Anadolu ballarının nitrat ve nitrit içeriklerinin tayini için analitik metod geliştirilmesi

Türkiye, coğrafi yapısı, geniş flora alanları, farklı meyve türleri ve zengin çam ormanları nedeniyle arıcılık için gerekli olan kaynaklar yönünden son derece elverişlidir. Arıcılık faaliyetleri, sağlıklı ürünler sağlamasının yanı sıra ülkemize ihracat açısından da önemli getiriler kazandıracak potansiyeldedir. Ülkemizin sahip olduğu farklı iklim bölgeleri, tarım alanları, ormanlar ve çayırlar, ülkemize arıcılık açısından büyük avantajlar kazandırmaktadır. Ayrıca ülkemiz, sadece belirli bir bölgede yetişen endemik bitkiler bakımından da zengin olup, çeşitliliğe önemli katkı sağlamaktadır. Bu zenginlik, ülkemizdeki bal çeşiti ve miktarı yönünden önemli olup, Türkiye'yi dünya çapında gelişen bal ticareti konusunda sayılı ülkeler konumuna getirmiştir. Türkiye, bal üretimi açısından tüm dünyada önemli bir yere sahip olup, bal ülkemiz için önemli bir ihracat ürünüdür. Dünya bal üretiminde ikinci sırada olan ülkemiz, 33 ülkeye bal ihraç etmektedir. Önemli bir gıda kaynağı olmasının yanı sıra bal, yüzyıllardır tıbbi tedavilerde de kullanılmaktadır. İçerdiği vitamin, mineral ve aminoasitler sayesinde çocukların gelişimine katkı sağlamaktadır. Askorbik asit, demir ve kalsiyum kaynağı olup, bağışıklık sistemi dahil vücuda pek çok faydası vardır. Ayrıca bal, güçlü antiseptik, antimikrobiyal, antifungal ve antioksidan özelliklere sahiptir. Bu sebeplerden dolayı balın, kimyasal, fiziksel ve biyolojik özelliklerinin aydınlatılması, hem tüketiciler hem de arıcılık sektörü açısından önem teşkil etmektedir. Gıdaların yapısında doğal olarak bulunan bazı kimyasallar, insan vücudunda gastrointestinal sistemde ve/veya bu gıdaların taşınma, hazırlanma, paketlenme aşamalarında yeni kimyasallara dönüşebilmektedir. Bu yeni kimyasallar, mutajenik, kanserojenik, teratojenik özelliklere sahip olabilir. Bu nedenle doğal gıdaların da kalite-kontrolü, insan sağlığını tehdit edebilecek bileşenlerinin izlenmesi son yıllarda ciddi bir önem kazanmıştır. Azot döngüsünün nitrifikasyon aşamasında bakteriler tarafından oluşan nitrat ve nitrit inorganik anyonları, bir çok sebze ve meyve ile içme sularında doğal olarak bulunmaktadır. İşlenmiş et ve et ürünlerine ise koruyucu katkı maddesi olarak ilave edilerek, bakteri oluşumunu engellemekte ve ürünlerin raf ömrünü uzatmaktadır. Nitratın insan sağlığına doğrudan bir olumsuz etkisi bulunmamaktadır. Ancak nitrat, ağızda bulunan bakteriler tarafından kısmen nitrit anyonuna indirgenir. Nitrit ise gıdalarda bulunan sekonder aminlerle birleşerek toksik ve karsinojenik nitrozaminleri oluşturur. Ayrıca nitritin, 6 aylıktan küçük bebeklerde ölümcül mavi bebek sendromuna yol açtığı bilinmektedir. Bu sebeplerden dolayı, özellikle nitrat ve nitritin koruyucu katkı maddesi olarak kullanıldığı işlenmiş gıda ürünlerindeki düzeylerinin izlenmesi tüketici sağlığı açısından önemli bir kalite-kontrol konusudur. Son yıllarda ise, gıdalarda doğal olarak bulunan nitrat ve nitritlerin sağlık üzerine faydaları ön plana çıkmıştır. Nitrat kademeli olarak, nitrit ise midede doğrudan nitrik oksite dönüşür. Nitrik oksitin ise hipertansiyonu düşürdüğü ve kardiyovasküler faydaları olduğu bilinmektedir. Bu bilgi, pek çok klinik çalışmanın öznesini oluşturup, tıp dergilerine konu olmuştur. Bu nedenle son yıllarda araştırmacılar, nitrat ve nitritin doğal olarak yapısında bulunduğu gıdaların keşfi ve miktarlarının tayin edilmesi üzerine çalışmalar yapmaktadırlar. Ancak farklı bölgelerden toplanan ve farklı botanik kökenlere sahip balların nitrat ve nitrit iyonlarının içerikleri hakkında yeterli çalışma bulunmamaktadır. Bu tez çalışmasında, Muğla, Trabzon, Kırklareli