Candida parapsilosis'te flukonazole uyum yanıtı: Ergosterol yolağı mutasyonları, gen ekspresyonları ve metabolomik değişimler

Candida parapsilosis kompleks, ülkemizde ve Güney Avrupa'daki birçok merkezde Candida türleri arasında kan dolaşımı enfeksiyonunun ikinci en sık nedeni olup, antifungal direncin artması nedeniyle önemli bir sağlık sorunu haline gelmektedir. Antifungal ilaçların önemli bir grubu olan azoller, lanosterol demetilaza bağlanarak bu enzimi inhibe ederler. Azol direnci, genellikle ergosterol biyosentezinde rol oynayan ERG11 ve ERG3 genlerindeki nokta mutasyonlarla ilişkilidir. Bu çalışmanın amacı flukonazolün C. parapsilosis izolatları üzerindeki etkilerini metabolomik, transkriptomik ve genomik düzeyde incelemektir. Bu çalışmaya 15 flukonazol dirençli C. parapsilosis izolatı dahil edilmiştir. Direnç profilinin analizi, Klinik ve Laboratuvar Standartları Enstitüsü (Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI) kılavuzlarına göre sıvı mikrodilüsyon testiyle gerçekleştirilmiştir. Flukonazole duyarlı olmayan izolatlar, flukonazolün 0.5 Minimum İnhibitör Konsantrasyonu (MIK) ve 1 MIK konsantrasyonuna maruz bırakılarak mRNA ekspresyon seviyesi değişiklikleri, kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) ile ölçülmüştür. Flukonazolün C. parapsilosis hücrelerinin metabolomik profilleri üzerindeki etkileri Nükleik Manyetik Rezonans Spektroskopisi (NMR) ile incelenmiştir. Sanger dizi analizi sonuçları izolatların 10/15'inin (%66) ERG11 geninde Y132F mutasyonu taşıdığını ve hepsinin ERG3 geninde bir "missense" mutasyon (C825T) taşıdığını göstermiştir. Mutasyon tipine bakılmaksızın ERG11 mRNA ekspresyonunda bir artış gözlenmesine rağmen, seçilen izolatlardan bazıları flukonazol maruziyeti altında farklı davranışlar sergilemiştir. Tüm izolatlarda, özellikle K478'de, yüksek flukonazol konsantrasyonu altında ERG11 mRNA ekspresyonunda azalma eğilimi gözlenmiştir. En yüksek ERG3 ve UPC2 mRNA ekspresyon seviyeleri K478'de gözlenmiş olsa da, azalma eğilimi bu genlerdeki yüksek flukonazol konsantrasyonlarında da tespit edilmiştir. Metabolomik analiz sonuçlarına göre, flukonazol maruziyeti altında en belirgin şekilde değişen metabolik yollar 1) alanin, aspartat ve glutamat metabolizması, 2) arginin ve prolin metabolizması, 3) homosistein, metionin metabolizması ve 4) arabinitol metabolizmasıdır. Çalışmamızda gözlenen bu metabolomik değişikliklerin, nitrojen asimilasyonu ve oksidatif stres tepkileri olan iki önemli biyokimyasal süreçle ilişkili olduğu düşünülmektedir. Sonuç olarak, ilaca dirençli C. parapsilosis izolatlarında, ergosterol biyosentezi ile ilişkili enzim genlerinin mRNA ekspresyonu açısından flukonazol maruziyetine verilen yanıt suşa özgüdür. Bu durum, ergosterol sentezi yolağı ve kontrolü ile ilişkili enzimleri kodlayan genlerindeki nokta mutasyonlarının yanı sıra, farklı hücre içi düzenlemelerin olduğunu göstermektedir. Bu düzenlemeler hücre içinde çok çeşitli metabolomik değişikliklere yol açarken, hemen hemen tüm izolatlarda flukonazolün toksik etkisini nötralize etmek ve hayatta kalmayı sağlamak için ortak bir metabolik yanıt oluştuğu gözlenmektedir. Bu hayatta kalma stratejisinin ayrıntılı ve derinlemesine araştırılması, gelecekte yeni ilaç hedeflerini ortaya çıkarılmasına katkı sunacaktır. Anahtar kelimeler: C.parapsilosis, azol direnci, ERG11 geni, ERG3 geni, UPC2 geni, kantitatif gerçek zamanlı PCR(qRT-PCR), Sanger dizileme, NMR spektroskopisi