Development of lysosomal acid lipase deficiency model in 3 dimensional hepatic organoids

Son zamanlarda, organoidler sağlık ve hastalıkta insan biyolojisini incelemek için oldukça güçlü bir hücre kültürü yöntemi haline gigureelmiştir. Organoidler, ekstraselülar matriste büyütülen, organın yapısını ve fonksiyonlarını gösteren üç boyutlu yapılardır. Son zamanlarda karaciğere özgü organoidler için yayınlanmış protokoller hastalık patolojisinin anlaşılmasını ve hastaya özgü tedavilerin geliştirilmesini sağlamakta yeni bir dönemin açılmasını sağlamıştır. Bu çalışmada amacımız Lizozomal asit lipaz eksikliği (LALD) için bir model geliştirmektir. Lizozomal asit lipaz (LAL), çoğunlukla olarak karaciğerde bulunan ve kolesterol esterlerini serbest kolesterole parçalayan bir enzimdir. LAL enziminin yokluğunda, karaciğer hücrelerinde kolesterol esterleri birikmeye başlar ve çeşitli şiddetlerde lizozomal asit lipaz eksikliği patolojileri gözlenebilir. LALD spektrumunun en şiddetli formu, Wolman hastalığıdır ve maksimum % 1 LAL aktivitesi olan bu hastalar çoğunlukla hayatlarının ilk bir yılı içinde hayatlarını kaybetmektedir. Bununla birlikte, kolesterol ester depo hastalığı, % 3 ila% 5 enzim aktivitesine sahip daha hafif formları isimlendirmek için kullanılır. Bu hastalar, teşhis dahi konmadan erişkinliği boyunca yaşayabilen ve ancak yetişkin yaşlarda bazı semptomlar göstermektedir. Lizozomal asit lipaz eksikliği modelleri şu ana kadar hayvan modelleriyle sınırlıdır ve kişiselleştirilmiş bir yaklaşım geliştirilmek istendiğinde bu modeller oldukça yetersizdir. Yakın zamana kadar, LALD'yi modelleyen hücre hatları ya da modelleri bulunmamaktaydı, ancak yakın zamanda yapılan bir çalışmada hasta kaynaklı uPKH'lerden Wolman Hastalığı organoidleri oluşturulmuş ve böylece hastalık için moleküler mekanizma ve tedavi seçeneklerinin anlaşılmasının önü açılmıştır. Bu tez çalışmasında öncelikle, LIPA geni için indüklenebilir bir shRNA vektörünü kalıcı olarak eksprese eden uPKH klonları oluşturulmuş, daha sonra LALD için bir uPKH kaynaklı endodermal hepatik organoid (eHEPO) modeli ve 2 boyutlu (2B) hepatosit modeli yapılmıştr. LAL eksikliği olan 2B hepatositlerin, sağlıklı olanlara kıyasla LAL enzim aktivitesi seviyelerinde azalma gösterilmiştir. Ancak, eHEPO modelimizde, LIPA gen ekspresyonunda % 40'lık bir düşüşün ardından LAL enzim aktivitesinde düşüş gözlenmemiştir. Bu nedenle, hastalık fenotipini taklit etmek için gen ekspresyon seviyesinde daha dramatik bir düşüşün gerekli olduğu ve bunun sebebinin 3B organoid modelinde enzim aktivitesinin daha sıkı bir şekilde düzenlenmesinin neden olabileceği sonucuna varılmıştır. Bu durum, hastalık mekanizmasını anlamak için moleküler değişikliklerin ve enzim aktivitesini düzenleyen yolakların daha detaylı araştırılması gerektiğini göstermektedir.