiştiği bilinen 7 kritik genin (KRT6A, KRT16, KRT17, KRT1, KRT10, COL1A1 ve IL-6) ifade düzeyleri gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu ile değerlendirilmiştir. Elde edilen veriler aynı zamanda literatürde yer alan yara iyileşmesi ile ilgili in vivo ve in vitro çalışmalar ile karşılaştırılmıştır. Histolojik bulgularımız 3 boyutlu cilt modelinin başarı ile oluştuğunu, moleküler bulgularımız ise ilgili genlerin ifade düzeylerinin yara iyileşme sürecinde günlere göre farklı değişim gösterdiğini ortaya koymaktadır. Literatür karşılaştırmamız, 3 B cilt yara modelinin in vivo hayvan modeli ile büyük ölçüde uyumlu olduğunu ortaya koymaktadır. Ancak çalışmanın tek bir yara modeline kısıtlı olması da dikkate alınarak, farklı yara modellerinin de değerlendirildiği ilişkili çalışmaların sayısının artırılması ile hayvan modellerine olan bağımlılığı azaltarak daha etik ve etkili in vitro modellerin geliştirilmesine mümkün olabileceğini umuyoruz.
Ekstraselüler matriksin hücre yaşlanması üzerindeki etkisinin hücre kültürü temelli modelle değerlendirilmesi
İnsan diploid fibroblastları, büyümenin durması, morfolojideki değişiklikler ve değişmiş gen ifadesi ile karakterize edilen replikatif senesens durumuna girmeden önce sonlu sayıda hücre bölünmesini tamamlama kapasitesine sahip olup, bu süreçte ekstraselüler matris (ECM) ile etkileşim, hücrelerin yaşlanma ve senesens sürecine girmelerinde önemli bir rol oynamaktadır. Hücre yaşlanmasının altında yatan biyolojik süreçlerin anlaşılması, doku mühendisliği ve yaşlanmaya karşı geliştirilen tedavi yöntemleri için kritik bir öneme sahiptir. Ancak, yaşlanma sürecinde çevresel faktörlerin etkisi ve özellikle hücresel mikroçevrenin bu süreçteki rolü henüz tam olarak aydınlatılamamıştır. Bu bağlamda, yaşlı hücreleri görünüşte genç bir duruma geri döndürmek için genç dermal dokudan gelen ekstraselüler matris (ECM) ile etkileşimin senesens sürecini tersine çevirdiği öne sürülmüş ve ayrıca, yaşlı ECM'nin genç hücreler üzerindeki etkisi de ek olarak incelenmiştir. Bu çalışmada, üç boyutlu biyoyazıcı teknolojisi kullanılarak üretilmiş hücresizleştirilmiş ECM (dECM) modeli yardımıyla fibroblast hücrelerinin yaşlanma süreci incelenmiştir. Çalışmamızda, fibroblast hücrelerinin yaşlanma sürecini daha doğal bir hücresel mikroçevrede gözlemlemek amacıyla üç boyutlu kültür modeli kullanılmıştır. Bu model, hücrelerin in vivo benzeri bir ortamda yaşlanma mekanizmalarını daha gerçekçi bir şekilde incelemeye olanak tanımıştır. Genç ve yaşlı sıçan derisinden elde edilen dECM, yaşlı ve genç hücrelerle birlikte kullanılarak ECM'nin biyokimyasal özelliklerinin yaşlanma üzerindeki etkisi araştırılmıştır. Bu kapsamda, dECM'nin kimyasal yapısı Fourier dönüşümlü kızılötesi spektroskopi (FTIR) ve DNA miktarı ölçümü ile doğrulanmış, yaşlanmaya etki eden SIRT1, p53, GLB1, COL1A1, NF-κB ve MMP1 gibi genlerin ekspresyon seviyeleri, 0, 3, 7 ve 10. günlerdeki örneklerden alınan verilerle gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PZR) kullanılarak analiz edilmiştir. Çalışmanın sonuçları, dECM'nin yaşlı hücrelerin bazı genç fenotip özelliklerini geri kazanabilme kapasitesine sahip olduğunu ve ECM'nin genç özelliklerinin yaşlanmış hücrelere aktarılabileceğini göstermiştir. Bu bulgular, ECM'nin yaşlanmayı yavaşlatma veya kısmen tersine çevirme potansiyeli üzerine yeni bir bakış açısı sunarak, hücre-mikroçevre etkileşimlerinin yaşlanma sürecine etkisini ortaya koymaktadır. Çalışmamız, ECM'nin hücre yaşlanması üzerindeki etkilerini açıklayarak, doku mühendisliği ve rejeneratif tıp alanında yaşlanma karşıtı stratejilere katkı sağlayacak veriler sunmaktadır.
Prostat kanserinde ner tamir mekanizması enzim ifade değişimlerinin incelenmesi
Prostat kanseri, erkeklerde en sık görülen malignitelerden biri olup kansere bağlı ölümler arasında ikinci sırada yer almaktadır. Prostat kanserinin patogenezinde genetik ve epigenetik değişimlerin yanı sıra DNA hasar onarım mekanizmalarındaki bozukluklar önemli bir rol oynamaktadır. Bu mekanizmalardan biri olan nükleotid eksizyon tamiri (NER), UV ışınları, kimyasal ajanlar ve sigara dumanı gibi çevresel etkenlerin neden olduğu geniş çaplı DNA hasarlarını onarır. NER mekanizmasında görev alan ERCC2 ve ERCC5 proteinleri, DNA onarım sürecinde merkezi roller üstlenmektedir. ERCC2 geni, DNA'nın hasarlı bölgesini açan bir helikazı kodlarken, ERCC5 geni, hasarlı DNA'nın kesilmesini sağlayan bir endonükleazı kodlar. Bu çalışmada, prostat kanseri hastaların tümörlü ve normal dokularında ERCC2 ve ERCC5 gen ifadeleri incelenmiştir. Çalışmada toplam 50 hastadan alınan ve pataoljik olarak teyit edilen biyopsi örnekleri RT-PCR yöntemiyle analiz edilmiştir. Elde edilen bulgulara göre, ERCC2 gen ifadesi tümör dokusunda normal dokulara kıyasla 2,25 kat artış göstermiş, ancak bu artış istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır (p=0.12). ERCC5 gen ifadesi ise tümör dokusunda normal dokulara göre anlamlı bir şekilde artış göstermiş (p=0.005) ve bu artış 5,94 kat olarak hesaplanmıştır. Ayrıca, ERCC2 ve ERCC5 gen ifadeleri arasında istatistiksel olarak anlamlı bir korelasyon tespit edilmemiştir. Sigara kullanımı, diyabet, hipertansiyon, nodül varlığı, Gleason skoru ve PIRADS skoru gibi klinik değişkenlerin gen ifadeleri üzerinde herhangi bir etkisinin olmadığı gözlemlenmiştir. Sonuç olarak, prostat kanserinde ERCC5 geninin yüksek ifadesi, NER yolağının bu hastalıkta önemli bir role sahip olduğunu ve ERCC5'in potansiyel bir biyobelirteç olarak değerlendirilebileceğini göstermektedir. Çalışmamızın, DNA tamir mekanizmalarının prostat kanseri gelişimindeki rolünü anlamaya yönelik literatüre katkı sağlayacağı düşünülmektedir.
Lucilia sericata ekstraktının biyokararlılığı ve biyolojik etkileri üzerine farklı ortam şartlarının etkilerinin değerlendirilmesi
Lucilia sericata sineğinin larvaları, iyileşmesi zor ve kronik yaraların tedavisinde etkili bir yöntem olarak kullanılmaktadır. Larvaların salgılarında bulunan bileşikler, nekrotik dokuları eritmekte, mikroorganizmaların üremesini engellemekte ve doku granülasyonunu teşvik ederek yara iyileşmesini hızlandırmaktadır. Ancak, canlı larva kullanımı bazı hastalarda rahatsızlık yaratabileceğinden, larvaların izotonik çözeltiye bıraktıkları salgılar da tedavide kullanılabilmektedir. Bununla birlikte, taze larva salgılarına erişim zorluğu, önceden elde edilen ve saklanabilen salgı materyallerine olan ihtiyacı artırmaktadır. Literatür incelemeleri, yaygın olarak kullanılan bazı saklama koşullarının, salgının biyokararlılığı ve biyolojik etkileri üzerindeki sonuçlarının tam olarak bilinmediğini ortaya koymaktadır. Bu tez çalışmasında, Lucilia sericata 1. evre larvalarından elde edilen salgıların, +4°C ve -20°C'de 24 ve 48 saat boyunca saklanmasının biyokararlılığı ve biyolojik aktiviteleri üzerindeki etkileri değerlendirilmiştir. Çizme deneyi kullanılarak 3T3 murin fibroblast hücreleri üzerinde yapılan yara iyileştirme aktivitesi ölçümleri, -20°C'de 48 saat boyunca saklanan salgının, +4°C'de ve oda sıcaklığında muhafaza edilen salgılara kıyasla daha etkili olduğunu göstermiştir. Ayrıca, -20°C'de 48 saat saklanan salgının, 24 saat saklanan salgıya göre daha başarılı olduğu tespit edilmiştir. FTIR yöntemiyle yaptığımız ön değerlendirme sonuçları, stabilite bulgularımızın biyolojik etkinlik bulgularıyla uyumlu olduğunu ortaya koymaktadır. Bulgularımız, değerlendirilen saklama koşullarının etkilerini açığa çıkarırken, diğer saklama koşullarının etkilerinin ve çalışmamızda gözlenen bazı sonuçların daha iyi anlaşılması için ileri araştırmalara ihtiyaç duyulduğunu göstermektedir.
Amfiregülinin melanom gelişimindeki rolü
Melanom, iklim değişikliği ile birlikte insidansı hızla artan en agresif deri kanseri türüdür. Mevcut tedavi stratejilerine karşı direnç geliştirmesi nedeniyle melanomun gelişim mekanizmasını açıklamak ve alternatif moleküler hedefler bulmak önemlidir. EGFR ligandlarından biri olan amfiregülin (AREG)'in birçok kanser türünde onkogenik bir aktivite gösterdiği tespit edilmiştir. Bununla birlikte AREG'in melanom gelişim mekanizmasına etkisi henüz detaylandırılmamıştır. Bu nedenle çalışmada, AREG'in canlılık, çoğalma, inflamasyon, hücre hareketliliği ve hücre ölümü üzerindeki etkilerinin CRISPR-Cas9 metodu ile AREG proteini baskılanmış B16F10 ve normal B16F10 hücrelerinde araştırılması amaçlandı. Bu hücrelere canlılık analizi ve akridin oranj/etidyum bromür boyaması yapıldı, hücre çoğalması ise tripan mavisi ile analiz edildi. İnvazyon için Boyden chamber ve hücre göçü için yara iyileşmesi deneyi yapıldı. CRISPR-Cas9 ile AREG geninde meydana getirilen nükleotit değişiklikleri SANGER dizileme ile incelendi ve AREG gen ifadesi kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PZR), protein ifadesi ise immünositokimya yöntemi ile değerlendirildi. Apoptoz; kaspaz-3,-8,-9 ile, inflamasyon; interlökin 6 (IL-6), tümör nekroz faktör-alfa (TNF-α) ve nuklear faktör kappa B ile; hücre hareketliliği, matriks metalloproteinaz (MMP) -2 ve -9 ile qRT-PZR yöntemi kullanılarak değerlendirildi. Ayrıca MMP-2 ve MMP-9 enzim aktiviteleri jelatin yıkım analizi ile incelendi. Bulgularımız, CRISPR-Cas9'un nükleotit değişikliklerine neden olarak AREG'in gen ve protein ifadesini baskıladığını gösterdi. AREG'in baskılanması melanom invazyonunda ve göçünde rol alan MMP-2 ve -9, inflamasyonunda rol alan TNF-α ve IL-6'yı azalttı. Ayrıca, kaspaz-3, -8 ve -9 gen ifadelerinin artması apoptoz ile hücre ölümünü destekledi. Sonuç olarak melanom hücrelerinde CRISPR-Cas9 ile AREG'in baskılanması canlılığı, çoğalmayı, inflamasyonu ve hücre hareketliliğini azaltıcı, apoptozu ise artırıcı etki göstermiştir. Bu nedenle AREG'in melanom tedavisinde etkili bir terapötik hedef olarak değerlendirilebileceği öngörülmektedir.
Vitamin D'nin akson gelişiminde ve rejenerasyonundaki rolünün incelenmesi
Merkezi sinir sisteminde akson rejenerasyonunun kontrolü nörobiyolojide çözülmemiş bir sorun olarak kalmıştır. Primer nöron kültürü, nöronal polarizasyon, nörit büyümesi, akson rehberliği (yol bulma), sinaptogenez ve nöronal ağ oluşumu gibi MSS gelişiminin yanı sıra nöronal olgunlaşma ve fonksiyonel aktiviteyi incelemek için altın standart olarak kabul edilmektedir. Literatürde vitamin D'nin MSS'de akson rejenerasyonu üzerine etkisini gösteren sınırlı sayıda çalışma bulunmaktadır. Uygun nörotrofik faktörler ile akson ve nöronların uyarılması yoluyla MSS aksonlarının rejenerasyonunun bir dereceye kadar teşvik edilebildiği gösterilmiştir. Çalışmamızda primer nöron kültüründe nöronların olgunlaşma sürecini temsil eden kültürün 1. ile 7. günleri arasında vitamin D'nin nöronal gelişim üzerindeki etkileri değerlendirilmiştir.Vitamin D'nin rejeneratif süreçler üzerindeki etkisi ise, 7. günden itibaren olgun nöron fenotipi kazanan ve yetişkin nöronlarla benzer özellikler sergileyen hücreler üzerinde incelenmiştir. Bu doğrultuda elde ettiğimiz sonuçlar; nöronal gelişim sürecinde uygulanan vitamin D'nin nörit uzunluğunu, nörit uzama hızını ve dinamik mikrotübül yoğunluğunu artırdığını; DLK-MAPK sinyal yolağında görev alan DLK proteininin seviyesini yükselttiğini, buna karşılık DCX ve fosforile DCX (pDCX) protein seviyelerini ise azalttığını gösterdik. Bununla birlikte nöronal gelişim, aksonal yol bulma ve sinaptik plastisite gibi süreçlerde işlev gördüğü bilinen GAP43, STMN2 ve 14-3-3 zeta/delta protein seviyelerinde de vitamin D uygulamasına bağlı bir artış gözlemledik. Ayrıca, vitamin D uygulamasını takiben vitamin D reseptörü (VDR) ile DLK ve STMN2 proteinlerinin bir arada bulunabileceğini gösterdik. Aksonal hasar sonrasında gerçekleştirilen rejenerasyon deneylerinde ise, vitamin D'nin, rejeneratif süreçler ile ilişkili GAP43 ve STMN2 proteinlerinin ekspresyon düzeylerini arttırdığını belirledik. Bulgularımız, vitamin D'nin yalnızca gelişimsel süreçlerde değil, aynı zamanda rejeneratif yanıtların düzenlenmesinde de etkin bir rol oynayabileceğini göstermektedir.
