Farklı saklama sıcaklığına bağlı olarak spermatozoonlarda sitoplazmik mRNA içeriğindeki değişimlerin erken embriyonik gelişim üzerine muhtemel etkileri

Amaç: Yardımcı üreme teknikleri, infertil çiftlerin gebe kalmaya yönelik tedavisinde kullanılan teknikler bütünüdür. Infertilite ise, bir yıl süren korumasız ve düzenli cinsel ilişkilerden sonrasında gebe kalmama durumudur. Yardımcı üreme teknikleri IVF, ICSI, kriyoprezervasyon, ilaç tedavisi gibi tıbbı uygulamaları kapsamaktadır. Yardımcı üreme tekniklerinin tarihi MÖ 2200 antik Mısır zamanına kadar uzanmaktadır. Tıbbi bir müdahale olan suni tohumlama ise 1784 yılında Spallanzani tarafından geliştirilmiştir. İnsanlarda ilk 'tüp bebek' olan IVF bebeği 25 Temmuz 1978'de İngiliz Oldham General Hastanesi'nde dünyaya gelmiştir. Bu başarıyı elde eden jinekolog Dr. Patrick Steptoe ve fizyolog Robert Edwards sonra da Nöbel Ödülüne layık görülmüştür. ICSI tekniği ise Gianpiero D. Palermo tarafından Brükseldeki Reprodüktif Tıp Merkezinde şans eseri olarak bulunmuştu. ICSI tedavisinden sonra ilk bebek 14 Ocak 1992'de doğmuştur. Türkiye'de ise ilk tüp bebek 02.05.1989 yılında Ege Üniversitesi Tüp Bebek Merkezinde doğmuştur. O yıllardan bu güne her yıl giderek artan sayıda çift infertilite nedeniyle tedavi olmaya başlamıştır. Günümüzde her 100 çiftten 20 si gebe kalma sorunlarını yaşamaktadır. 2015 yılında sadece Avrupa Birliğinde Yardımcı üreme tekniklerini kullanarak 157.500 bebek dünyaya gelmiştir. Bu rakamlar, yardımcı üreme tekniklerinin gittikçe artan önemini göstermektedir. Tıbbı teknolojinin gelişmesine rağmen Yardımcı üreme teknoloji alanında başarı oranları hala yüksek değildir. Teşhis konan infertilite vakaların yanı sıra 4 vakada 1 gibi yüksek oranda bilinmeyen başarısızlık söz konusudur. Yani, muhtemel unsurların (ovaryum, oviduct, uterus, x endometrium, oosit, sperm) sağlıklı görünmesine rağmen ortaya çıkan infertilite olguları görülmektedir. Son çalışmalar embriyo genomunun aktifleşmesine kadar zigot gelişiminde rol oynayan sitoplazmik mRNA ların önemine dikkat çekmektedir. Günümüze kadar bu mRNA ların oosit kaynaklı olduğunu, spermde hiç bulunmadığını var sayılmaktaydı. Fakat yeni bulgularına göre, sağlıklı spermatozoitlerin az miktarda sitoplazmaya sahip olduğu fertilizasyon sırasında da bunları zigotun içine getirdikleri belirlenmiştir (Miller, 2010). Bu durumda, maternal mRNA havuzuna az miktarda paternal mRNA da dahil olmaktadır. Yeni çalışmalara göre, sitoplazması olmayan sperm ile ICSI yapıldığında embriyonun arest olması, bu paternal mRNA havuzunun önemini göstermektedir. Nedeni bilinmeyen infertilite olgularında paternal mRNA havuzunun araştırması oldukça büyük önem taşımaktadır. Bu araştırmaların sonuçlarına göre ICSI mediumlarının geliştirilmesi, ICSI ve ART teknolojilerinin geliştirilmesine ve başarı oranlarının yükseltilmesine katkı sağlayabilir. Proje, spermatozoon sitoplazmasındaki mRNA stoğu üzerinde odaklanmaktadır. Zigot gelişiminde önemli rol oynadığı bilinen 5 adet mRNA'nın (TET3, NPM2, CNOT1, CNOT8, XRN1) Oryctolagus cuniculus sperm sitoplazmasında araştırılmış ve saklama koşullarının (4 veya 15 °C) bu mRNA içerikleri üzerine etkileri araştırılmıştır. Bu mRNA'ların fonksiyonları aşağıda özetlenmiştir. NPM2: paternal kromatinin yeniden modellenmesi (protamin-histon değişimi), TET3: totipotensi kazanımı (DNA demetilasyonu), CNOT1, CNOT8 ve XRN1: mRNA yıkımı. Bu çalışmanın amacı, yukarıda bahsedilen erken embriyonik gelişimine katılan 5 gene ait mRNA'ların Oryctolagus cuniculus sperm sitoplazmasında tespiti ve farklı saklama koşullarının bunlar üzerine etkisinin belirlenmesidir. Gereç ve Yöntem: Çalışmada kullanılan beş Yeni Zelanda ırkı erkek tavşan her