Yeni bir esteraz enziminin aktif bölgesinde alanin taraması

Çeşitli kimyasal maddeleri sentezleyen enzimlerin özelliklerini değiştirmek, üretimini arttırmak için protein dizisi ve yapısında yapılan modifikasyonların tamamı protein mühendisliği alanına girmektedir. Protein mühendisliği çalışmaları, istenen molekülün kimyasal sentezini katalize eden enzimlerin özelliklerinin iyileştirilmesi için kullanılan rekombinant DNA teknolojilerini kapsar. Yeni enzimlerin bulunması, karakterizasyonu, koşulların optimize edilmesi gibi tüm çalışmalar sayesinde, enzim üretim maliyeti azaltılmaya ve daha yüksek ölçekte üretim yapılmaya çalışılmaktadır. Esteraz enzimi, α/β hidrolaz katlanmasına sahip olan ve ester bağlarının hidrolizini katalize eden hidrolaz sınıfı enzimlerindendir. Esterazlar, çeşitli karbon kaynaklarına ulaşmak için evrimsel olarak büyük substrat toleransları sergiledikleri düşünülen bitkilerde, hayvanlarda ve mikroorganizmalarda yaygın dağılıma sahiptirler. Organik solventlerde bile kararlılık gösterdiklerinden dolayı saf ürünlerin elde edilmesi için oldukça tercih edilen biyokatalizörlerdir. Gıda, sağlık, ilaç, deterjan endüstrisi gibi pek çok endüstriyel uygulamada, ester bağlarını hidrolize etme sürecinden faydalanılmaktadır. Endüstriyel alanda esteraz enzimine talep çok fazla olduğundan, yeni esteraz enzimlerinin eldesi ve protein mühendisliği yaklaşımlarıyla karakterizasyon çalışmaları devam etmektedir. Endüstriyel olarak enzimler üretilirken yüksek basınç, sıcaklık ve yüksek enerji gerektiren pH gibi koşulların sağlanması gerekli olabilir. Aynı zamanda, enzimlerin aktivitesini sabit tutmak ve koşulları sağlamak gibi sınırlamalar, endüstriyel enzim üretimini yüksek oranda etkiler. Bu kısıtlamaların üstesinden gelmek ve düşük maliyetle yüksek verim elde etmek için enzimlerin uygulama alanlarını arttırmak amacıyla protein mühendisliği yaklaşımları uygulanmaktadır. Protein mühendisliğinin üç farklı stratejisi; rasyonel tasarım, yönlendirilmiş evrim ve yarı rasyonel tasarım, enzimlerin dizisini ve yapısını değiştirmek için uygulanabilir. Bu tez çalışmasında, yeni bir esteraz enziminin üç boyutlu yapısı hakkında tahmin edilen bilgiler, rasyonel tasarım yaklaşımına dayanan bölgeye yönelik mutasyon yöntemi kullanılarak aydınlatılmaya çalışılmıştır. Bölgeye yönelik mutasyon yöntemi ile ilgili genel yaklaşım, yapısal bilgi ve aktif bölge çalışmalarına dayanmaktadır. Bu strateji, enzim - substrat kompleksi, kofaktör özgünlüğü ve aktivite çalışmalarında sıklıkla kullanılmaktadır. Bölgeye yönelik mutasyon kullanılarak gerçekleştirilen amino asit dizisindeki yapılan değişikliklerin sonucunda, elektrokimyasal etkileşimlerde farklılıklar oluşabilir. İstenen mutasyonu elde etmek için tasarlanan primerler, PZR tekniği ile gerçekleşen deneysel çalışmalar ile hedeflenen bölgelere bağlanır. Bölgeye yönelik mutasyon, genler üzerinde yapılan modifikasyon çalışmaları ve enzimlerin katalitik mekanizmaları incelenerek bir proteinin yapı-fonksiyon ilişkisinin çözümü için çok değerli bir yöntemdir. Enzimlerdeki belirli özellikler, bölgeye yönelik mutasyon ve diğer farklı protein mühendisliği stratejilerinin başarılı kombinasyonları ile geliştirilebilir. Daha önceki çalışmalarda Acıgöl'den toplanan mikroorganizma kültürlerinden izole edilmiş olan esteraz kodlayan gen, pET28-a vektörüne aktarılarak kompetan C43 hücrelerine transformasyonu gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada, PZR reaksiyonlarında kalıp (template) DNA'sı olarak esteraz genini içeren pET28-a plazmidi kullanılmıştır. Esteraz geninin protein dizisi translasyonu ExPASy programı ile yapılmıştır. Daha sonra, SWISS Model yazılımı kullanılarak protein dizi karşılaştırması yapılmıştır. "Protein Data Bank" veri tabanında en yakın tahmini üç boyutlu yapı ve protein araştırılmış, en yakın proteinin %34 benzerlik oranı ile, Escherichia coli (Ec_ybfF)' den elde edilmiş olan esteraz ybfF proteini olduğu görülmüştür. Esteraz ybfF proteininin aktif bölgesindeki aminoasitlerle (H234 ve S206) çalışmada elde edilen proteinin belli bir bölgesindeki aminoasitlerin (H237 ve S87) benzerlik gösterdiği farkedilmiştir. Bu nedenle, H237 ve S87 amino asitlerinin yeni enzimimizin katalitik üçlüsünün üyeleri olduğu