Pankreas kanseri hücrelerine lifirafenib uygulaması ile hücre ölüm yolaklarının değerlendirilmesi
Pankreatik duktal adenokarsinom (PDAC), kötü prognoz ile ilişkilendirilen metastatik bir kanser türüdür. PDAC gelişimi, onkogenlerde ve tümör baskılayıcı genlerdeki somatik mutasyonlarla ilişkilendirilmiştir. Özellikle Kirsten RAS genindeki (KRAS) mutasyonlar, pankreas kanseri hastalarının yaklaşık %95'inde görülmektedir. Epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) ve KRAS gibi onkogenleri baskılamak amacıyla geliştirilen ve klinik faz çalışmaları devam eden inhibitörlerden biri olan lifirafenib bu çalışmanın odak noktasını oluşturmuştur. Ayrıca lifirafenib apoptoz, asidoz, hipoksi gibi koşulların kanser tedavilerine karşı direnç geliştirmesiyle bağlantılıdır. Bu nedenle hipoksiye bağlı tümör mikroçevresi ile ilişkili moleküler hedeflerin araştırılması büyük önem taşımaktadır. Karbonik anhidraz9 (KA9), hipoksiye ve asidoza karşı gelişen adaptasyonlarda görev alan, kanser gelişiminde rol oynayan bir hücre yüzey glikoproteinidir. Bu çalışmada, lifirafenib'in Panc02 hücrelerine olan etkilerini inceleyerek, alkaliptoz ve apoptoz ile ilişkili gen ifadelerini değerlendirip, pankreas kanserinde tedavi ajanı olarak kullanılabilmesi için moleküler mekanizmasına açıklık getirilmesi amaçlandı. Apoptoz ve alkaliptoz belirteçlerini tespit etmek için gerçek zamanlı kantitatif polimeraz reaksiyonu (qRT-PZR) ve immünositokimya (ICC) yöntemleri uygulandı. Farklı dozlarda uygulanan lifirafenib Panc02 hücrelerinin canlılık oranlarını %50'den fazla düşürdü. qRT-PZR sonuçlarında apoptoz belirteçlerinde düşüş saptanırken, protein düzeylerinde kontrol grubuna göre artmış olduğu bulundu. Sonuç olarak lifirafenib'in Panc02 hücrelerini programlı ve programsız olarak ölüme götürdüğünü ve protein düzeyinde farklı ölüm yollarını aktive ettiğini söyleyebiliriz. Bu bulgular, hedefe yönelik tedavi yaklaşımlarının pankreas kanseri yönetiminde umut vadettiğini göstermektedir.
Prematür kromozom kondensasyonuyla elde edilmiş interfaz kromozomları ile mitotik kromozomlardaki histon modifikasyonlarının immünfloresan yöntemle incelenmesi
DNA dizisini değiştirmeden gen ekspresyonunu düzenleyen ve hücre bölünmelerinde kalıtılabilen "Epigenetik" değişimler; DNA metilasyonu, posttranslasyonel histon modifikasyonları ve kodlamayan RNA'lar aracılığıyla meydana getirilir. Histon modifikasyonları, immünfloresan yöntemlerle spesifik antikorlar kullanılarak kromozomlar üzerinde gösterilebilmektedir. Sitogenetik tekniklerle epigenetik çalışmaları birleştiren, dolayısıyla "Sitoepigenetik" olarak adlandırılabilecek bu yöntemlerle metafaz kromozomları üzerinde yapılan –az sayıda- çalışma bulunmakla birlikte, PCC yöntemiyle elde edilmiş interfaz kromozomlarında henüz bu tür çalışmalar bildirilmemiştir. PCC, kalikulin A gibi fosfataz inhibitörleri kullanılarak interfazda kromozom elde edilebilmesini sağlayan bir yöntemdir. Sağlıklı yetişkin gönüllülerden elde edilen izole lenfositler üzerinde gerçekleştirilen bu çalışmada H3K79me2 ve H3K27me3 histon modifikasyonları spesifik antikorlar kullanılarak hem metafaz, hem de PCC yöntemiyle elde edilmiş interfaz kromozomları üzerinde gösterilmiştir. İnterfaz ve metafaz kromozomları elde etmek için yapılan kültürlerin çıkış aşamasında asitli fiksatifler içermeyen ve histon proteinlerini koruyan yöntemler kullanılarak kromozom yaymaları yapılmıştır. Hazırlanan preparatlara, seçilen histon modifikasyonlarına özgü antikorlarla immunofluoresan yöntem uygulanmış ve preparatlar floresan mikroskobunda incelenmiştir. H3K79me2 ve H3K27me3 modifikasyonlarının hem interfaz, hem de metafaz kromozomları üzerinde özgün bant desenleri sergilediği gösterilmiştir. H3K27me3 ve H3K79me2 modifikasyonlarına özgü bant paternlerinin genel olarak birbirlerine benzer olduğu ve PCC ve metafaz kromozomlarında genellikle değişmediği tespit edilmiştir. Ancak PCC kromozomlarının interfaz kromatininin histon modifikasyon paternini koruyup korumadığını anlamak için farklı modifikasyonları hedef alan çalışmalar yapılması gerekmektedir. Çalışmamız, interfaz kromatininindeki histon modifikasyonlarını tek hücre düzeyinde ve kromozomlar üzerinde gösteren ilk çalışmadır ve hücre döngüsü ile hücre farklılaşma mekanizmalarının epigenetik altyapısının aydınlatılmasına katkı sağlayacaktır.
Yüksek moleküler ağırlıklı hyaluronik asit ile uyarılmış WWOX''un baş ve boyun kanserindeki rolünün araştırılması
Bu tez çalışmasında, yüksek moleküler ağırlıklı hyaluronik asit (HMW-HA)'in baş ve boyun kanserindeki biyolojik etkileri ve bu etkinin tümör baskılayıcı WWOX geni ile ilişkisi araştırılmıştır. SCC-25 kanser ve HET-1A normal hücre hatlarında yapılan uygulamalarda, HMW-HA'nın hücre canlılığı, sitotoksisite, apoptoz göstergeleri ve hyaluronidaz (HYAL1) düzeyleri üzerindeki etkileri analiz edilmiştir. Moleküler yerleştirme çalışmaları ile HMW-HA'nın WWOX proteini ile olası bağlanma bölgeleri belirlenmiş; RT-qPCR ve Western blot analizleri ile WWOX ve ilişkili genlerin ifade düzeyleri değerlendirilmiştir. Bulgular, HMW-HA'nın WWOX ifadesini artırdığını ve bazı apoptozla ilişkili genlerin ifadesini değiştirdiğini göstermiştir. Bu sonuçlar, HMW-HA ve WWOX'un birlikte hedeflenmesinin baş ve boyun kanserlerinde potansiyel bir tedavi stratejisi olabileceğine işaret etmektedir.
Asendan aort anevrizmalı hastalarda lncRNA LUCAT1 ekspresyonu ile inflamasyon belirteçleri arasındaki ilişkinin araştırılması
Aort anevrizmaları, aort duvarının zayıflamasından kaynaklanan ve aortun ≥%50 (1,5 kat) anormal genişlemesine yol açan ciddi damar hastalıkları olup aort diseksiyonu gibi hayatı tehdit eden komplikasyonlara yol açabilmektedir. Aort anevrizmalarının başlıca nedenleri arasında sigara kullanımı, beyaz ırk, erkek cinsiyet, aile öyküsü, hipertansiyon, hiperlipidemi, biküspid aort valfi yer almaktadır. Diğer nedenler arasında ateroskleroz, travma, bağ dokusu bozuklukları, enfeksiyonlar ve inflamatuvar hastalıklar yer almaktadır. Son yıllarda lncRNA'lar kardiyovasküler hastalıkların gelişiminde önem kazanmıştır. LncRNA LUCAT1, sitoplazmada transkripsiyon sonrası ve translasyonel süreçlerin düzenleyicisi olarak tanımlanırken, çekirdekteki varlığı epigenetik ve transkripsiyonel düzenlemedeki rollerle ilişkilendirilmiştir. Aort anevrizmalarının gelişiminde yer alan inflamatuvar süreçler, LUCAT1'in ekspresyonunu etkileyerek hastalığın ilerlemesine katkıda bulunabilmektedir. Ayrıca, LUCAT1 vasküler düz kas hücrelerinin fenotipik değişiminin düzenlenmesinde rol oynamaktadır. Çalışmamızın amacı, asendan aort anevrizması (AsAA) olan hastalarda ve sağlıklı kontrollerde lncRNA LUCAT1'in ekspresyon düzeylerini ve inflamatuvar sitokinlerden IL-6 ve TNF-α'nın plazma düzeylerini belirlemektir. Çalışmamızda AsAA tanısı alan 56 hasta ve 74 sağlıklı kontrolde LUCAT1 ekspresyonu kantitatif gerçek zamanlı-polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR), IL-6 ve TNF-α sitokin düzeyleri ise ELISA yöntemi ile belirlendi. LUCAT1 ekspresyon düzeyleri AsAA grubunda sağlıklı kontrollere kıyasla anlamlı derecede düşük bulundu (p<0.001). AsAA ve kontrol grupları arasında plazma IL-6 ve TNF-α düzeyleri karşılaştırıldığında, IL-6 ekspresyonu hasta grubunda kontrol grubuna kıyasla yüksek bulundu ancak sonuçlarımız istatistiksel anlamlılık sınırına ulaşamadı (p=0.070), hasta ve kontrol grupları arasında TNF-α düzeyleri açısından anlamlı bir fark tespit edilmedi (p=0.535). LUCAT1 ekspresyonu ile biyokimyasal parametreler arasındaki ilişki Spearman's korelasyon testi ile değerlendirildiğinde, AsAA grubunda LUCAT1 ekspresyonu ile ürik asit arasında pozitif yönde (rs=0.251, p=0.062), CK-MB arasında ise negatif yönde bir korelasyon tespit edildi (rs=-0.242, p=0.076). Ancak sonuçlarımız istatistiksel anlamlılık sınırına ulaşamadı. Sonuç olarak, AsAA grubunda kontrol grubuna kıyasla LUCAT1 ekspresyon düzeyinin anlamlı derecede düşük bulunması AsAA patogenezinde lncRNA LUCAT1'in önemli bir rolü olduğunu düşündürmektedir. LUCAT1'in aşağı yönde regülasyonu vasküler düz kas hücrelerinin fenotipik değişiminde ve dolayısıyla vasküler tonusta rol oynayabilir.
Radyasyon uygulanan baş boyun kanseri hücre hatlarında uzun kodlamayan RNA PCAT6 ifadesinin incelenmesi
Baş-boyun kanserleri (BBK), üst solunum ve sindirim sistemlerinin mukozal yüzeylerinden ve altındaki yapıların epitel dokularından köken alan yassı hücreli karsinomlar olup, dünya genelinde en sık görülen kanser türleri arasında yer almakta ve yüksek mortalite oranlarıyla dikkat çekmektedir. BBK vakalarının çoğu ileri evrelerde teşhis edilmekte; bu durum, tedavi etkinliğini sınırlamaktadır. Cerrahi, radyoterapi ve kemoterapi gibi multimodal tedavilere rağmen, özellikle radyodirenç ve tedaviye bağlı toksisite hala önemli engeller olarak karşımıza çıkmaktadır. Bu durum, bireysel tedavi yanıtlarını öngörebilmek için moleküler biyobelirteçlere dayanan kişiselleştirilmiş tedavi stratejilerinin gerekliliğini ortaya koymaktadır. Son yıllarda, gen ifadesinin epigenetik ve transkripsiyonel düzeyde düzenlenmesinde görev alan uzun kodlamayan RNA'ların (lncRNA) kanser biyolojisinde önemli roller üstlendiği gösterilmiştir. Bazı lncRNA'lar onkogenik olarak hücrelerinin proliferasyonunu, invazyonunu ve metastatik kapasitesini artırabiliyorken, bazılarının ise tümör baskılayıcı işlevlerle hücre çoğalmasını engelediği ve apoptozu tetiklediği görülmüştür. Bu çalışmada, çeşitli kanser türlerinde onkogenik etkisi bildirilmiş olan lncRNA PCAT6'yı kodlayan genin BBK hücrelerindeki ifadesi ve radyasyona verdiği yanıt araştırılmıştır. İnsan hipofarenks yassı hücreli karsinom hücre hattı (FaDu) ve normal insan özofagus epitelyal hücre hattı (HET-1A) kullanılarak PCAT6'nın temel ifade düzeyleri karşılaştırılmıştır. Ardından, FaDu hücreleri 0, 2, 4 ve 6 Gy dozlarında radyasyona maruz bırakılmış ve 0, 24, 48 ve 72 saatlik zaman noktalarında PCAT6 ifadesindeki değişimler değerlendirilmiştir. PCAT6 ifadesi, HET-1A hücre hattına göre FaDu hücre hattında %127 oranında artış göstermiştir. Bu bulgu, PCAT6'nın BBK hücrelerinde onkogenik bir rol oynayabileceğini düşündürmektedir. Radyasyon uygulanmış FaDu hücrelerinde ise net bir ifade paterni gözlemlenmemekle birlikte, her doz kendi içinde farklı zaman noktalarında anlamlı ifade değişiklikleri göstermiştir. PCAT6 ifadesi, 2 ve 4 Gy dozlarında radyasyona maruz bırakılan hücrelerde 48–72 saatlik zaman aralığında azalma göstermiş; bu baskılanma en belirgin şekilde 4 Gy doz uygulanan hücrelerde gözlemlenmiştir. Buna karşın, 6 Gy uygulanmış grupta 72. saatte PCAT6 ifadesinde yeniden bir artış saptanmış ve bu durum, tedaviye dirençli hücre alt popülasyonlarının varlığına ve PCAT6'nın radyodirençle ilişkili olabileceğine işaret etmektedir. Sonuç olarak, bu çalışma PCAT6'nın baş-boyun kanseri hücrelerinde onkogenik bir rol üstlendiğini ortaya koymaktadır. Ayrıca, PCAT6 ifadesinin uygulanan radyasyon dozlarına bağlı olarak değişkenlik gösterdiği ve kompleks bir ifade profili sergilediği belirlenmiştir.
Prostat kanserinde DNA tamir enzim gen ifadelerini etkileyen miRNA ifade değişimlerinin incelenmesi
Prostat kanseri, küresel ölçekte dikkat çeken bir sağlık sorunudur. Erkeklerde en sık görülen kanser türleri arasında ikinci sırada yer almaktadır. Prostat kanser patogenezi, DNA tamir mekanizmaları ile de ilişkili olabilen genetik ve epigenetik değişimlerin yanı sıra hormonal dengesizlikler, çevresel faktörler ile ilişkilendirilmiştir. Özellikle çift zincir kırıkları tamir mekanizmalarındaki bozukluklar, prostat kanserinin gelişimi ve ilerlemesinde önemli bir rol oynadığı bilinmektedir. MikroRNA'lar, intronik veya ekzonik DNA dizilerinden kopyalanan küçük tek sarmallı, kodlamayan dizilerdir. Ggen ifadesinin post-transkripsiyonel düzenlenmesinde çok önemli rol oynarlar. Bu çalışmada, 50 prostat kanser hastasının patolojik olarak teyit edilen tümörlü ve normal dokularında, çift zincir kırık tamir mekanizması ile ilişkili rolleri olan miR-155, miR-1246, miR-210, miR-34c ve miR-421 gen ifade düzeyleri kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) yöntemiyle analiz edip, hastaların klinik bulguları ile birlikte değerlendirdik. miR-155, miR-1246, miR-210 ve miR-421'in tümörlü ve normal dokulardaki ifade düzeyleri arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark tespit edilmemiştir (P:0.05). Buna xv karşın, miR-34c'nin tümörlü dokulardaki ifade düzeyinin, normal dokulara kıyasla anlamlı düzeyde düştüğünü tespit ettik (p=0.001). Gen ifade düzeyindeki kat değişimi (2 –ΔΔCT ) 0.31 olarak tespit edildi. miRNA'lar arasındaki ilişki incelendiğinde hem normal dokuda hem de tümör dokusunda farklı miRNAlar arasında ilişki tespit edildi. Tümör dokularda yaş ile miR 34c ifade düzeyi arasında ters bir korelasyon olduğu tespit edilmiştir (r: -0.362, p=0.008). Yaş arttıkça miR-34c ifade düzeyi düşmektedir. Diğer yandan tümör dokusunda PSA ile miR-210 (r: 0.353, p=0.011) ve miR-1246 arasında (r: 0.594, P:0.0001) istatiksel olarak anlamlı bir korelasyon olduğu tespit edildi. PSA arttıkça miR-210 ve miR-1246 ifade düzeyi de artmaktadır. Elde edilen bulgular, miR-34c'nin prostat kanseri gelişiminde ve ilerlemesinde önemli bir rol oynayabileceğini düşündürmektedir. Çalışmanın, prostat kanseri ile DNA tamir mekanizmaları ve DNA hasarlarının onarımı arasındaki ilişkilerin aydınlatılmasına katkı sağlayacağını umuyoruz.
