Ailevi akdeniz ateşi hastalığında mefv varyasyonlarının, ekspresyonunun ve pirin seviyesinin analizi

Ailevi Akdeniz ateşi (AAA) otozomal resesif olarak kalıtılan otoinflamatuvar bir hastalıktır. Periodik olarak tekrarlayan ateş, eklem göğüs ve karın ağrısı hastalığın belli başlı bulgularıdır. AAA hastalığı bir çok popülasyonda gözlemlenmesine karşın, hastaların büyük çoğunluğunu Akdeniz kökenli popülasyonlardan bireyler oluşturur. Hastalık özellikle, Türkler, Ermeniler, Araplar ve kuzey Afrika Yahudileri arasında yaygındır. AAA hastalarında dönemsel olarak meydana gelen inflammatuvar ataklar çeşitli organlarda amiloid birikimine yol açabilmektedir. Bu durum hastalığın seyrinde ağırlaşmaya yol açmakta ve bireylerin hayat kalitesini ve ömrünü etkileyebilmektedir. Dolayısıyla hastalık prognozu organlardaki amiloid birikiminin engellenmesine bağlıdır. Anti-inflammatuvar bir ilaç olan kolşisin 1972 yılından bu yana AAA hastalığının tedavisinde kullanılmaktadır. Yapılan çalışmalar ilacın AAA hastalarında pediodik atakları ve amiloid oluşumunu engellediğini göstermiştir. Ancak, hastaların yaklaşık olarak %30-40‟ı ilaca kısmi cevap vermekte, %5-10‟u ise direnç göstermektedir. Buna ek olarak, hastaların %2-5'inde ilaca hassasiyet rapor edilmiştir. Bu nedenle, kolşisine alternatif olabilecek çeşitli biyolojik ajanların AAA hastalığının tedavisindeki rolü araştırılmaktadır. Akdeniz ateşi geni (MEFV) kromozom 16'da 13.3 bölgesinde bulunur ve 10 ekzondan oluşur. Bugüne kadar MEFV geninde 200'den fazla sekans varyasyonu rapor edilmiştir ve bu varyasyonlardan ekzonik bölgelerde yer alanların büyük çoğunluğu hastalık ile ilişkilendirilmiştir. Hastaların %70'inden fazlasında yaygın olarak gözlemlenen varyasyonlar MEFV geninin ekzon 2 (E148Q, R202Q) ve ekzon 10 (M680I, M694V, M694I ve V726A) bölgelerinde bulunur. Buna karşın, hastalığın teşhisini kolaylaştırmak amacıyla MEFV geni üzerindeki patalojik varyasyonların taranması AAA'nın yaygın olarak gözlemlendiği popülasyonlardaki yüksek taşıyıcılık oranı nedeniyle kesin tanıda yetersiz kalabilmektedir. Bunun yanı sıra, MEFV geni üzerinde her hangi bir patolojik varyasyon saptanamayan, buna karşın tipik AAA kliniği gösteren hastalar da mevcuttur. Bu durum, otozomal resesif geçiş gösteren kalıtsal Mendel hastalıklarında gözlemlenen modele uymamaktadır. Bu amaçla MEFV geninin ilişkili olabilecek epigenetik ve taranskiripsiyonel düzenleyici mekanizmalarını araştırdık. İlk bulgularımıza göre, MEFV geninin ekzon 2 bölgesinde meydana gelen metilasyon hücre çekirdeğinde, hücre kültürü modellerinde ve hasta lökositlerinde alternatif kırpılma sonucunda yeni bir varyant oluşmasına neden oluyor. Bu varyant daha sonra sitoplazmada protein izoformuna dönüştürülüyor. MEFV geninin kırpılmamış formu 781 amino asitten (a.a.) oluşan pirin/marenostrin proteinini kodlar. MEFV-d2 (MEFV Δ2) ise MEFV genine ait alternatif kırpılma sonucunda exon 2 bölgesinin silinmesiyle oluşan bir izoform olup, 570 a.a. uzunluğunda bir protein kodlar. Buna ek olarak pirin proteinine ait başka izoformlar da tanımlanmıştır. Bu tez çalışmasında, AAA hastaları ve kontrollerde MEFV gen varyasyonlarının transkript ve protein seviyesi ile korelasyonu araştırılmıştır. Daha önceki çalışmalar MEFV geninin dendritik hücreler, sinovyal fibroblastlar, nötrofiller, eozinofiller ve monositlerde ifade edildiğini göstermiştir. Farklı MEFV varyasyonlarını MEFV geninin transcript seviyesi ile ilişkilendiren çalışmalar mevcuttur. Yapılan bir çalışmada, AAA hastalarının mRNA seviyeleri sağlıklı bireylerden düşük bulunmuştur. Buna ek olarak, sağlıklı taşıyıcılarla karşılaştırma yapıldığında sağlıklı taşıyıcıların mRNA seviyesi orta düzeyde bulunmuş, bu da mutasyon sayısının mRNA miktarı ile ilişkili olabileceğini düşündürtmüştür. Ayrıca, mutasyonun bulunduğu gen