hipotezinin doğrulanması için PZR temelli bir yöntem olan bölgeye özel alanin taraması uygulanmıştır. Alanin tarama tekniği, belirli bir pozisyondaki hedef amino asidin katalitik ve fonksiyonel rolünü tanımlamak için kullanılır. Özellikle, hedef amino asit kalıntılarının alanin amino asiti ile sistematik olarak değiştirilmesiyle bilinmeyen yapıdaki proteinlerde katalitik aktiviteye katılan kritik amino asitleri tanımlamak için kullanılır. QuikChange® ile tasarlanan primerler ile gerçekleştirilen PZR reaksiyonlarıyla hedef amino asitlerin alanin ile değiştirilmesinin sebebi alanin'in -R grubundaki metilin yüklü olmaması ve hacimsel olarak uygun büyüklükte olmasıdır. Böylece alanin amino asidi, proteinin ana zincirinin konformasyonunu değiştirmez ve elektro kimyasal değişimlere neden olmaz. Ayrıca protein katlanması ve stabilitesi ile üç boyutlu yapıda orijinal tip protein ile kıyaslandığında ciddi değişime uğramaz. Mutant amplikonlar, mutasyona uğramamış DNA'yı uzaklaştırmak için metilasyona duyarlı restriksiyon enzimi olan DpnI ile parçalanmıştır. Daha sonra DpnI kesimi uygulanmış PZR ürünlerinin C43 kompetan hücrelerine transformasyonu gerçekleştirilmiştir. Elde edilen kültürler 100 µg/ml kanamisin içeren LB agar platelere ekilmiş ve gece boyunca 37 °C' de inkübe edilmiştir. Plazmid izolasyonu sonrası, agaroz jel elektroforezi yapılmıştır. Mutasyon kontrolü için, örneklerin DNA dizi analizi yapılmış ve istenen mutasyonu içeren plazmidlerle protein ekspresyon aşamalarına başlanmıştır. Başlangıçta, 0.01 mM IPTG ilave edildikten sonra 30 °C'de 6 saatlik inkübasyon ile ekspresyonu indüklenmiştir. Ardından 6xHis tag prosedürü ile H237A ve S87A mutant esteraz geni taşıyan pET28 vektörünün proteinlerinin saflaştırılması gerçekleştirilmiş ve kontrolü SDS-PAGE analizi ile yapılmıştır. IPTG ile gen ekspresyonu indüksiyonu sonrası H237A ve S87A için 25-35 kDa aralığında bantlar tespit edilmiştir. Esterazların molekül ağırlığının 27-54 kDa arasında değiştiği bilindiğinden sonucun doğru olduğu tespit edilmiştir. Sonraki aşamada elde edilen proteini saflaştırmak için santrifüjlü ultrafiltrasyon yapılmıştır. Bradford protein analizi ile konsantrasyon ölçümü yapılmış olup, S87A mutant esteraz için 1.3mg / ml, H237A mutant esteraz için 4.5 mg / ml ve orijinal tip için 5.5 mg / ml olarak ölçülmüştür. Orijinal tip enzim ve mutant enzimlerinin kinetik ölçüm analizi, pH8' de ve substrat olarak 1 mM Para-nitrofenol (pNP) kullanılarak 410 nm dalga boyunda gerçekleştirilmiştir. Her biri 30 º C'de 20 dakika boyunca inkübe edilen enzimlere ait üçlü enzimatik aktivite ölçümleri, ayrı ayrı üç bağımsız deney seti şeklinde gerçekleştirilmiştir. IPTG ile gen ekspresyonu indüksiyonu sonrası H237A ve S87A için 25-35 kDa aralığında bantlar tespit edilmiştir. Esterazların molekül ağırlığının 27-54 kDa arasında değiştiği bilindiğinden sonucun doğru olduğu tespit edilmiştir. Sonraki aşamada elde edilen proteini saflaştırmak için santrifüjlü ultrafiltrasyon yapılmıştır. Bradford protein analizi ile konsantrasyon ölçümü yapılmış olup, S87A mutant esteraz için 1.3mg / ml, H237A mutant esteraz için 4.5 mg / ml ve orijinal tip için 5.5 mg / ml olarak ölçülmüştür. Orijinal tip enzim ve mutant enzimlerinin kinetik ölçüm analizi, pH8' de ve substrat olarak 1 mM Para-nitrofenol (pNP) kullanılarak 410 nm dalga boyunda gerçekleştirilmiştir. Her biri 30 º C'de 20 dakika boyunca inkübe edilen enzimlere ait üçlü enzimatik aktivite ölçümleri, ayrı ayrı üç bağımsız deney seti şeklinde gerçekleştirilmiştir. Kinetik ölçüm sonucunda, pH237A mutant esteraz ve S87A mutant esteraz enzimlerinin orijinal tip esterazın sahip olduğu katalitik aktiviteye sahip olmadığı gözlenmiştir. Bu çalışma ile, yeni bir esteraz enziminin sırasıyla 87. ve 237. pozisyonlarında bulunan Serin ve Histidin amino asitlerinin enzimin katalitik aktivitesinden sorumlu olan katalik üçlünün üyeleri oldukları kanıtlanmıştır. Yeni bir esteraz enziminin yapısal ve fonksiyonel özelliği hakkında edinilen bu bilgiler, alternatif protein mühendisliği yöntemlerinin kullanılarak ayrıntılı yapı - fonksiyon analizine dayalı istenilen özelliklerin geliştirilmesini hedefleyen, ileride yapılacak çalışmalara yön gösterici olarak kullanılabilecektir.