Tazemetostat'ın hepatoselüler karsinom hücrelerindeki etkisinin NF-κB yolağı üzerinden in vitro ve in siliko yöntemlerle incelenmesi
Primer karaciğer kanseri, dünya genelinde altıncı sıklıkta ve üçüncü ölüm nedeni olarak kabul edilir; küresel olarak, hepatoselüler karsinom (HCC) bu vakaların yaklaşık %75'ini oluşturur. Çeşitli genetik ve epigenetik değişiklikler beraber sinyal yolaklarını etkileyerek karsinogenez sürecinde rol alır. Kanserde etkili bir yolak ise NF-κB/IKK olup hücre büyümesi, proliferasyon, differansiyasyon, canlılık, apoptoz gibi birçok biyolojik süreçle ilişkilendirilir ve bu süreçleri merkezi bir rolde düzenler. NF-kB'nın inhibisyonu kanser gelişimini engellerken aktivasyonu, dokuların invazyonuna ve metastazına yol açan epitel-mezenkimal geçiş (EMT) ile ilişkilendirilir. Bu tez çalışmasında, Tazemetostat uygulamasının HEPG2 (hepatoselüler karsinom) ve HUVEC hücrelerinin canlılık ile proliferasyonu üzerindeki etkisinin, MMP2 ve MMP9 genlerinin ve proteinlerinin ekspresyonun üzerindeki etkilerinin ve ilaçla NF-kB yolağının ilişkisinin araştırılması amaçlandı. EMT sürecinde aktif rol alan MMP2 ve MMP9 proteinlerinin miktar ölçümleri için immünositokimya metodu uygulandı. NF-kB ile Tazemetostat etkileşiminin ölçülmesi için moleküler yanaştırma, NF-kB aktivitesinin ölçülmesi için ELISA, qRT-PCR ile MMP2 ve MMP9 gen ekspresyonları analiz edildi. Moleküler yanaştırmada Tazemetostatın NF-kB p65 alt birimine negatif bağlanma enerjisi (kcal/mol) ile afinite gösterdiğine dair sonuç alındı. Tazemetostatın farklı dozları (5 µM, 12 µM, 30 µM, 60 µM ve 100 µM) HEPG2 ve HUVEC hücrelerinin proliferasyon ve canlılığını ve NF-κB p65 aktivitesini doza bağlı olarak azaltmış, HEPG2 hücrelerinde daha anlamlı ve belirgin bir azalma gözlenmiştir. Tazemetostatın 60 µM ve 100 µM dozları HEPG2 hücrelerinde, 100 µM dozu HUVEC hücrelerinde MMP-2 ve MMP-9 genleri ile MMP-2 ve MMP-9 proteinlerinin ekspresyonunu azalttığı görülmüştür.
Tümör ilişkili nötrofiller ve nötrofil hücre dışı tuzakların kolon kanserinin gelişimi ve metastazındaki rolleri
Kolon kanseri, tüm dünyada en sık görülen malignitelerden biridir ve ileri evrelerde metastatik yayılım, tedavi başarısını önemli ölçüde kısıtlamaktadır. Son yıllarda yapılan çalışmalar, tümörle ilişkili nötrofiller ve onların oluşturduğu nötrofil hücre dışı tuzakların tümör mikroçevresinde pro-tümöral işlevler üstlenebileceğini ortaya koymuştur. Bu çalışmanın amacı, kolon kanseri hastalarında tümörle ilişkili nötrofillerle ilişkili genlerin ekspresyon düzeylerini incelemek, bu genlerin metastaz, evre, immünoterapi yanıtı gibi klinik parametrelerle ilişkisini ortaya koymak ve nötrofil hücre dışı tuzaklar / tümör ilişkili nötrofil biyolojisinin kolon kanserinin gelişimi ve ilerlemesindeki potansiyel rolünü moleküler düzeyde değerlendirmektir. Bu kapsamda çalışmada; ACTB, MAPK1, MAPK14/p38, MTOR, NCF1, NCF2, PAK1, PAK3, CXCR2, CEACAM1, PGC1A, PIK3CA, PAD4, ITGAM (CD11b), CYBA, HMGB1, CXCR1, ILK, PRKCA, NCF2, H3C14, SELPLG (CD162), TLR9, SERPINB1, MPO, TLR4, CEACAM6, MMP9, PLCB1, HDAC1, CCDC25, RAC1, RAC2, FCGR1A (CD64), RELA ( P65/NF-κB3), ELANE gibi tümör ilişkili nötrofiller ve nötrofil hücre dışı tuzaklar ile ilişkili 35 genin ekspresyon düzeyleri değerlendirilmiş, bu genlerin kolon kanserin moleküler dinamiklerindeki rolleri detaylı biçimde incelenmiştir. Çalışmaya, patolojik olarak kolon kanseri tanısı almış 77 hasta ve sağlıklı bireylerden oluşan 63 kişilik kontrol grubu dahil edildi. Tüm örneklerden izole edilen total RNA'lar, cDNA'ya çevrilmiş ve gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu yöntemiyle 35 hedef genin ekspresyon düzeyi değerlendirildi. Bu genler arasında NET oluşumu MPO, ELANE, PAD4, CXCR1, ITGAM, SELPLG, MAPK1, MAPK14, PRKCA, matriks yıkımı MMP9, CEACAM1/6, TLR4, integrin bağlantılı kinaz ILK ve metabolik yeniden programlama PGC1A, MTOR gibi süreçlerle ilişkili genler yer almıştır. Ekspresyon analizleri için ΔΔCt yöntemi kullanılmış; istatistiksel analizlerde Shapiro-Wilk normallik testi, Kruskal-Wallis testi, ikili karşılaştırmalar için Wilcoxon testi, korelasyon analizleri için ise Spearman korelasyon katsayısı uygulanmıştır. Bulgular log2 fold change (log2FC) ile yorumlanmış, anlamlılık düzeyi p<0,05 olarak kabul edilmiştir. Veriler grafiksel olarak ısı haritaları, karar ağaçları ve ROC eğrileri ile görselleştirilmiştir. Hastalardaki gen ekspresyon profilleri sağlıklı bireylerden oluşan kontrol grubuyla karşılaştırılmış ve anlamlı fark gösteren genlerin hastalığın invazivliği, metastatik durumu, tümör evresi, CEA düzeyleri, nötrofil yüzdesi gibi klinik ve laboratuvar parametrelerle ilişkileri istatistiksel olarak analiz edilmiştir. Analiz edilen 35 genin 16'sının, düzeltilmiş p-değeri (padj <0.05) eşik değeri altında anlamlı olarak farklı şekilde ifade edildiği tespit edildi. Bu genlerden 8 tanesi (PAD4, HAT1, H3C14, CEACAM1, CYBA, ITGAM, MTOR, RELA) anlamlı şekilde aşağı regüle olurken, 8 genin (HDAC1, ELANE, CXCR1, ILK, MPO, SELPLG, TLR9, PAK3) yukarı regüle olduğu belirlendi. Bazı genlerin ekspresyon düzeyleri, klinik evre, metastaz varlığı ve tedavi yanıtı ile anlamlı korelasyon göstermiştir. Gen ekspresyonları açısından; ILK ve HDAC1 tanı, PAD4, ILK, CYBA genleri metastatik yayılım, H3C14 evre, MPO ve TLR9 lenf nodu tutulumu, ELANE ve CYBA CA19-9 düzeyi, ELANE, PAD4 ve TLR9 genleri CEA düzeyi ile anlamlı korelasyon gösterdiği saptandı. Karar ağacı ve ROC analizleri, bazı gen kombinasyonlarının kolon kanserinde prognostik değer taşıyabileceğini ortaya koymuştur. Bu çalışma, tümör ilişkili nötrofiller / nötrofil hücre dışı tuzaklarla ilişkili genlerin kolon kanseri progresyonu ve metastazında önemli roller üstlenebileceğini ortaya koymaktadır. Özellikle immün mikroçevrenin yeniden şekillenmesi, tedaviye direnç mekanizmaları ve premetastatik niş oluşumuna katkı sağlayan genlerin belirlenmesi, immünoterapilere yönelik yeni hedeflerin tanımlanması açısından klinik önem taşımaktadır. Tümör ilişkili nötrofiller / nötrofil hücre dışı tuzakların eksenine yönelik moleküler hedefleme stratejileri, kolon kanserinin daha etkin yönetiminde umut verici bir yol sunabilir.
CDK4/6 inhibisyonunun glioblastoma T98 hücre soyunda ribozomal protein RPL22L1 ve FAU genlerinin ekspresyonu üzerine etkisi
Agresif bir seyir izleyen malign primer beyin tümörü olan Glioblastoma (GBM) kötü prognoza sahiptir. Hastalığın tedavisinde hala tam başarı yoktur. GBM'de de sağlıklı hücrelere kıyasla oldukça aktif ve hızlı ribozom biyogenezi görülmektedir. Ribozom biyogenezinin düzenlenmesinde hücre döngüsü kontrol proteinlerinin rolü vardır. Ribozomal protein RPL22L1 aşırı ekspresyonu agresif fenotiplerin ortaya çıkmasından sorumlu tutulur ve yeni bir onkogen adayı olarak ileri sürülür. RPL22L1'in hücre proliferasyonu, invazyonu ve migrasyonunda rol aldığı, GBM'de kötü prognozla ilişkili olduğu ileri sürülmüştür. Pro-apoptotik olduğu ifade edilen FAU proteininin STRING veri tabanında RPL22L1 ile ko-eksprese olduğu gösterilmektedir. Ribozom biyogenez kontrolünün kanserde potansiyel bir tedavi olabileceği konusunda yeni stratejiler geliştirilmektedir. RPL22L1 ile FAU'nun olası bu ilişkisinin GBM patolojisindeki ortak rolleri hakkında bilgi yoktur. Bu çalışmada U87 ve T98G hücre hatlarında, yeni nesil bir CDK4/6 inhibitörü olan Ribociclib'in RPL22L1 ve FAU üzerindeki etkileri ile dirençli GBM'deki güçlü antitümör özelliğinin araştırılması amaçlanmıştır. Bu çalışmada, U87 ve T98G hücre hatlarına uygulanan Ribociclib uygulamasının her iki hücre soyunda da hücre canlılığı üzerine etkili olduğu belirgin olarak tespit edildi. Yara iyileşmesi analizi T98G'in U87 hücre hatlarına kıyasla Ribociclib'ten daha çok etkilendiğini gösterdi. Sonuçlarımız GBM'de Ribociclib'in, ribozomal biyogenezde aktif rolü olan RPL22L1 ile FAU proteinlerinin olası gen ekspresyonlarının değişimine neden olarak ve/veya farklı hücresel proteinlerle etkileşime girerek etkili doğrudan veya dolaylı yoldan antikanserojen etkiye sahip olabileceğinin ön bulguları elde edildi. Daha ileri çalışmalar ile bu bulguların desteklenmesi gerekmektedir.
Kistik fibrozis hastalarında fenotipik ciddiyeti etkileyen genlerin ve ilişkili yolakların araştırılması
Otozomal resesif kalıtılan hastalıklar arasında en sık görülen kistik fibrozis, Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) genindeki mutasyonlar sonucu oluşmaktadır. Hastalık ciddiyetinin belirlenmesinde CFTR mutasyonlarının yanı sıra ciddiyeti modifiye eden genler ve çevresel faktörler rol oynamaktadır. İlginç bir bulgu olarak, aynı CFTR mutasyonuna sahip olmalarına rağmen farklı klinik ciddiyete sahip hastalar da bulunmaktadır. Ciddiyetin hastalarda heterojenlik göstermesi ve genotip-fenotip korelasyonunun kurulamaması tedavi yaklaşımlarını oldukça zorlaştırmaktadır. Tez çalışması kapsamına; Sınıf II grubunda yer alan, F508del/F508del ve F508del/G85E mutasyonlarını içeren iki hasta kardeşten oluşan iki aile, Sınıf IV grubunda yer alan I1234V/I1234V mutasyonunu içeren üç hasta kardeşten oluşan bir aile ve kronik hastalık öyküsü olmayan üç sağlıklı kontrol dahil edilmiştir. Klinik seyirleri farklı olan (ağır/ hafif) hasta kardeşler arasında ifade farklılığı gösteren genler gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu prensibine dayalı kistik fibrozis PCR array yöntemiyle saptanmış ve bu genlerle ilişkili yolaklar tanımlanmıştır. Sınıf II grubunda yer alan ağır seyirli hastalarda, inflamasyon ve immün cevapta görevli IL-17(CXCL1, CXCL2), NF kappa B (TNFRSF11A), TNF, sitokin-sitokin etkileşimi, araşidonik asit, nekroptozis, SNARE etkileşim (STX1A) ve sodyum iyonunun geri emilim (SLC9A3R2) yolakları saptanmıştır. Sınıf IV'e özgü olarak AGE-RAGE, TLR sinyal yolakları bulunmuştur. Tüm hastaların birlikte değerlendirilerek kontrol grubu ile karşılaştırıldığında ifade farklılığı anlamlı genler ICAM1, EZR, TNFRSF1A ve HSP70 olarak belirlenmiştir. Ek olarak, hastalarda ifade farklılığı gösteren genler ile karaciğer tutulum bulguları arasında korelasyon saptanarak bu genlerin AGE-RAGE, sitokin-sitokin etkileşim ve insülin direnci sinyal yolaklarında yer aldıkları gösterilmiştir. Bu çalışma ile, aynı sınıf mutasyona sahip ağır ve hafif seyir gösteren hasta kardeşler arasında fenotipik ciddiyeti etkileyebilecek genler ve ilişkili yolaklar aydınlatılmıştır. Tez çalışması, ileri dönemde tedavi için yeni hedef moleküllerin geliştirilmesine olanak sağlayabilecektir. Anahtar Kelimeler: Kistik fibrozis, CFTR, modifiye edici genler,genotip-fenotip ilişkisi
Kistik fibrozis patogenezinde aday miRNA ve hedef genlerinin biyoinformatik araçlarla tanımlanması
Kistik fibrozis transmembran regülatör (CFTR) genindeki mutasyonların sebep olduğu kistik fibrozis (KF) otozomal resesif kalıtılan oldukça yaygın görülen genetik bir hastalıktır. Hastalık ciddiyeti mutasyonların CFTR proteini üzerindeki etkisiyle ilişkilendirilse de aynı mutasyonu taşıyan hastalarda hastalık ciddiyetini epigenetik faktörlerin de etkilediği bilinmektedir. Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı ve Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Anabilim Dalı Göğüs Hastalıkları Ünitesi iş birliği ile gerçekleştirdiğimiz ön çalışmalar sonucunda aynı mutasyonu taşımasına rağmen hastalık ciddiyeti farklı seyreden kardeşler saptanmıştır. Gerçekleştirdiğimiz ön çalışmalarda hasta kardeşlerden elde ettiğimiz nazal sürüntüler kullanılarak; hedeflenmiş transkriptomik Kistik Fibrozis PCR Array yöntemi ile ifade farklılığı gösteren genler ve yolaklar saptanmıştır. Bu tez çalışmasında amacımız, aynı CFTR mutasyonuna sahip olmalarına rağmen farklı klinik ciddiyete sahip hasta kardeşlerde ifade değişikliği gösteren, fenotipik farklılığı açıklamaya yönelik ortak miRNA'ların ve hedef genlerinin tanımlanmasıdır. Bu amaç ile Hacettepe Üniversitesi Kapsamlı Araştırma Projesinde (TSA 201816629) gerçekleştirilmiş olan miRNA array ham verisi farklı biyoinformatik araçlarla tanımlanmış, kardeşler arasında klinik heterojeniteye sebep olabilecek aday miRNA'lar ve hedefleriyle ilişkili yolaklar saptanmıştır. BRB-ArrayTool, TAC 4.0 ve MeV programları kullanılarak Affymetrix miRNA 4.0 Array mikrodizin sonuçlarının ham verileri analiz edilmiş ve aday miRNA'lar seçilmiştir. Analizler sonucunda ağır seyirli hastalarda hafif seyirli hastalara göre ve Sınıf IV hasta grubunda ağır seyirli hastada hafif seyirli hastalara göre ifadesi artan miR-145-5p saptanmıştır. miR-145-5p'nin hedef genlerine ait yolak analizleri sonucunda miRWalk ve miRNET programlarında ortak ErbB sinyal yolağı elde edilmiştir. Ön çalışmamızın çıktılarında yer alan aday genlerin miRNA hedefleri olma durumu da araştırılmıştır. KF patolojisi ile uyumlu ve p değeri en yüksek IL-17 sinyal yolağı miR-145-5p için tanımlanmıştır. Ayrıca hastalarda kontrol bireylere göre ifadesi artan miR-92a-3p tanımlanmıştır. miR-92a-3p'nin hedef genlerine ait yolak analizleri sonucunda miRWalk ve miRNET programlarında en çok hedef geni içeren endositoz yolağı elde edilmiştir. Bu çalışma ile KF hastalarının klinik seyrini ve KF'ye eşlik eden diğer hastalıkların erken dönemde saptanmasını kolaylaştıracak, prognostik bir miRNA imzası tanımlanabilecek ve hastalık patogenezi ile ilişkili yeni yolaklar aydınlatılabilecektir.