biri 4-5 kg canlı ağırlığa sahiptır. Fertilitesi bilinen tavşanlar rutin bakım-besleme koşullarında (16-28°C sıcaklık ve %55-60 nisbi nem oranı) bireysel kafeslerde barındırılmış, ad libitum su ve arpa pelleti ile beslenmiştir. Tez çalışmasında, erkek tavşanlardan suni vajen ile toplanan sperma örnekleri kullanılmıştır. Hayvanlar, ortamda herhangi bir yapay ışık düzenlemesi yapılmaksızın gün ışığına maruz bırakılmıştır. Deney sonunda hiçbir tavşanlar öldürülmemiştir. Spermatolojik xi muayeneler, Adnan Menderes Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dölerme ve Suni Tohumlama Anabilim Dalı laboratuvarında gerçekleştirilmıştır. 1. Spermanın alınması ve ön muayenesi Suni vajen yardımıyla alınan spermaların mikroskobik kontrollerinde kitle hareketi 3 ve üstü (0-5 arası skalada), motilitesi %70 ve üstü, anormal spermatozoon oranları ise %20'nin altında olan ve yoğunluğu 250x106 spermatozoa/ml olmalarına özen gösterilmiştir. Tavşanlar arasındaki bireysel farklılıkları yok edebilmek amacıyla yukarıdaki koşullarını sağlayan ejakulatlar 37°C su banyosunda birleştirilip pool edilerek kullanılmıştır. 2. Spermanın Sulandırılması ve Deneysel Grupların Oluşturulması Birleştirilmiş ejekülatlar iki eşit kısma ayrıldı ve önceden 37°C dereceye ısıtılmış Tris- citric acid-glukoz medyumu kullanılarak spermatozoon yoğunluğunun 50x106/ml olacak şeklinde sulandırıldı. Sulandırma sonrası örnekler 2 kısma ayrılıp ilk bölümü 4°C de ve ikinci bölümü de 15°C de 72 saat süresince saklandı. Taze olarak alınan bir ejekülat da kontrol grubu olarak bu iki gruba eklenip, 3 grup ayrı ayrı olarak %50-75 lik percoll-TCG kolonu üzerine yerleştirildikten sonra, 1200 RPM de 10 dk santrifüj işlemiyle ölü ve yabancı hücrelerin (lipid damlacıkları) ayrılmaları sağlandı. Tüplerdeki supernatant uzaklaştırılıp tabanda kalan sperm pelleti 2ml TCG solüsyonu içinde sulandırıldı. 3. mRNA izolasyonu TCG solüsyonundaki sperm örneklerinden total RNA izolasyonu Trizol ile gerçekleştirildi, RNA örnekleri -80 ̊C'de derin dondurucuda saklandı. 4. RT-PCR çalışmaları -cDNA sentezi cDNA sentez kiti kullanılarak cDNA sentezi Applied Biosystems thermal cycler'da gerçekleştirilmiştir. -qRT-PCR qRT-PCR reaksiyonları SYBR Green PCR Master Mix ve TET3, NPM2, CNOT1, CNOT8, XRN1 primerleri kullanılarak Analizler Applied Biosystems Step One RT-PCR Sistemi ile gerçekleştirilmiş, kontrol gen olarak GAPDH kullanılmıştır. xii Normalizasyon işleminde örnekler arasında ilgili genin ifadesinin karşılaştırılma amacıyla ΔCT metodu kullanılmıştır. Karşılaştırmalı ifade seviyesi, 2-ΔΔCT formülü kullanılarak hesaplanmıştır. 5. İstatistiksel Analizler Gruplarda veriler mean±SEM olarak sunulmuş olup grupların parametreler yönünden karşılaştırılma maksadıyla T testi kullanılmıştır. Bulgular: Araştırma sonucuna göre, yukarıda belirtilen beş gen transkriptleri Oryctolagus cuniculus sperm sitoplazmasında tespit edilmiş olup onlardan miktar olarak en çok CNOT8 ve CNOT1, en az ise XRN1 ve NPM2 gen transkriptleri bulunmuştur. Ayrıca, araştırmada TET3 transkriptlerinin saklama sıcaklığına duyarlı olup 15°C'de saklanan grupta 4°C'de saklanan gruba göre daha yüksek miktarda tespit edilmiş ve gruplararası bu farkın istatistiksel olarak anlamlı (P<0.05) olduğunu saptanmıştır. Sonuç ve Öneriler: Bu çalışma, sperm sitoplazmasındaki mRNA araştırma alanındaki henüz yetersiz olan literatüre, ayrıca da Oryctolagus cuniculus alanındaki literatür havuzuna önemli katkıda bulunmaktadır. Spermatozoonların saklanma sıcaklıklarının hücre içindeki mRNA havuzunu değiştirebildiği kanısına varılmıştır (P<0.05). Ayrıca, sonraki araştırmalarda primer hazırlığı ve pipet seçimi gibi konularda dikkatli olunması tavsiye olunmaktadır.