bölgesine ve tipine göre de MEFV ekspresyonunun değişebileceği gösterilmiştir. M694V mutasyonu taşıyan bireylerde mRNA seviyesinin diğer hastalara oranla en düşük seviyede olduğu ve M694V mutasyon sayısındaki artışın bu oranı daha da düşürdüğü belirtilmiştir. Buna ek olarak E148Q mutasyonu taşıyan bireylerin mRNA seviyesinin diğer hastalardan daha yüksek olduğu gösterilmiştir. Grubumuz tarafından yayınlanan daha önceki çalışmalarda da MEFV taranskript seviyesinin AAA hastalarında düştüğü gösterilmiş, buna karşın alternatif kırpılma sonucunda ekzon 2'nin silinmesiyle oluşan transkript seviyesinin kontrollere oranla hastalarda daha yüksek olduğu gösterilmiştir. Ancak pirin proteininin AAA hastalığında ve inflamasyondaki rolü henüz aydınlatılamamıştır. Bu nedenle, yürütülen çalışmada hasta-kontrol çalışması yönteminden yararlanılarak farklı genotiplere sahip AAA hastalarında MEFV geninin ifadesinin ve pirin protein seviyesinin araştırılması amaçlanmaktadır. Bu doğrultuda, 69 AAA hastası ve 28 sağlıklı kontolün genotiplerini belirlemek amacıyla MEFV geninde varyasyon analizi yapılmıştır. 69 AAA hastasından 8'inde (%11) her hangi bir patalojik varyasyon bulunamamıştır. Buna karşın 30 (%43) hastada ekzon 2 bölgesinde varyasyon bulunmuş, 31 (%44) hastada ise ekzon 10 bölgesinde patalojik varyasyonlar tespit edilmiştir. MEFV geninin farklı transkriptlerinin ifadesi ekzon 1-3, ekzon 2-3 ve ekzon 4-5 bağlantı bölgelerini hedefleyen primerler kullanılarak Kantitatif- gerçek zamanlı PZR (Q-PCR) yöntemi ile araştırılmıştır. Farklı genotiplere sahip hastalar ve sağlıklı kontrollerin pirin seviyelerini karşılaştırmak amacıyla ise bireylerin tam hücre lökositleri izole edilerek, bu hücrelerde anti-pirin antikoru kullanılarak western blot analizi yapılmıştır. Elde edilen sonuçların yarı kantitatif analizi Image-Lab yazılımı ile hacim densitometre yöntemi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Daha önceki çalışmalardan farklı olarak, yürütülen çalışmada MEFV transkript seviyesinin hasta ve kontoller arasında değişmediği bulunmuştur. Bugüne kadar yürütülen çalışmaların planlanmasındaki farklılıklar ve farklı çalışmalarda MEFV geninin farklı bölgelerinin hedeflenmesi, MEFV geninin farklı transkriptlerinin hedef alınmasına yol açmış, bu durum da çalışmalarda genin ifadesi ile ilgili sonuçların farklılık göstermesiyle sonuçlanmış olabilir. Ancak, daha önceki çalışmalarda sınırlı sayıda örnek ile çalışıldığı, buna karşın yürütülen tez çalışmasında daha önceki çalışmalara oranla daha fazla örnek ile çalışıldığı göz önünde bulundurulmalıdır. Yürütülen çalışmada gen ifadesinin yanı sıra pirin protein seviyesi de 48 hasta ve 24 sağlıklı kontrolde araştırılmış ve AAA hastası bireylerde pirin miktarında kontrollere oranla anlamlı bir artış gözlemlenmiştir (p= 0,0092). Hastalarda gözlemlenen yüksek pirin seviyesinin periodik inflamatuvar ataklara neden olan AAA hastalığının fenotipinin oluşmasında etkili olabileceği düşünülmektedir. Elde edilen bulgular pirin proteinin imflamasyonu tetikleyici rol oynadığı yönündeki hipotezi destekleyici niteliktedir. Sunulan tez çalışmasında, MEFV geninin transkript seviyesi ile pirin proteinin seviyesi arasında bir korelasyon bulunamamıştır. Bu bulgular AAA hastalığının oluşumunda post-trasnkripsiyonel mekanizmaların etkili olabiliceğini düşündürmektedir. İleriki çalışmalarda, transkript ve protein seviyesinde hücre alt tipleri ayrıştırılarak analizlerin tekrarlanması, bunun yanı sıra transkript ve protein izoformalarının ayrı ayrı incelenmesi MEFV geninin hastalık ile ilişkisinin daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır. AAA hastalarında atak dönemlerinde yoğun belirtiler gözlemlenir. Bu nedenle, ataklı hastaların çalışmaya dahil edilmesi hastalık patogenezi hakkında daha fazla bilgi sağlayacaktır.