Diyabet hastalarında mineral trioksit agregat/1α,25-dihidroksivitamin D3 kombinasyonu ile dental pulpa kök hücrelerinde odontojenik farklılaşmanın araştırılması
Diyabet hastalarında yapılan dental tedavilerin uzun dönemde başarısızlıkla sonuçlandığı ve bu hastalarda daha fazla diş çekimi görüldüğü bilinmektedir. Mineralizasyon mekanizmasında önemli rolü olduğu bilinen ve diyabet hastalarında sıklıkla eksikliği bildirilen Vitamin D3'un rutin diş hekimliği tedavilerinde kullanılan mineral trioksit agregat (MTA) ile kombinasyonunun diyabet hastalarından elde edilen dental pulpa kök hücreleri üzerindeki odonto/osteojenik farklılaştırma potansiyelini araştırmak hedeflenmiştir. Sigara içmeyen, insülin dışında ilaç kullanmayan üç Tip 1 diyabet hastasının ve üç kontrolün dental pulpalarından izole edilen mezenkimal kök hücrelerin özgüllüğü CD34, CD45, Nanog Oct-4, CD73, CD90 ve CD106 belirteçleri kullanılarak gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu ile değerlendirilmiştir. Hücreler dört farklı besi yerine maruz bırakılmıştır: normal besi yeri (NB): DMEM, %10 FBS, antibiyotik ve antimikotik, Farklılaştırma besi yeri (FB): NB'ye ß-gliserofosfat ve askorbik asit, FB+MTA: FB'ye 0,02mg/mL MTA ve FB+MTA+VitD3: FB+MTA besi yerine 10nM VitD3 ilavesini içermektedir. 14. günün sonunda hücrelerin odonto/osteojenik farklılaşma miktarları alizarin kırmızısı testi, gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (DSPP, DMP1, COL1α1, OCN) ve immünfloresan (anti BSP II, anti DMP1, anti COL1α1) yöntemleri ile değerlendirilmiştir. Hücrelerin mezenkimal kök hücre karakteristiği CD73, CD90 ve CD106 ifadelerinin yüksek bulunması ile gösterilmiştir. Alizarin kırmızısı boyaması, odonto/osteojenik belirteçlerin ifadesi ve immünfloresan deneyleri kontrollerde daha fazla farklılaşma olduğunu göstermiştir (p<0,05). Kontrollerde sadece MTA farklılaşmanın indüklenmesi için yeterli etkinin oluşmasını sağlarken, diyabet hastalarında bu etkinin oluşmasının sağlanması için besi yerine VitD3 ilave edilmelidir (p<0,05). Çalışmanın sınırlamaları dahilinde diyabet hastalarının dental tedavilerinde MTA'nın VitD3 ile kombinasyonunun daha ileri deneyler ile çalışılması ve sistemik hastalıklar göz önünde bulundurularak dental tedavi prosedürlerinin oluşturulması önerilmektedir.
LAP1B proteinin kas hücrelerinin transkripsiyon regülasyonundaki rolünün araştırılması
Çekirdek iç membran proteini LAP1B'nin (lamina-ilişkili polipeptit 1, izoform B) işlev kaybı insanda kas distrofisi ve kardiyomiyopatiye neden olmaktadır. LAP1B'nin kas dokusundaki işlevi henüz bilinmemektedir. Tezin amacı, LAP1B'yi ifade etmeyen kas hücrelerinin farklılaşma sürecinde transkriptom düzeyindeki değişikliklerin belirlenmesi ile, insanda neden olduğu kas distrofisinin moleküler patogenezinin anlaşılmasına katkı sağlamaktır. Bu amaçla in vitro model olarak kullanılmak üzere kontrol ve bir LAP1B-ilişkili kas distrofisi hastasına ait primer fibroblastlar ölümsüzleştirilmiş ve uyarılabilir MyoD gen transferi gerçekleştirilmiştir. Kontrol hücrelerin sekiz günde olgun miyotüpler oluşturduğu gözlenirken, mutant hücrelerin füzyon kapasitelerinin çok düşük olduğu ve farklılaşmayı tamamlayamadıkları bulunmuştur. Ayrıca C2C12 fare miyoblastlarında LAP1A/B ifadesinin baskılanmasına neden olan mutasyonlar oluşturulmuş ve aynı bulgular gözlenmiştir. RNA dizileme yöntemi ile kontrol ve mutant hücrelerde tüm transkriptom içerisinde ifadesi değişen genler ve görev aldıkları yolaklar belirlenmiştir. Bu yolaklar arasından kas kasılması, hücre döngüsü, mitozda kromatit segregasyonu ve hücre dışı matriks organizasyonu öne çıkmıştır. Mutant hücrelerin p21 ifadesinin baskılanmış olmasına rağmen hücre döngüsünden çıktıkları hücre döngüsü analizi ile belirlenmiştir. Son olarak mutant hücrelerde p53 ifadesinde ve mikroçekirdek sayısında gözlenen artışın, hücresel stres ve DNA hasarı ile ilişkili olduğu görülmektedir. Bu çalışmadan elde edilen bulgular, LAP1B'nin kas farklılaşmasının erken evresinde hücre döngüsü çıkışında rolünün olmadığı ancak miyogenin ifadesinin uyarılması için DNA hasarının tamirinde görevli olabileceğine işaret etmektedir. LAP1'in yeni yolaklardaki olası rolünün tanımlanması, tedavide hedeflenebilir yolakların keşfedilmesine de olanak sağlayacaktır.
Glukozilseramidaz-beta gen mutasyonlarının dopaminerjik nöronlarda α-sinüklein yıkım mekanizmaları üzerindeki etkilerinin araştırılması
Lizozomal Glukoserebrosidaz (GS) enzimini kodlayan Glukozilseramidaz-beta (GBA) genindeki mutasyonların, otozomal resesif kalıtılan lizozomal bir depo hastalığı olan Gaucher Hastalığı'na (GH) neden olduğu bilinmektedir. GH, hücrelerde lizozomal glukoserebrosit birikimi ile karakterize olup karaciğer, dalak, kemik iliği, akciğer ve sinir sistemi gibi farklı doku ve sistemleri etkileyerek hastalık patolojisine neden olmaktadır. Gaucher Hastalığı nörolojik bulgularına göre Tip I (nöropatik olmayan form), Tip II (akut nöropatik form) ve Tip III (kronik nöropatik form) olmak üzere klinik alt tiplere ayrılmaktadır. Son yıllarda, GH ile ilişkili olduğu kanıtlanmış GBA mutasyonlarının Parkinson Hastalığı (PH) ve diğer sinükleopatiler için en önemli risk faktörü olduğu da tanımlanmıştır. Bu bağlamda, yapılan moleküler analizler, mutant Glukoserebrosidaz (GS) enziminin ?sinüklein birikimini tetikleyerek patolojiye neden olduğunu göstermiştir. GS ve α-sinüklein birikimi arasındaki patolojik ilişkiyi açıklayabilmek için, hücre içi lipit kompozisyon değişikliği, otofajik/lizozomal fonksiyon bozukluğu, Ubikitin Proteozom sistemindeki bozukluklar ve hücre içi kalsiyum dengesinin bozulması gibi birçok farklı mekanizma öne sürülmesine rağmen iki hastalık arası ilişkinin temelleri hala tam olarak bilinmemektedir. Bahsi geçen ilişkiyi açıklayabilmek için öne sürülen patolojik mekanizmalardan biri de, GBA mutasyonları sonucu Glukoserebrosidaz enzim aktivitesindeki değişikliklerin α-sinükleinin yıkım mekanizmalarını etkileyerek hücre içi α-sinüklein birikimine neden olduğudur. Yapılan çalışmalar, GS enzim eksikliğinin, α-sinükleinin yıkımından sorumlu olan Ubikitin-Proteazom Sistemi (UPS), Şaperon Aracılı Otofaji (ŞAO) ve Makrootofaji mekanizmalarını etkileyerek α-sinüklein birikimine neden olabileceğini göstermiştir. Hücredeki protein kalite kontrolünün sürekliliği için bu mekanizmaların gerekli durumlarda birbirlerini kompanse ettiği bilinmektedir. Fakat, GBA mutasyonları sonucu oluşan GS enzim eksikliğinin bu mekanizmaları nasıl etkilediği tam olarak bilinmemektedir. Bu bilgiler ışığında, nöropatik ve nöropatik olmayan Gaucher Hastalığı'na neden olan farklı GBA mutasyonlarının, hücrelerde biriken α-sinükleinin yıkım mekanizmaları arasındaki ilişkiyi etkileyerek nöronal dejenerasyonda rol oynayabileceği hipotezi kurulmuştur. Bu amaçla, farklı nörolojik tutulum gösteren Gaucher hastalarından ve Parkinson hastalarından alınan fibroblast kültürlerinden elde edilecek olan indüklenmiş pluripotent kök hücre (iPKH) kökenli dopaminerjik nöron kültürlerinde, GBA mutasyonlarının biriken α-sinükleinin yıkımında rol oynayan Ubikitin Proteozom Sistemi (UPS), Şaperon Aracılı Otofaji (ŞAO) ve makrootofaji mekanizmalarını nasıl etkilediğinin araştırılması amaçlanmaktadır. GBA mutasyonlarının, α-sinüklein yıkım mekanizmaları üzerine etkilerinin belirlenmesi nörolojik tutulumlu Gaucher Hastalığı patogenezinin aydınlatılması açısından büyük önem taşımaktadır.
Desma mutant zebra balığı modelinde tedavi amaçlı XMU-MP-1-1 uygulaması
Zebra balığı, ilaç araştırmalarında sıklıkla kullanılan bir model organizmadır. Bu tez çalışmasında, seçici olarak Hippo yolağının inhibisyonunu sağlayan bir MST1/2 kinaz inhibitörü olan XMU-MP-1 ilaç adayı molekülü, zebra balığı embriyolarının bulundukları ortama ve erişkin balıkların sırt kasına uygulanmıştır. Bu çalışmanın temel amacı zebra balığı embriyolarında ve erişkin balıklarda ilaç adayı moleküllerin taranması için gerekli olan toksisite deneyleri ve ilaç uygulamaları ile ilişkili algoritmayı oluşturmak ve teknik altyapıyı kurmaktır. İlaç uygulama algoritmasının geliştirilmesi ve teknik altyapının standardizasyonu sürecinde mekanotransdüksiyon hasarı oluştuğu öngörülen desma mutant kg155 (-/-) zebra balıklarına XMU-MP-1 uygulanmış ve bu molekülün mutant organizma üzerindeki iyileştirici etkisi ankrd1a ifadesi üzerinden değerlendirilmiştir. Tez çalışması sonucunda ilaç adayı moleküllerin embriyolara ve kas içi enjeksiyonu ile erişkin balıklara uygulanması için izlenmesi gereken algoritma ve ilişkili teknik altyapı başarı ile oluşturulmuştur. Ayrıca, desma kg155 (-/-) mutant embriyolara ve erişkinlere XMU-MP-1 ilaç adayı molekülün uygulanmasını takiben ilacın etkinliği için ankrd1a ifadesine bakılmış ve kontrol gruplarına kıyasla herhangi bir farklılık görülmemiştir. Bu tez çalışması, HÜ BAP Koordinasyon Birimi tarafından (Proje No: 17472) desteklenmiştir. desma mutant kg155 (-/-) zebra balıkları, TÜBİTAK 214S174 no'lu proje kapsamında oluşturulmuş ve bu tez çalışmasında toksisite ve ilaç uygulamaları için kullanılmıştır. Tez araştırmasının yapılabilmesi için gereken zebra balığı laboratuvar altyapısı 214S174 no'lu proje kapsamında kurulmuştur. Tez çalışması için, HÜ Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurul'undan 2018/33-10 karar numaralı etik izni alınmıştır.
Spinal müsküler atrofi'li drosophila melanogaster modelinde RDP3 proteini ve histon asetilasyon düzeylerinin araştırılması
DNA-histon ilişkisinin gevşemesine ve transkripsiyonun aktivasyonuna neden olabilen histon asetilasyonu, histon proteinlerinin amino ucu kuyruk bölgelerindeki lizin amino asitlerine asetil grubu ekleyen histon asetil transferaz (HAT) enzimleri ve bu enzime tersinir olarak çalışan histon deasetilaz enzimleri (HDAC) arasındaki denge sayesinde kontrol edilmektedir. Bu dengenin bozulması nörodejeneratif hastalıkların patofizyolojisi ile ilişkilendirilmiş ve HDAC enzimlerini inhibe edebilen bileşikler geliştirilmiştir. Anabilim Dalı'mızda yürütülen bazı çalışmalarda da HDAC inhibitörleri sentezlenmiş, in vitro ortamda HDAC1 spesifik inhibisyon aktivitelerinin olduğu saptanmış ve bu etkinin in vivo ortamda araştırılmasına ihtiyaç duyulmuştur. Bu tez çalışması kapsamında, HDAC inhibitör aktivitesi olduğu bilinen fenilbütirik asit kullanılarak SMA'lı Drosophila melanogaster modelinde HDAC inhibitör araştırmalarında kullanılabilecek uygun evre ve koşulların belirlenmesi ve daha önce sentezlenmiş olan HDAC inhibitörlerinin etkilerinin in vivo ortamda araştırılabilmesine uygun altyapının oluşturulması amaçlanmıştır. HDAC1 enziminin Drosophila ortoloğu olan Rpd3 proteinin ifade düzeyi yabanıl tip ve SMA'lı sineklerin larva ve ergin dönemlerinde araştırılmış, ergin dönemde daha yüksek ifade edildiği görülmesine rağmen istatistiksel olarak anlamlı bir fark olmadığı gösterilmiştir. Bundan sonraki çalışmalara Rpd3 proteinin daha fazla ifade edildiği ergin dönem ile devam edilmiştir. Pupadan çıktıkları gün toplanan ergin sineklere 5 gün süreyle 5 mM ve 10 mM fenilbütirik asit uygulanmış, yapılan Western blot analizlerinde H3K18 asetilasyon düzeyinde değişiklik gözlenmezken H3K27 asetilasyon düzeyinde istatistiksel olarak anlamlı artış saptanmıştır. 5 mM ve 10 mM fenilbütirik asit 10 gün süreyle uygulandığında ise H3K27 ve H3K18 asetilasyon düzeyleri değişmemiştir. Bu tez çalışması ile fenilbütirik asit'in SMA'lı Drosophila melanogaster'deki H3K27 asetilasyonunu anlamlı olarak artırdığı ilk kez gösterilmiş ve bundan sonra yapılacak olan HDAC inhibitör aktivitesi tarama çalışmalarında takip edilebilecek kriterler belirlenmiştir.
TGFBI geninde genom düzenleme tekniği ile oluşturulan varyasyonların zebra balığı korneasındaki fenotipik etkilerinin incelenmesi
TGFBI-ilişkili kornea distrofileri, bu gende meydana gelen yanlış anlamlı mutasyonlar sonucu oluşan protein ürününün amiloid ya da hiyalin yapıda korneada birikmesiyle ortaya çıkan kalıtsal bir hastalık grubudur. TGFBI geni zebra balığında tek kopya olarak bulunmakta olup protein dizisi insandaki ortoloğu ile %65 homolojiye sahiptir. Bu genin protein ürünü (TGFBIp) zebra balığı korneasında gösterilmiştir. TGFBI'da 124. amino asit olan arjinini kodlayan kodon bu hastalık grubunda en sık bildirilen mutasyon bölgelerinden biridir. 124. arjinin amino asidi zebra balığında da korunmuştur. Bu verilerden yola çıkarak tez kapsamında zebra balığında tgfbi'de hedefteki arjinin rezidüsünü kodlayan bölgede TALEN ya da CRISPR/Cas9 genom düzenleme araçlarını kullanarak in frame değişiklik yapmayı amaçladık. Tgfbi'de hedef bölgedeki değişiklik homolog olmayan uç birleştirme tamir mekanizması ile oluşturulmuş olup hedef arjinin amino asidini ortadan kaldıracak şekilde p. Ser115_Arg117delinsLeu (c. 347_353delinsT) varyasyonu elde edilmiştir. Bu varyasyon hastalığı zebra balığında taklit etme potansiyeline sahiptir. Varyasyonu heterozigot olarak taşıyan 3 aylık zebra balıklarının gözlerinde ışık mikroskobu ile yapılan histolojik incelemelerde hematoksilen eosin, masson trikrom ve kongo kırmızısı ile boyamada hiyalin veya amiloid birikim saptanmamıştır. Bu tez çalışması, tgfbi geninde kornea distrofilerine neden olan 124. arjinin amino asidini zebra balığı genomunda ortadan kaldırarak in frame indel oluşturan ilk çalışmadır. Bu varyasyonu taşıyan zebra balıklarının daha ileri yaşlarda incelenmesi sonucu fenotipik değişiklikler tespit edilerek TGFBI-ilişkili kornea distrofilerinin modellenmesi ve hastalığın patogenezinin ortaya konulması mümkün olabilecektir.
IRE1-JNK yolağı protein-protein ve protein-ligand etkileşimlerinin moleküler dinamik simülasyon yöntemiyle araştırılması
IRE1-JNK yolağı Endoplazmik Retikulum (ER) stresine karşı hücrenin yanıt verdiği en güçlü sinyal yolağıdır. Hipoksi gibi koşullarda aşırı ER stresine bağlı olarak bu yolak üzerinden apoptotik mekanizma tetiklenerek hücre ölümü meydana gelmektedir. Kardiyovasküler hastalıklarda hücreler aşırı ER stresine maruz kalabilmekte ve apoptoza bağlı hücre ve doku kaybı meydana gelebilmektedir. Kardiyovasküler hastalıklarda etkili Statin, ACE İnhibitörleri, Anti-Aritmik İlaçlar ve Flavonoid'lerin IRE1-JNK yolağı üzerindeki IRE1, ASK1 ve JNK1 ile etkileşimi tam olarak bilinmemektedir. Ayrıca IRE1-JNK yolağının en önemli başlatıcı ya da durdurucu faktörü olan BİP-IRE1LD bağlanması bilinmesine karşın bağlanmanın moleküler mekanizması tam olarak aydınlatılamamıştır. Çalışmamızda kardiyovasküler hastalıklarda etkili etken maddeler ve Flavonoid'lerin kendi etkileri dışında IRE1-JNK yolağının inhibisyonunda rol oynayıp oynamadıklarını belirlemek amacıyla IRE1, ASK1 ve JNK1 ile etkileşimleri moleküler kenetleme, moleküler dinamik simülasyon ve serbest enerji hesaplamalarıyla araştırıldı. Ayrıca BİP'in konformasyonel dinamiği ve BİP-IRE1LD etkileşiminin moleküler mekanizmasını aydınlatmak hedefiyle moleküler dinamik simülasyon ve serbest enerji hesaplamaları yapıldı. Olası BİP-IRE1LD bağlanma paternlerini belirlemek amacıyla iri taneli model ve kübik oryantasyonda moleküler dinamik simülasyonlar gerçekleştirildi. Yaptığımız çalışmada BİP'in yüksek esneklikteki SBDα alt domaininin kısa süreli burkulması ve tekrar eski durumuna dönmesi sonucu serbest enerji yüzeyinde minima meydana geldiği gözlendi. Bağlanma konformasyonu bilinen farklı büyüklük ve esneklikte olan Ddi1 ubikuitin benzeri (UBL) domaini-ubikuitin kompleksi (2MWS), ubikuitin-USP2 kompleksi (2HD5), kimerik SDZ CHI621'in fab fragmenti (1MIM) ve Sil1-BİP komplekslerinin (3QML) bağlanma paternini iri taneli kübik oryantasyon yaklaşımı ile doğru tahmin etmek için istatistiksel olarak ROC eğrisi ile hesaplandığında F-değeri ve doğruluğu (ACC) 0,88 olarak ölçüldü. AUROC değeri ise 0,94 olarak belirlendi. BİP-IRELD etkileşiminin olası bağlanma paternleri taneli kübik oryantasyon yaklaşımı ile araştırıldığında, IRE1LD'in 4. bölgesi içinde yer alan düzensiz domainin BİP-NBDIIβ açık formunun kapalı forma göre daha yüksek afinite ile bağlandığı ayrıca BİP-SBDα alt domainin bağlanmada direkt rol oynadığı gözlendi. IRE1, ASK1 ve JNK1 ile kardiyovasküler hastalıklarda kullanılan etken maddeler ile Flavonoid'lerin etkileşimlerinin araştırıldığı bu çalışamada proteinlerin fosforilasyonunun inhibisyonunda Statinler'in en etkili moleküller olabileceği gözlendi. Ayrıca yaptığımız Umbrella Örnekleme Serbest Enerji Hesaplamlarında Statin'lerden Atorvastatin ve Pitavastatin ile Flavonoid'lerden Norizalpin, Chrysin ve Luteolin'in yüksek ortalama kuvvet potansiyelleri ile IRE1-JNK yolağının inhibisyonunda güçlü aday moleküller olabileceği gösterildi. Yaptığımız bu çalışmalar ile belirlenen BİP-IRE1LD bağlanma paterninin BİP ve IRE1LD hedefli ileri teröpatik çalışmalara ışık tutacağı, İri taneli kübik oryantasyon yaklaşımının hızlı ve kolay kullanımı için algoritmalar yazılarak yüksek esneklikteki protein-protein etkileşimlerinin belirlenmesinde kullanımının faydalı olabileceği ve IRE1-JNK yolağı etken madde etkileşimleri sonucu elde edilen veriler ışığında Statinler üzerinden geliştirilerek etken türev maddelerin ER stresi kaynaklı apoptozun önlenmesinde etkili olabileceğine inanmaktayız. Bu araştırmada yer alan kısmi nümerik hesaplamalar TÜBİTAK ULAKBİM, Yüksek Başarım ve Grid Hesaplama Merkezi'nde (TRUBA kaynaklarında) gerçekleştirilmiştir.
LNCRNA'ların pankreas kanserinin tanı ve prognozundaki önemi
Pankreas kanseri malignitelere bağlı ölümler arasında dördüncü sırada yer alan bir kanser türüdür. Pankreas kanserli hastaların serumlarında belirli antijenler tanımlanmıştır. Bu antijenlerden en önemlisi müsinle ilişkili karbonhidrat antijeni CA 19-9'dur. Son yıllarda yeni belirteçlerin saptanması amacıyla moleküler çalışmalarda siRNA, miRNA ve lncRNA (uzun kodlanmayan RNA) gibi küçük kodlanmayan RNA'lar kullanılmaya başlanmıştır. Bu kodlanmayan RNA'lardan lncRNA'lar, insan genomunun intergenik ve intronik bölgelerinden transkribe edilen ve karsinogenez sürecinde etkili oldukları bilinen grubu oluşturmaktadırlar. Bu çalışmanın birincil amacı pankreas kanserinde belirli lncRNA'ların rollerinin araştırılmasıdır. İkincil amacı pankreas kanserli hastaların demografik, laboratuar ve klinik özelliklerinin gözden geçirilerek lncRNA' larla olan ilişkilerinin belirlenmesi ve yeni bir dolaşım belirteci olarak kullanılıp kullanılamayacaklarının irdelenmesidir. Çalışmamızda kontrol grubu olarak normal pankreas (HPDE) hücre serisi ve hasta grubu olarak da pankreas duktal adeno kanser (PANC-1) hücre serisi kültür şartları ortamında çoğaltılarak WST-1 testi ile hücre proliferasyon ve sitotoksisite analizleri yapılmıştır. Bu hücre serilerine ilaveten pankreas kanseri tanısı konulan 18 yaş ve üzeri 40 olgudan alınan plazma örnekleri hasta grubu olarak, 10 sağlıklı bireyden alınan plazma örnekleri ise kontrol grubu olarak değerlendirilmiştir. Olgular çalışmaya dahil edilmeden önce çalışma hakkında bilgilendirilerek "Bilgilendirilmiş onam formu" imzalatılmıştır. Literatür incelemesi yapılarak onkogenezle ilişkili olabilecek lncRNA' lar belirlenmiştir. Kültür hücrelerinden ve hasta ve sağlıklı olgulardan toplanan plazma örneklerinden standart yöntem ve literatüre uygun kitlerle elde edilen kalıp cDNA'lar kullanılarak literatür bilgilerine dayanarak seçilen belirli lncRNA'ların ekspresyon seviyeleri "All-in-OneTM qPCR Mix" (Genecopoeia) ile qPCR Array analizleri ile belirlenmiştir. Çalışmada hedef lncRNA'lara (ANRIL, H19, HOTAIR, MALAT1, PCA3, PTCSC3) ve housekeeeping genlerine (ACTB, B2M, GAPDH) özgül olarak dizayn edilen primer / problar kullanılmıştır. Çalışmamızda öncelikle pankreas kanserli hasta kanlarından ayrıştırılan plazma örneklerinden qPCR yöntemi ile ölçülen lncRNA'ların ekspresyon değerleri, kültür ortamında çoğaltılan hücre serisi örneklerinin ekspresyon değerleri ile kıyaslanarak elde edilen bulgulara göre bunların bir tanı testi ve prognoz göstergesi olup olamayacağı irdelenmiştir. Pankreas kanser hücre hattında yapılan analizlerde sağlıklı hücre hattına göre kıyaslandığında ANRIL, H19, HOTAIR, MALAT1, PCA3 ve PTCSC3 ekspresyon seviyelerinin sırasıyla 0.58 kat, 4.60 kat, 4.19 kat, 0.66 kat, 1.25 kat ve 0.38 kat arttığı saptanmıştır. Aynı lncRNA ların hasta plazma örneklerinde sağlıklı kontrollere göre değişimi incelendiğinde sırasıyla 5.85 kat, 3.91 kat, 4.22 kat, 1.70 kat, 1.81 kat ve 3,93 kat azaldığı görülmüştür. Pankreas kanser tanılı hastaların plazma lncRNA değişimlerinin alkol ve sigara kullanımı, diyabet varlığı gibi faktörlerden etkilendiği bulunmuştur. Ayrıca hastalık evresi arttıkça plazma lncRNA değişimleri artmaktadır. Sonuç olarak in vitro analizlerde PANC1 hücre hattında H19 ve HOTAIR lncRNA ekspresyonu artmaktadır. Ancak pankreas kanseri tanısı alan hastaların plazma örneklerinde ANRIL, H19, HOTAIR ve PTCSC3 lncRNA seviyeleri azalmaktadır. Bu değişim ileri evre hastalıkta, sigara, alkol kullanımında ve diyabet varlığında daha belirgin olduğu için pankreas kanserinin erken tanısında şu an için birer tanı yöntemi olarak kullanılması mümkün gözükmemektedir.
Hipertansiyonlu olgularda ARHGAP42 rs633185 gen polimorfizminin kan basıncı ve arteriyel sertlik üzerine etkilerinin araştırılması
Amaç: Hipertansiyon (yüksek kan basıncı), kalp krizi, felç, kalp yetersizliği, böbrek yetersizliği gibi komplikasyonların gelişimine katkıda bulunan hem erkeklerde hem de kadınlarda yaşam süresini kısaltan bir hastalık olarak tanımlanmaktadır. Yapılan çalışmalar ile tansiyon değişikliklerine katkıda bulunan yaygın genetik varyantlar tanımlanmaya başlanmıştır. Bu varyantlardan bazıları da ARHGAP42 geninin ilk intronunda yer alan tek nükleotid değişimleridir (rs604723, rs633185, rs607562 ve rs667575). Bu çalışmadaki amacımız, ARHGAP42 rs:633185 gen polimorfizminin kan bansıncı, ambulatuvar kan basıncı ve arteriyel sertlik ile ilişkili olup olmadığını anlayıp, erken teşhis ve hipertansiyon için kişiselleştirilmiş tedavi seçeneklerinin aranmasının yanında, elde edilecek sonuçlarla daha geniş çaplı bir araştırmaya öncülük edecek olan öncü bir Türk toplumu genetik profilinin çıkarılmasına katkı sağlamaktır. Gereç ve Yöntem: Çalışmamız, 79 hipertansiyon tanısı konulmuş olgu ve 76 sağlıklı kontrol grubu verileri kullanılarak gerçekleştirildi. Olguların arteriyer sertlik ölçümleri ve 24 saatlik ambulatuvar kan basıncı ölçümleri kaydedildi. Olgulardan kan örnekleri alındı ve DNA izolasyon işlemleri tamamlandı. ARHGAP42 rs633185 polimorfizmine ait genotipleme, real time PCR ile gerçekleştirilerek istatistiksel analiz yapıldı. Bulgular: Hipertansiyonlu olgu ve kontrol grubunun genotip dağılımlarını inceledik. CG genotipi hipertansiyonlu olgularda, kontrol grubuna kıyasla 1,89 kat, GG genotipi ise 4,55 kat anlamlı artış gösterdi. Aynı zamanda allel dağılımlarını incelediğimizde, G allelinin hipertansiyonlu olgu grubunda kontrol grubuna kıyasla 1,466 kat artış gösterdiğini saptadık.
Kolorektal kanser hücrelerinde BIBR1532 ve resveratrol kombinasyonunun LncRNA ekspresyon değişimi üzerindeki etkisi
Kolorektal kanser en sık rastlanan üçüncü kanser tipi ve dördüncü ölüm nedeni olarak bilinmektedir ve hedefe yönelik yeni tedavi yöntemleri araştırılmaya devam etmektedir. Kanser hücrelerinde; belirli uzun kodlanmayan RNA'lar olarak bilinen lncRNA'ların ekspresyonunun yüksek olduğu; karsinomların gelişmesi ve progresyonundan sorumlu olduğu bilinmektedir. Dolayısıyla, lncRNA'ların kanser tedavisinde hedef olarak ele alınabileceği düşünülmektedir. BIBR1532 bir telomeraz inhibitörüdür ve tümörlerdeki aktif telomerazı inhibe etme amaçlı kanser araştırmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Resveratrol ise doğal bir fitoaleksindir, proliferasyon ve apoptozda rol oynayan molekülleri hedeflediği bilinmektedir. Ayrıca spesifik olarak KRAS-aracılı sinyalleşmeyi inhibe ederek apoptozu indüklediği tespit edilmiştir. Çalışmamızda, HT-29 kolorektal kanser hücrelerine BIBR1532 ve resveratol maddeleri uygulanmasının ardından; maddelerin sitotoksisitesi,olası apoptotik etkileri ve lncRNA ekspresyonlarındaki değişimi incelemek hedeflenmektedir. Proliferasyon deneyi ile her kuyucuk için uygun HT-29 hücre miktarı belirlenmiştir. WST-1 analizi ile BIBR1532 ve resveratrol maddelerinin sitotoksik etkisi doza ve zamana bağlı olarak değerlendirilmiştir. Ardından, belirlenen IC50 dozlarında tekli ve kombine olarak ilaç uygulanmış ve ilaç uygulanmayan hücreler kontrol olarak ele alınarak apoptoz analizi Annexin V ile gerçekleştirilmiştir. LncRNA analizi için, apoptoz deneyinde uygulandığı şekilde dozlar hücrelere uygulanmış, ilaç eklenmeyen hücreler kontrol olarak ele alınmıştır. Tüm hücre gruplarından RNA izolasyonu gerçekleştirilerek cDNA sentezlenmiş ve lncRNA ekspresyonundaki değişiklikler RT-PCR ile değerlendirilmiştir. HT-29 hücreleri için uygun hücre konsantrasyonu 2 x 104 hücre / ml olarak belirlenmiş, ardından sitotoksisite testleri yapılmıştır. BIBR1532 ve resveratrol için IC50 dozları sırasıyla 50.81 μM (48. saat) ve 86.23 μM (72 saat) olarak belirlenmiştir. İki madde için CI 1.7 olarak belirlenmiştir. BIBR1532 ve resveratrol ajanlarının her ikisi de hücrelerin canlılık oranını düşürürken, apoptozu indükleyici bir etkileri tespit edilmemiştir. BIBR1532 ve resveratrol kombinasyonunun kolorektal kanser hücrelerinde uygulanmasına dair literatürde herhangi bir çalışma bulunmamaktadır. Çalışmamızda bu maddelerin uygulamasının kanser ilişkili lncRNA ekspresyonlarında yarattığı değişiklikler ekpsresyon analizleri ile araştırılmasının, daha önce incelenmemiş olan lncRNA'ların CRC ile ilişkilendirilerek tedavi stratejilerinin oluşturulmasında yeni bir bakış açısı kazandıracağını düşünmekteyiz.
Meme kanseri ve meme kanseri kök hücrelerinde bIbR1532'nin epitelyal mezenkimal transizyon üzerine moleküler etkilerinin incelenmesi
Kanser kök hücreleri (KKH) tümör dokusunda bir alt popülasyon olarak yer alan ve tümör oluşturma kapasitesine sahip, aynı zamanda tedavi direncine neden olan hücre grubudur. Tümör heterojenitesine katkı sağlayan KKH'leri, günümüzde kanser tedavisinin tam olarak başarılı olamamasının sebepleri arasında gösterilmektedir. Bu hücrelerin kanser tedavisinde bir hedef haline gelmesi ilgi çekici bir konudur. Yüksek telomeraz aktivitesi ile yüksek migrasyon ve invazyon kabiliyetleri sonucunda metastaza neden olmaları KHH'lerinin ortak özellikleri olarak kabul edilmektedir. Kemoterapötik ajanların sağlıklı dokuya hasar vermesi ve KKH'lerinin tedaviye direnç oluşturması yeni terapötik hedef arayışı ihtiyacını doğurmaktadır. Seçici bir küçük molekül inhibitörü olan BIBR1532, telomerazı inhibe ederek kanser hücrelerinin etkili bir şekilde hedeflenmesine olanak sağlamaktadır. Bunun yanında, yapılan son çalışmalar telomerazın epitelyal mezenkimal transizyon (EMT) ile ilişkili olduğunu savunmaktadır. Epitel hücrelerin mezenkimal bir morfoloji kazanmasına sebep olan EMT programının, kanser metastazında etkili olduğu bilinmektedir. Meme kanseri hücrelerinde telomerazın baskılanarak EMT mekanizmasının sekteye uğratılması çalışmamızın hipotezini oluşturmaktadır. Çalışmamızda, meme kanseri hücreleri MDA-MB-231 ve MCF-7, meme kanseri kök hücreleri ve meme epitel kök hücrelerinde telomeraz inhibitörü BIBR1532'nin sitotoksisitesi bulunmuş ve maddenin apoptoz üzerine etkileri incelenmiştir. Yara iyileşme testiyle BIBR1532'nin hücrelerin migrasyon hızına etkisi incelenmiş, asılı damla deneyi ile sphere oluşturma kapasiteleri gözlenmiştir. Son olarak EMT ilişkili 84 genin ekspresyonları gerçek zamanlı qPCR ile analiz edilmiştir. BIBR1532 etken maddesinin MDA-MB-231 ve MEKH'leri için IC50 değerleri 72. saatte sırasıyla 18,04 ve 38,71 μl olarak analiz edilmiştir. Etken maddenin MDA-MB-231 ve MCF-7 hücreleri üzerinde apoptotik bir etkisi gözlenmezken, MKKH ve MEKH'leri üzerinde kontrole göre sırasıyla %26.5 ve %32.2 oranında apoptoz görülmüştür. Etken maddenin MEKH'leri üzerindeki etkisi ilk kez araştırılmıştır ve ilacın kök hücreler üzerinde apoptotik bir etkisi olduğu gözlenmiştir. Asılı damla deneyi ile incelenen sphere yapıları ise, BIBR1532 uygulanan kök hücrelerde kontrol grubuna göre küçülmüştür. Yara iyileşme deneyinde etken maddenin kök hücreler üzerindeki migrasyon hızını azaltıcı etkisinin kanser hücrelerine göre daha yüksek olduğu gözlenmiştir. BIBR1532 uygulanan hücre hatlarında EMT ilişkili genlerin regüle olması ise telomeraz inhibisyonunun EMT mekanizmasını etkilediğini göstermektedir. Kanser tedavisinde KKH'lerinin telomeraz inhibisyonuyla hedefli eliminasyonu, kanser hücrelerinin EMT mekanizmasına bağlı olarak hareket yeteneğini ve köklülüğünü sınırlandırabilmektedir. Yüksek telomeraz aktivitesiyle korele meme kanserinde, metastazın önlenmesi ve kanser nüksünün önüne geçilebilmesi açısından umut verici bir adım olabilir.
Ponatinib ve VS-5584 terapötik ajanlarının kronik miyeloid lösemi lökomogenezine etkileri
Kronik miyeloid lösemi (KML), sürekli tirozin kinaz aktivitesi sergileyen BCR-ABL1 füzyon proteinine sahip hücrelerle karakterize miyeloproliferatif bir hastalıktır. Bu nedenle hastalığın tedavisinde tirozin kinaz inhibitörleri kullanılmaktadır. Ponatinib, T315I dahil olmak üzere birçok BCR-ABL1 otofosforilasyonunu inhibe edebilen ATP-yarışmalı tirozin kinaz inhibitörüdür. Lösemi kök hücreleri, normal hematopoietik kök hücrelerle benzer özelliklere sahip malignant hücrelerdir. Tirozin kinaz inhibitörleri, primitif lösemi kök hücreleri üzerinde etkili olmadıkları için tedavinin etkinliği düşük olabilmektedir. Ayrıca, ciddi yan etkilerin önlenmesi için kullanılan düşük tirozin kinaz inhibitörü dozları, KML hücrelerinde aktif halde bulunan alternatif sağkalım yolaklarının baskılanmasını sağlayamamaktadır. Tirozin kinaz inhibitörü tedavisinin başarısının düşük olduğu KML olgularında ponatinibin tek ilaç olarak kullanımından ziyade çoklu hedefli tedavi yaklaşımlarının geliştirilmesine ihtiyaç olduğu açıktır. KML'de aktif olduğu bilinen PI3K/Akt/mTOR yolağının inhibitörlerinden VS-5584, tercihen kanser kök hücrelerini öldüren, potent, seçici bir dual inhibitördür. Bu tez çalışmasında KML tedavisindeki eksikliklerin üstesinden gelebilecek in vitro kombinasyon terapisinin belirlenebilmesi hedeflenmiştir. Bu amaçla VS-5584 ile ponatinibin kombinasyonlarıyla BCR-ABL1 ve PI3K/Akt/mTOR yolaklarının eş zamanlı inhibe edilmesinin KML ve lösemi kök hücrelerinin eliminasyonundaki etkisi ve rolü moleküler düzeyde araştırılmıştır. KML hücre modeli K562, lösemi kök hücre modeli LSC ve normal hematopoietik kök hücre modeli HSC hücre hatlarında, VS-5584'ün, ponatinibin ve kombinasyonlarının sitotoksik etkileri WST-8 testi ile belirlendi. Kombinasyon indeksleri CalcuSyn izobologram analiziyle değerlendirildi. Belirlenen IC50, IC75, ED50 ve ED75 dozlarının apoptotik etkileri Anneksin V ve aktif kaspaz-3 analizleri ile hücre döngüsüne etkileri PI analizi ile akım sitometride ve siklin D1, p27 antikorlarıyla western blotma ile değerlendirildi. PI3K/Akt/mTOR yolağındaki proteinlerin aktivitelerindeki değişimler, antikor array ile fosforile protein seviyelerinin kantitasyonu yapılarak, ölçüldü. Transkripsiyon faktörlerinin aktivelerindeki değişimler uygun vektörlerin transfeksiyonu sonrasında dual lusiferaz aktivitesi ile kantite edildi. Aktivitesi değişen transkripsiyon faktörlerinin hedef genlerinin mRNA seviyelerindeki değişimleri saptamak için qRT-PCR gerçekleştirildi. Ponatinib ve VS-5584'ün K562 ve LSC hücrelerinde doza ve zamana bağlı artan sitotoksik etkiye sahip olduğu saptandı. Ponatinibden farklı olarak, VS-5584'ün sağlıklı HSC hücre hattında belirgin şekilde daha az sitotoksik olduğu gösterildi. Kombinasyon dozlarından ED50 additif, ED75 ve ED90 sinerjistik etkili olarak belirlendi. Ponatinibin indüklediği apoptoza ek olarak, VS-5584'ün hücre döngüsünde belirgin G0/G1 duraklamasına neden olduğu gösterildi. Özellikle LSC hücre hattında, ponatinib Akt yolağını baskılamada yetersiz kalırken, ponatinibin VS-5584 ile kombinasyonunun başta S6, S6K, BAD olmak üzere birçok proteinin fosforilasyonu inhibe ederek PI3K/Akt/mTOR yolağını baskıladığı belirlendi. Elk-1/SRF, AP-1 ve NFkB transkripsiyon faktörlerinin lösemi hücre ve lösemi kök hücre modellerinde belirgin şekilde yüksek aktivite sergiledikleri saptandı. Kombinasyon uygulaması sonrasında K562 ve LSC hücrelerinde, seçici bir müdahale noktası olabilecek bu transkripsiyon faktörlerine ek olarak Myc/Max, CREB, STAT3 ve E2F/DP1 transkripsiyon faktörlerinin aktivitelerinde de baskılanma gözlendi. K562 hücrelerinde C/EBP ve FOXO1 transkripsiyon faktörlerinin, LSC hücrelerinde ise C/EBP ve p53 transkripsiyon faktörlerinin aktivitelerinde kombinasyon uygulamasını takiben artış olduğu gösterildi. Ekspresyonları bu transkripsiyon faktörleri tarafından kontrol edilen birçok genin mRNA seviyelerinde değişiklik meydana geldiği belirlendi. Sonuçlar, ponatinib ve VS-5584 ile sağkalım yolaklarında görevli transkripsiyon faktörlerinin regülasyonlarının anti-proliferatif ve apoptotik süreçlere katkı sağladığını gösterdi. Ponatinib ile VS-5584'ün kombinasyonunun, KML blastlarının ve kök hücrelerinin kontrolsüz proliferasyonunu selektif olarak önleyebilecek ve ponatinibin bilinen ciddi yan etkilerini azaltabilecek umut verici bir tedavi stratejisi olabileceğini düşünmekteyiz. Anahtar Kelimeler: Kronik Miyeloid Lösemi; PI3K/Akt/mTOR yolağı; Ponatinib
Akciğer kanseri hücre serilerinde epidermal büyüme faktörü reseptörünün inhibisyonunun claudinler üzerine etkisinin araştırılması
Sıkı bağlantılar epitelial, endotel ve mezotel hücrelerinde bulunan membrana bağlı yapılardır. Hem epitel hem de endotel hücre tabakalarının bitişik hücreleri arasında bağlantı sağlayan çoklu protein kompleksleridir. PIKfyve inhibitörü YM201636'nın sıkı bağlantı proteinleri CLDN1 ve CLDN2'nin endositik geri dönüşümünü inhibe ederek sıkı bağlantı yapılarını bozduğu bildirilmiştir. Epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR), hücre zarında bulunan bir transmembran glikoproteindir ve hücre proliferasyonunun düzenlenmesinde kritik önemi bulunmaktadır. Kanser hücrelerinde EGFR işlevini inhibe etmek için hücre içi tirozin kinaz sinyalizasyonunu engelleyen moleküller veya EGFR'ye ve ligandlarına karşı nötrleştirici antikorlar kullanılmaktadır. Canertinib (CI-1033), in vitro koşullarda EGFR, HER2 ve HER4'ü inhibe eden bir tirozin kinaz inhibitörüdür. Bu tez çalışmasında sıkı bağlantıların yapısal bir bileşeni olan claudinler ve EGFR arasındaki ilişkinin aydınlatılması amaçlanmıştır. Bunun için EGFR mutant ve wild type akciğer kanseri hücre serileri HCC827 ve H1299 kullanılmış, CI-1033 ve YM201636 etken maddelerinin sitotoksik ve apoptotik etkileri ile birlikte EGFR ve claudin mRNA ve protein düzeylerine etkileri araştırılmıştır. Sitotoksisite analizlerinde XTT, apoptoz analizlerinde Annexin/PI boyaması, mRNA ve protein düzeylerinin belirlenmesinde kantitatif RT-PCR ve western blot yöntemleri kullanılmıştır. CI-1033'ün HCC827 ve H1299 hücre serilerinde IC50 dozu sırasıyla 2.17 ve 16.42 µM bulunmuştur. YM201636, EGFR mutant HCC827 hücre serisinde 11.07 µM'da sitotoksik etki gösterirken, EGFR wild type H1299 hücrelerinde 75 µM konsantrasyonda hücre canlılığını etkilememiştir. YM201636 etken maddesi HCC827 hücrelerinde EGFR, CLDN1 ve CLDN3 mRNA ekspresyon düzeylerinde anlamlı artışa neden olmuştur, H1299 hücrelerinde ise YM201636 uygulandıktan sonra CLDN1 mRNA düzeyi anlamlı olarak azalmıştır. CI-1033 ve YM201636 inhibitörleri EGFR mutant ve wild type hücre serilerinde CLDN ekspresyonlarına farklı yönde etki etmiştir. Anahtar kelimeler: akciğer kanseri; sıkı bağlantılar; claudin; EGFR
Prostat kanseri hücrelerinde resveratrol analoğunun anti-kanser etkinliğinin in vitro değerlendirilmesi
Prostat kanseri (PCa), gelişmiş ülkelerde erkeklerde en sık görülen ikinci kanser türüdür. PCa klinik olarak, yavaş başlayarak hızla ilerleyebilen ve ölümcül olabilen heterojen bir seyir izlemektedir. Karsinom ilerlemesi, epitelyal-mezenkimal geçiş (EMT) olarak bilinen, mezenkimal fenotip kazanımı ve epitelyal özelliklerin kaybıyla ilişkilidir. Böylece, kanser hücrelerinin metastatik özellikleri, EMT ile hücre migrasyonu ve invazyonu için gelişmiş bir yetenek kazanarak artmaktadır. Resveratrol, kırmızı üzümde bulunan, potansiyel bir kemopreventif ve kemoterapötik ajandır. Resveratrol çeşitli kanserlerde anti-tümörijenik etkiye sahiptir ve EMT inhibisyonuna neden olabileceği öne sürülmektedir. Sentezlenen resveratrol analogları arasında yer alan DMU-212, çeşitli kanser türlerine karşı yüksek seçicilik ve aktivite göstermektedir ve resveratrole göre daha güçlü bir antitümör aktiviteye sahiptir. Prostat kanserindeki ölüm oranlarının erken tanı ve tedavideki gelişmelere rağmen, hala yüksek olmasından dolayı, kansere karşı terapötik stratejiler geliştirilebilmek adına, bitkilerden elde edilen moleküler inhibitörler ile ilgili çalışmalara olan ilgi son yıllarda oldukça artmıştır. Bu tez çalışmasında, EMT terapötik bir hedef olarak alınarak, yeni bir stilben türevi olan DMU-212'nin PCa hücrelerinde daha önce çalışılmamış olan EMT üzerine olan etkileri araştırılmış, PCa hücrelerinde invazyon ve metastazı engelleyebilecek mekanizmaların belirlenebilmesi hedeflenmiştir. LNCaP, PC-3 ve DU-145 hücrelerinde, DMU-212 etken maddesinin sitotoksik etkileri WST-8 testi ve koloni oluşumu deneyleriyle belirlendi. DMU-212'nin belirlenen IC50 değerlerinin apoptotik etkileri Anneksin V yöntemiyle, hücre döngüsüne etkileri propidyum iyodür (PI) analizi ile değerlendirildi. Etken maddenin belirlenen IC50 dozlarının hücre migrasyonu üzerine etkileri yara iyileşmesi deneyiyle, tümör invazyonu üzerine etkileri hücre invazyon analizleriyle, EMT-ilişkili genlerin ekspresyon seviyelerindeki değişimler ise qRT-PCR ile değerlendirildi. EMT belirteçlerinden E-kaderin ve vimentin değişimleri immunofloresan işaretleme yöntemiyle belirlendi. Siklin B1, siklin D1, E-kaderin ve β-katenin proteinlerinin ekspresyon değişimleri western blot ile değerlendirildi. NFkB transkripsiyon faktörünün aktivitesindeki değişimler, dual lusiferaz aktivitesi ile incelendi. DMU-212'nin LNCaP, PC-3 ve DU-145 hücre hatlarında düşük dozlarda yüksek sitotoksik etkiye sahip olduğu ve bu hücre hatlarında apoptozu indükleyerek, belirgin bir şekilde G2/M arrestine neden olduğu belirlendi. DMU-212'nin, prostat kanseri hücrelerinde, migrasyonu ve invazyonu inhibe ettiği, bu mekanizmanın TFPI-2 geninin artan ekspresyonu üzerinden olabileceği, PC-3 hücrelerinde ise aynı zamanda, β-kateninin transkripsiyonel aktivitesini azaltarak, Wnt-β katenin sinyal yolağının baskılanması ile gerçekleşebileceği saptandı. DU-145 hücrelerinde ise, EMT ile ilişkili olan TGF-β sinyalizasyonunun, DMU-212 tarafından baskılandığı gen ekspresyon sonuçlarıyla belirlendi. DMU-212'nin prostat kanseri hücrelerinde E-kaderin artışı ve vimentin azalışını sağladığı gösterildi. NFkB transkripsiyon faktörünün, LNCaP ve PC-3 hücrelerinde yüksek aktivite gösterdiği gözlendi. DMU-212'nin güçlü antikanser aktivitesi ile metastatik prostat kanserini önlemeye yönelik yeni fırsatlar sağlayabilmek adına umut verici bir ajan olabileceğini düşünmekteyiz.
Tirozin kinaz ınhibitörlerine duyarlı ve dirençli kronik myeloid lösemi hastalarında, uzun kodlamayan RNA ekspresyonlarının moleküler düzeyde araştırılması
Uzun kodlamayan RNA' lar (lncRNA), ortalama 200-100 kbp uzunluğunda, hücrelerde gen ifadesinin epigenetik düzeyde kontrolünden sorumlu olan RNA molekülleridir. LncRNA' ların ekspresyon düzensizliği çeşitli insan kanser tipleri ile ilişkilidir. Ancak, Kronik myeloid lösemi' de (KML) ve özellikle tirozin kinaz inhibitörlerine karşı oluşan dirençte lncRNA' ların fonksiyonları tam olarak bilinmemektedir. Uzun kodlamayan RNA NEAT1 çeşitli kanser türlerinde önemli role sahip olup, iki kısa izoforma sahiptir: kısa form NEAT1_1 ve uzun form NEAT1_2. NEAT1 aynı zamanda nukleusta sub bodies olan 'paraspeckles' ve microspeckles oluşumundan da sorumludur. Bu çalışmanın amacı KML'de ve tirozin kinaz inhibitörlerine karşı gelişen direnç mekanizmasında etki gösteren lncRNA ekspresyon profillerinin belirlenmesi ve belirlenen lncRNA'ların TKİ direnç mekanizmasında ve KML progresyonundaki rollerinin saptanmasıdır. Dolayısıyla KML'de gen ifadesini direkt veya dolaylı şekilde etkileyen lncRNA' ların profillenmesi, sağlıklı olgulardan ve tirozin kinaz inhibitörlerine duyarlı/dirençli kronik myeloid lösemi hastalarından elde edilen kan örneklerinden RNAeasy Mini kit (Qiagen) ile total RNA izolasyonu, 'Thermocycler' cihazında qRT-PCR (kantitatif revers transkriptaz-gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu) yöntemi ile cDNA (komplemanter DNA) sentezi ve 'ABI 7500 Fast' cihazında qRT-PCR (gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu) array ile yapılmıştır. Farklı ekspresyon seviyeleri gösteren lncRNA'lar potansiyel terapötik hedefler olabileceğinden, lncRNA' ları hedefleyen tedavi stratejisinin tirozin kinaz inhibitörlerine karşı direnç gösteren KML hastalarının tedavisi için de, umut verici nitelikte olacağını düşünmekteyiz. Anahtar Kelimeler: KML, LncRNA , Tirozin kinaz inhibitörlerine direnç
Yüksek dozda glikoza maruz bırakılan H9C2 hücre serisinde sırt1 gen ekspresyonu ve sırt1'i hedef alan miRNA'lar arasındaki ilişkinin araştırılması
Bu çalışmanın amacı hiperglisemi ile karakterize olan diyabette SIRT1'i hedef alan miRNA'lar arasındaki ilişkiyi ve SIRT1 gen ekspresyonunun rolünü belirlemektir. H9c2 rat kardiyomiyositleri yüksek dozda glukoza maruz bırakıldıktan sonra SIRT1 ekspresyon düzeyleri RT-PCR ve Western Blot yöntemleriyle analiz edilmiştir. miRNA hedef tahmin algoritmaları kullanılarak, SIRT1'i hedefleyen muhtemel miRNA'lar belirlenmiştir. Detaylı bir şekilde in silico analizler kullanıldıktan sonra SIRT1 genini hedefleyen 86 miRNA belirlenmiştir. miR-181d, miR-135a, miR-135b, miR-181b-1-3p, miR-369-3p, miR-487b, miR-361, miR-204, miR-30d, miR-23a, miR-9 ve miR-323'in ekspresyon düzeyleri anlamlı bir şekilde artmıştır. Çalışmamızda SIRT1 protein düzeylerinin normal doz glukoza göre 1,9 kat arttığı belirlenmiştir. Diyabetik kardiyomiyopati gelişiminde ve önlenmesinde SIRT1'i hedefleyen miRNA'ların etkili olabileceğini ve çalışmamızın daha kapsamlı çalışmalara ışık tutacağını düşünmekteyiz.
Meme kanseri ve meme kanser kök hücrelerinde telomeraz inhibitörü bıbr1532 ajanının etkisinin moleküler biyolojik açıdan incelenmesi
Tümör hücrelerinin alt popülasyonunu oluşturan kanser kök hücrelerinin (KKH) tümör büyümesi, metastaz, kanser ilaç direncinden sorumlu olduğu vurgulanmaktadır ve telomeraz inhibitörü BIBR1532 etkeninin KKH tedavisinde etkili olması beklenmektedir. Meme kanserinde konvansiyonel tedaviden yeterli yanıt alamama durumu araştırmacıları yeni tedavi yöntemleri bulmaya yönlendirmektedir ve literatür araştırmaları KKH çalışmalarını desteklemektedir. BIBR1532, telomeraz enzimini inhibe eden seçici bir anti-kanser ajanıdır. Klinik çalışmalarda kullanılan genel kemoterapötik ilaçların birçoğu yan etki göstermektedir. Telomeraz inhibitörlerinin avantajı normal dokularda toksik etkisinin az olmasıdır. Bu inhibitör eşliğinde terapötik ilaçların yan etkilerinin en aza indirilmesi beklenmektedir. Meme kanserinde yaygın olan PI3K/Akt/mTOR yolağının KKH'nin yenilenebilmesinde ve anti-kanser ilaç direnç gelişiminde önemli olduğu bilinmektedir. Kanser hücrelerinin hayatta kalması için mTOR ve hTERT yolları arasında etkileşimin gerekli olduğu vurgulanmaktadır. Çalışmamızda MCF-7, meme kanser kök hücresi (MKKH) ve kontrol olan normal meme epitel hücresi MCF10A hücrelerinde BIBR1532 etken maddesinin hücrelerdeki sitotoksisitesi belirlenmiş olup, apoptoz ve hücre döngüsü üzerine etkileri araştırılmıştır. Ayrıca mTOR yolağındaki ilişkili 84 genin ekspresyon değişimleri ve hTERT gen ekspresyon değişimleri gerçek zamanlı RT-qPCR ile analiz edilmiştir. HIF1α (hipoksi ile indüklenebilir faktör alfa) ve PKM2 (Pirüvat kinaz izoenzimleri M/M2) proteinlerindeki ifade değişimleri ELISA (Enzim Bağlantılı İmmünosorbent Assay) yöntemi kullanılarak değerlendirilmiştir. BIBR1532 etken maddesinin 48. saat için IC50 dozları MCF-7 hücre hattında 34,59 μM, MKKH hattında 29,91 μM ve MCF10A hücre hattında 29,07 μM bulunmuştur. Bu etken maddenin MKKH ve MCF-7 hücre hatlarında kayda değer bir şekilde apoptoz indüklerken, MCF10A kontrol hücresinde apoptozu çok az indüklediği gözlenmiştir. Hücre döngüsü analiz sonuçlarında, MKKH ve MCF-7 hücre hatlarının G2/M fazında hücre arresti görülmüştür. Ayrıca MKKH ve MCF-7 hücre hatlarında BIBR1532 etken maddesinin telomeraz aktivitesini baskıladığı gösterilmiştir. BIBR1532'nin sitotoksik aktivitesi MKKH ve MCF10A hücre hatlarında ilk kez araştırılmış ve etken maddenin sitotoksisite değerinin MKKH ve MCF-7 hücre hatları üzerinde etkin bir şekilde apoptozu indüklediği gözlenmiştir. Ayrıca kontrol hücre modeli olan MCF10A hücre hattı üzerinde ise kayda değer bir apoptotik etkiye neden olmadığı saptanmıştır. BIBR1532'nin mTOR sinyal yolağı üzerindeki etkisi ilk kez değerlendirilmiş ve telomeraz inhibitörünün bu sinyal yolağındaki olumlu etkileri göz önünde bulundurulduğunda, meme kanserinde tedaviye yeni bir yaklaşım getirebileceği düşünülmektedir. BIBR1532 uygulamasına bağlı olarak MKKH ve MCF-7 hücre hatlarında HIF-1α/PKM2 protein seviyelerindeki azalmanın, literatür verileri göz önünde bulundurulduğunda, hTERT bağlantılı olarak gerçekleştiğini düşünmekteyiz.
Sağ ve sol kolon tümörlerinde cmtm3 ve sstr2 genlerinin ifade düzeylerinin araştırılması
Dünya genelinde ve ülkemizde en yaygın görülen kanser türlerinden olan kolorektal kanser, gastrointestinal kanserler içinde en sık görülendir. Tümör dokusunun sağ kolon ve sol kolonda olmasına göre sıklığı, klinik özellikleri, seyri ve uygulanan tedavi yöntemi değişiklik gösterebilmektedir. Bu durum sağ kolon ve sol kolonun histoloji, anatomi, morfoloji ve genetik yapısındaki farklılıklardan kaynaklanmaktadır. Çalışmamızda sağ ve sol kolon yerleşimli tümöral dokularda tümör gelişimi ve ilerlemesi açısından önemli roller üstlenebileceği düşüncesiyle CMTM3 ve SSTR2 genlerinin ekspresyonlarını inceledik. Örneklemimiz; Mersin Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim dalında histopatolojik tanısı konulan 42'si sağ kolon, 47'si sol kolon olmak üzere 89 tümörlü doku örneği ve aynı bireylerin tümörlü dokuya komşu sağlıklı doku örneğinden oluşmuştur. Çalışmamız; kolorektal kanserin en yaygın türü olan adenokarsinomlu dokulardan hazırlanmış parafin bloğa gömülü arşiv materyallerinde gerçekleştirildi. Doku örneklerinden önce RNA izolasyonu arkasından cDNA sentezi gerçekleştirildi. CMTM3 ve SSTR2 genlerinin ekspresyonu Real Time PCR'de karşılaştırmalı CT (ΔΔCT) yöntemiyle analiz edildi. Bulguların istatistiksel değerlendirmesi Wilcoxon T-testi, Student T-testi ve Mann-Whitney U-testi ile yapıldı. Kolorektal kanser erkeklerde kadınlara göre daha sık görülmektedir (p<0,05). Sağ kolon tümörlü hastalarda CMTM3 ve SSTR2 genlerinin ekspresyonu daha yüksektir (p=0,047). Sol kolon tümörlü hastalarda da aynı şekilde CMTM3 ve SSTR2 genlerinin ekspresyonu daha yüksektir (p=0,026). Sağ ve sol kolon tümörlü hastalar için CMTM3 ve SSTR2 geni ekspresyonunu kıyasladığımızda; sadece sol kolon tümörlü hastalarda CMTM3 gen ekspresyonu daha yüksektir (p=0,027). Kolorektal kanserli hastalarda CMTM3 ve SSTR2 gen ekspresyonunun erkeklerde daha yüksek olması kolorektal kanserin erkeklerde daha sık görülmesini açıklamada bir belirteç olabilir. CMTM3 gen ekspresyonunun sol kolon tümörlü hastalarda daha yüksek olmasını ise kolorektal kanserin sol kolonda daha yüksek görülmesiyle ilişkilendirebiliriz. Mersin örneklemi temelinde gerçekleştirdiğimiz bu çalışma CMTM3 ve SSTR2 genlerinin kolorektal kanserli doku ve kontrol grubundaki ekspresyon değerlerine dair ülkemizdeki ilk çalışma olma özelliği taşımaktadır.
Kutanöz malign melanomda AMBRA1 ve mTOR genlerinin ekspresyon düzeylerinin incelenmesi
Melanom, melanosit adı verilen pigment üreten hücrelerin mutasyon sonucu kontrolsüz bir şekilde bölünmeye başlamasıyla ortaya çıkan invaziv cilt kanseri türüdür. Melanom teşhisi konan her on hastadan birinde hastalık öyküsü olan aile üyesi varlığının saptanması, hastalıkla genetik arasındaki ilişkiyi göstermektedir. Araştırmamızda kutanöz malign melanomun genetik özelliğine odaklanılmış olup, Activating Molecule in Beclin-1-Regulated Autophagy (AMBRA1) ve (mTOR) geni çalışılmıştır. Çalışmamızda kutanöz malign melanom tanısı almış hasta (n=50) ve kontrol grubunu oluşturan (n=50) bireylerde ilgili AMBRA1 ve mTOR genlerinin ekspresyon düzeyleri incelenmiştir. Doku örneklerinden cDNA örnekleri elde edildikten sonra Real Time PCR ile TaqMan prob kullanılarak AMBRA1 ve mTOR genlerinin karşılaştırmalı CT yöntemi (ΔΔCT) kullanılarak ekspresyon düzeyleri ölçülmüştür. KMM etiyolojisinde yer aldığı düşünülen AMBRA1 ve mTOR genlerinin ifade düzeylerinin kontrol ve hasta gruplarındaki dağılımları incelenerek bunlara ait p değerleri ve tanımlayıcı istatistikler hesaplanmıştır. Çalışmamız sonucunda, kontrollerle karşılaştırıldığında Kutanöz Malign Melanom tanısı almış hastalarda, AMBRA1 ve mTOR genlerinin ekspresyon düzeylerinde istatistiksel olarak anlamlı bir fark gözlenmemiştir (p>0,05). Gelecek çalışmalarda fazla örneklem sayısıyla ekspresyon analiz yapılmasının yanı sıra, kodlanmayan RNA'ların ve protein seviyelerinin de belirlenmesinin anlamlı sonuçlanacağı kanısındayız. Mersin örneklemi temelinde gerçekleştirdiğimiz bu çalışma AMBRA1 ve mTOR genlerinin KMM'li doku ve kontrol grubundaki ekspresyon değerlerine dair ülkemizdeki ilk çalışma olma özelliği taşımaktadır.
Sağ ve sol kolon tümörlerinde GALNT5 ve ZDHHC9 genlerinin ifade düzeylerinin araştırılması
Kolorektal kanserler her iki cinsiyette görülme sıklığı bakımından üçüncü sırada yer almaktadır. Kolon kanserinde ilkin tümörün sağ ya da sol kolonda bulunmasına göre klinik, patolojik ve genetik farklılıklar meydana gelmektedir. Bu durum hastalığın seyrini ve uygulanacak olan tedavi yöntemini değiştirebilmektedir. Yaptığımız çalışmada sağ ve sol kolon yerleşimli tümöral dokularda ZDHHC9 ve GALNT5 genlerinin ekspresyonlarını inceledik. Örneklemimiz; Mersin Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim dalında 42'si sağ kolon, 47'si sol kolon olmak üzere 89 tümörlü doku örneği ve aynı bireylerin tümörlü dokuya komşu sağlıklı doku örneğinden oluşmuştur. Çalışmamız; kolorektal kanserin en yaygın türü olan adenokarsinomlu dokulardan hazırlanmış parafin bloğa gömülü arşiv materyallerinde gerçekleştirildi. Doku örneklerinden önce RNA izolasyonu arkasından cDNA sentezi gerçekleştirildi. ZDHHC9 ve GALNT5 genlerinin ekspresyonu Real Time PCR'de karşılaştırmalı CT (ΔΔCT) yöntemiyle analiz edildi. Bulguların istatistiksel değerlendirmesi Wilcoxon T-testi, Student T-testi ve Mann-Whitney U-testi ile yapıldı. Kolorektal kanser erkeklerde kadınlara göre daha sık görülmektedir (p<0,05). Sağ ve sol kolon tümörleri genel olarak ve ayrı ayrı değerlendirildiğinde: ZDHHC9 ve GALNT5 genlerinin her ikisinin de ekspresyon seviyelerinde artış söz konusudur (p<0,001). Bu artış her iki cinsiyette de benzer oranlarda olup farklılık göstermemektedir. Her iki genin sağ ve sol kolon tümörlerindeki ekspresyonunu karşılaştırdığımızda ise sol kolon GALNT5 geni ekspresyonu sağ kolona göre daha yüksektir (p<0,048). ZDHHC9 ve GALNT5 genleri ekspresyonlarının hem sağ hem sol kolon tümörlerinde daha yüksek olması kolon kanserine yakalanmada biyobelirteç olabileceklerini göstermektedir. Sol kolon GALNT5 geni ekspresyonunun sağ kolona göre daha yüksek olması ise sol kolon kanserlerinin sağ kolon kanserlerinden daha sık rastlandığı gerçeğini açıklamada önemli bir belirteç olabilir. Mersin örneklemi temelinde gerçekleştirdiğimiz bu çalışma ZDHHC9 ve GALNT5 genlerinin kolorektal kanserli doku ve kontrol grubundaki ekspresyon değerlerine dair ülkemizdeki ilk çalışma olma özelliği taşımaktadır.
Maternal depresyonun sıçan yavrularında hipotalamik nöroinflamasyon gelişimine etkisi
Gebelik sırasında ve doğumdan sonra gelişen maternal depresyon önemli bir halk sağlığı problemi olarak tanımlanmaktadır. Maternal depresyon hem annenin hem de yavrunun sağlığı ve yaşam kalitesini olumsuz yönde etkilemektedir. Gebelik sürecinde gelişen depresyon ve tedavisinin epigenetik olarak yavruyu etkilediği bilinmektedir. Majör Depresif Bozukluğun etiyolojisi son derece karışıktır ve tam olarak aydınlatılamamıştır. Nöroinflamasyon, depresyon etiyolojisinde yaygın olarak kabul edilen bir hipotez olarak değerlendirilmektedir. Bu tez projesinde deneysel maternal depresyon modeli oluşturulan sıçanların birinci kuşak yavrularda nöroinflamasyonla ilişkili kinürenin yolağı metabolitlerinin hipotalamik gen ifadesi üzerine etkilerinin değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Gebe sıçanlara kronik hafif stres modeli (KHS) ve antidepresan tedavisi kapsamında kontrol (K), sertralin (S), depresyon (D) ve depresyon+sertralin (D+S) grupları oluşturularak postnatal 1., 30. ve 150. günlerde yavrularının hipotalamus dokuları alınmıştır. Hipotalamus dokularında total RNA izolasyosyon sonrası, cDNA sentezi gerçekleştirilmiştir. Kinürenin yolağı, pro- ve antiinflamatuar sitokin genlerinin (IDO1, HAAO, AADAT, KMO, IL1β, IL6, TNFα, TGFβ ve IL10) mRNA düzeyinde ifadeleri kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qPZR) analizi ile belirlenmiştir. Yenidoğan (1. gün) sıçanlarda depresyon grubunda artmış olan HAAO ifadesi D+S grubunda anlamlı oranda baskılanmıştır. Sertralin uygulamasının IL6 ifadesini K ve D+S gruplarına göre artırdığı gözlenmiştir. Diğer genlerde ekspresyon düzeyleri değişmemiştir. Ergen (30. gün) sıçanlarda KMO ve TNFα genlerinin depresyonda ifadeleri artmıştır. Antiinflamatuar TGFβ geninin ifadesi depresyonda azalmıştır. Sertralin uygulaması ile TGFβ ve IL10 ekspresyon seviyesinde artış gözlenmiştir. Erişkin (150. gün) sıçanlarda depresyon grubunda artmış olan KMO, HAO ve IL6 ifadesi sertralin uygulaması ile baskılanmıştır. Bulgular, maternal depresyonun kinürenin ve sitokin genlerinin ekspreyonunu değiştirdiğini göstermiştir. Sonuçlar gebelikte yaşanan depresyonun inflamatuar mekanizmalar ile yeni nesil yavruları etkilediğini göstermiştir. Bu sonuçlar yavruların ileride yaşayabileceği psikopatolojik durumla ilişkisini desteklemektedir.
COVID-19 testi pozitif çıkan ailevi akdeniz ateşi hastalarında mefv gen mutasyonlarının dağılımı
Ailevi Akdeniz Ateşi (AAA) otoimmün bir hastalıktır. Tam olarak etki mekanizması bilinmemekle birlikte yapılan çalışmalarda AAA tanısı konmuş MEFV mutasyonlarına sahip hastalarda bu mustayonların birçok hastalık ile ilişkisi araştırılmış ve anlamlı ilişkiler bulunmuştur. AAA ile ilişkilendirilen varyantlar arasında patojenitesi en belirgin olan 9 varyant (M694V, M694I, M680I, V726A, R761H, A744S, I692del, E167D ve T267I) vardır. Bu varyantlara ilave olarak anlamı henüz tam olarak bilinmeyen 5 varyant daha tanımlanmıştır (E148Q, K695R, P369S, F479L ve I591T).Günümüzün en büyük problemi olan bulaşıcılığı yüksek COVID-19 insan sağlığı üzerinde büyük bir tehdit oluşturmaktadır. COVID-19 (Koronavirüs - SARS-CoV-2) insanları ve aynı zamanda çok çeşitli hayvanları enfekte eden zarflı, pozitif tek sarmallı büyük RNA virüsleridir. COVID-19 'un ilk belirtisi başlarda pnömoniydi. Sonraki görülen vakalarda ayrıca özellikle küçük çocuklar arasında gastrointestinal semptomlar ve asemptomatik enfeksiyonlar tanımlanmıştır. Hastalığın şiddeti ve etkisi bireyler arasında çok farklılık göstermektedir. Hastalık kendini semptomatik ya da asemptomatik olarak gösterir. Semptomatik hastalarda ateş, öksürük, burun tıkanıklığı, yorgunluk ve üst solunum yolu enfeksiyonlarının diğer belirtilerinden oluşan hastalığın klinik belirtileri genellikle bir haftadan kısa bir süre sonra başlar. Enfeksiyon, başvuru sırasında bilgisayarlı tomografide görüldüğü gibi, hastaların yaklaşık %75'inde pnömoniye karşılık gelen nefes darlığı ve şiddetli göğüs semptomları ile ciddi hastalığa ilerleyebilir. Bağışıklık sistemi üzerinde ciddi ve kalıcı hasarlar bırakabileceği gibi ölümle de sonuçlanabilmektedir. Lenfopeni yaygın görülmektedir ve inflamatuar belirteçler (C-reaktif protein ve proinflamatuar sitokinler) yükselmektedir. AAA hastaları ile COVID-19 arasındaki ortak semptomların başında yüksek ateş gelir. AAA hastalarında atak sırasında ateş 38-40°C'ye kadar çıkabilir. Ateş bir saat ile 4 gün arasında yüksekliği değişkenlik gösterir. Kolşisin kullanan hastalarda kısa süreli ataklar sırasında ateş görülmeyebilir. AAA hastalarının kullandığı tek ilaç olan kolşisin atakların sıklığını ve şiddetini azaltmakla birlikte amiloidoz oluşumunu ve birikimini engellemede de büyük bir role sahiptir. AAA tanısı konmuş ve düzenli kolşisin kullanan hastaların COVID-19'a yakalandıklarında hastalığı çok daha hafif geçirdikleri gözlemlenmiştir. Bu çalışmada AAA - COVID-19 ilişkisinin ortaya konması, AAA hastalarında tanı ve kolşisin kullanımının COVID-19 için öneminin vurgulanması hedeflenmiştir. Öncelikle Konya Şehir Hastanesi'ne başvuran ve AAA tanısı konmuş hastalar ve MEFV varyantı bulunmayan kontrol hastaları belirlenmiştir. Belirlenen hastalardan 18 yaş üstü olanların COVID-19 testi sonuçları, kolşisin kullanma durumları ve demografik bilgileri listelenmiştir. Bu bilgilere HSYS (Halk Sağlığı Yönetim Sistemi) ve HBYS sistemleri üzerinden erişim sağlanmıştır. Toplanan veriler olarak SPSS programı üzerinden iki değişkenli ki-kare analizi ve ikili lojistik regresyon analizi yapılmıştır.MEFV varyantlarının dağılımı ve COVID-19 test sonucu arasında önemli veriler elde edilmiştir. Bu çalışma bize MEFV varyantlarındaki COVID-19 testi negatif çıkan hastaların pozitif çıkan hastalara göre daha fazla olduğunu açıkça göstermiştir ama yapılan analizler sonucunda, COVID-19 testi ile MEFV varyantları ve kolşisin kullanım durumu üzerinde anlamlı bir farklılık bulunamamıştır. Ayrıca kolşisin kullanan hastalarda da kullanmayanlara göre daha az COVID-19 testinin pozitif çıktığını gözlemlemiş olduk. Mutasyonsuz bireyler ile AAA hastası bireylerin COVID-19 test sonuçları karşılaştırıldığında ise MEFV varyantına sahip bireylerin pozitif çıkma oranının daha düşük olduğunu görmüş olduk. Hasta sayısının arttırılmasıyla ve hastalarla yapılacak anketlerle birlikte çalışmanın geliştirilebileceğini, litaratüre katkı sağlayacak veriler elde edileceğini düşünmekteyiz.
Kısa süreli opioit uygulamasının epigenetik mekanizmalar üzerine etkisi
Morfin, şiddetli ağrıların tedavisinde kullanılan güçlü analjezik etkiye sahip bir opioit alkaloiddir. Morfinin kötüye kullanımı; beyin nöronlarında meydana gelen adaptasyon ile nöron fonksiyonlarını değiştirmektedir. Morfin bağımlılığını açıklamaya yönelik bazı teoriler ileri sürülmüştür, ancak henüz kesin olarak ispatlanmamıştır. Morfin ve diğer opioitlerin epigenetik etkilerini ortaya koyan çalışmalar bulunmaktadır. Farklı transkripsiyon faktörlerini etkileyerek ve dolaylı epigenetik modifikasyonlar sonucunda bazı genlerin ifadesinde değişikliğe neden olabilmektedir. Bu tez çalışmasının amacı; kısa süreli opioit uygulamasının miRNA biyogenez yolagı ve metilasyon profili üzerine etkili DNMT (DNA metil transferaz) genlerinin ifadeleri üzerine etkisinin in vitro ve in vivo model kullanılarak araştırılmasıdır. İn vivo morfin bağımlılığı ve çekilmesi sıçan modelinde; kontrol (K), 7 gün 10 mg/kg morfin (M) ve 10 mg/kg morfin bağımlılığı + 1 mg/kg nalokson (M+N) grubu sıçanların hipotalamus dokuları kullanılmıştır. İn vitro modelde ise sinir bilim çalışmalarında altın standart olarak tercih edilen SH-SY5Y insan nöroblastom hücre hattı kullanılmıştır. Kontrol, en yüksek toksik olmayan morfin (10 µM), 10 µM nalokson ve 10 µM morfin +10 µM nalokson grubu oluşturulmuştur. Doku ve hücre örneklerinden total RNA izolasyonu ve cDNA sentezi gerçekleştirilmiştir. miRNA biyogenezi yolağı ve DNMT genlerin ifadesi qPZR ile tespit edilmiş ve gruplar arası farklar istatistiksel analizler ile karşılaştırılmıştır. XTT analizi sonucunda SH-SY5Y hücrelerinde en yüksek toksik olmayan morfin dozu 10 µM olarak tespit edilmiş ve in vitro bağımlılık modelinde kullanılmıştır. Morfin uygulamasının DNMT1 DNMT2 ve DNMT3B genlerinin ifadesini artırdığı, nalokson uygulamasının ise baskıladığı gözlenmiştir. TRBP2 hariç, miRNA biyogenez yolağında bulunan genlerin morfin grubunda artmış ifadesinin nalokson uygulaması ile baskılandığı gözlenmiştir. İn vitro ve in vivo bağımlılık modellerinde gen ifadesi düzeyleri genel olarak benzer bulunmuştur. DNMT genlerinin ifadesinin M grubuna ait hipotalamus dokusunda artmış, M+N grubunda ise baskılanmıştır, ancak yalnızca DNMT3A geninde anlamlı fark tespit edilmiştir. Morfin grubunda artmış DGRC8, XPO5 ve AGO1 ifadesinin nalokson uygulaması ile baskılandığı gözlenmiştir Morfin ve nalokson uygulamasının epigenetik düzeyde çalışmaya konu olan genlerin ifadesini genel olarak etkilediği tespit edilmiştir. Bu tez projesi kapsamında; in vivo ve in vitro subkronik opioit bağımlılık modellerinin etkinliğinin karşılaştırılması gerçekleştirilmiştir. İn vitro modelin etkin bulunması; farklı farmokojik uygulamalar ve opioit bağımlığın fizyopatolojisinin daha iyi anlaşılmasına katkı sağlaması beklenmektedir. Deney hayvan modellerine olan gereksinime alternatif olarak, sağlayacağı etik ve teknik kolaylıklar nedeniyle translasyonel düzeyde benzer çalışmaların gerçekleştirilmesine olumu yönde etkisi beklenmektedir.