ve Isparta illerinden toplanan, farklı bitkisel orijinlere sahip 20 bal örneğinin nitrat ve nitrit düzeylerinin belirlenmesi hedeflenmiştir. Bu amaçla hızlı, basit ve ekonomik bir kapiler elektroforez yöntemi uygulanmıştır. Kapiler elektroforez, farklı gıda örneklerine başarı ile uygulanabilen bir ayırma ve analiz metodudur. Kapiler elektroforez; yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC), iyon kromatografi (IC) ve gaz kromatografi (GC) gibi klasik kromatografik yöntemlere göre az miktarda örnek tüketimi, etkin ayırma özelliği, analiz süresinin kısalığı ve ekonomik olması gibi pek çok üstünlüğe sahiptir. Elektroforetik mobiliteleri çok yüksek olan nitrat ve nitrit anyonlarının kapiler elektroforez ile analizinde bazı özel önlemler alınması gerekmektedir. Bu çalışmada, nitrat ve nitrit anyonlarının tayininde düşük pH'a sahip bir ayırma tamponu ile kapiler kolon içindeki elektroosmotik akışın hızı düşürülmüş ve polarite ters çevrilmiştir. Böylece, bu anyonların elektroosmotik mobiliteye karşı hareket edebilmesi sağlanmıştır. Ayırma ortamı olarak asidik bir tampon olan formik asit/format tamponu seçilmiş, konsantrasyonu 30 mM'a, pH'ı ise 4,00'a sabitlenmiştir. Gıdalarda katkı maddesi olarak kullanılmadığı takdirde, nitrit miktarları genellikle çoğu analiz yöntemi ile tespit edilemeyecek kadar düşük düzeydedir. Bu çalışmada da, 30 mM formik asit/format tamponunda tüm bal örneklerinde nitrit, bazı bal örneklerinde ise nitrat miktarları tespit edilememiştir. Bu nedenle, deteksiyon limitlerini düşürüp hassasiyeti arttıracak örnek sıkıştırma metodu denilen bir ön-zenginleştirme metodu uygulanmıştır. Örnek sıkıştırma metodu, tampon çözelti bölgesi ile örnek bölgesi arasında bir elektrik alan farkı yaratılması esasına dayanır. Tampon çözeltinin iletkenliği arttırılarak bu bölgede elektrik alanın azalması sağlanır. Buna karşılık örnek bölgesinin ise iletkenliği azaltılarak, bu bölgedeki elektrik alanın artması sağlanır. Kapiler elektroforezde normal injeksiyon süresi genellikle 6 sn olup, injekte edilen örnek 1-50 nL hacmindedir. Örnek sıkıştırma metodunda ise, injeksiyon süresi arttırılarak kapiler kolona fazla miktarda örnek yüklenir. Yüksek elektrik alan altında hızla hareket eden analit molekülleri, tampon bölgesinde sıkışır ve konsantre edilmiş pikler halinde dedekte edilir. Bu çalışmada, 30 mM formik asit/format tamponuna, 30 mM sodyum sülfat ilave edilmiştir. İlave edilen sodyum sülfat sayesinde tamponun iletkenliği arttırılmış, diğer bir deyişle bu bölgedeki elektrik alanın azalması sağlanmıştır. İnjeksiyon süresi ise 160 sn'ye çıkarılmıştır. Bu sayede yöntemin deteksiyon limitleri düşürülerek yöntemin hassasiyeti arttırılmıştır. Yöntem, bal örneklerindeki nitrat ve nitrit anyonlarının analizinde başarı ile uygulanmıştır. Nitrat ve nitrit için deteksiyon limitleri sırasıyla 0,013 mg L-1 ve 0,014 mg L-1 olarak bulunmuştur. Bilinen standartlar ile hazırlanan kalibrasyon eğrileri 1,5 ile 30 µmol L-1 konsantrasyon aralığında çizilmiş, korelasyon katsayıları nitrat ve nitrit için sırasıyla 0,999 ve 0,998'dir. Yöntemin tekrarlanırlığı ise standart bir nitrat ve nitrit çözeltisinin gün içi 7 kez, günler arası (3 gün) 21 kez injeksiyonu ile test edilmiştir. Tekrarlanırlık sonuçları % relatif standart sapma cinsinden her iki anyon için de %5'den küçük olarak bulunmuştur. Geri kazanım değerleri ise her iki anyon için de % 90.2 ve 107 arasında değişmektedir. Bal örneklerinin analizi sonucu elde edilen nitrat ve nitrit pikleri, kalibrasyon eğrileri ile değerlendirilip, bu anyonların ballardaki miktarları aydınlatılmış ve verilerin değerlendirilmesi çeşitli istatistiksel testlerle sağlanmıştır. Nitrat anyonu bütün bal örneklerinde 2,53 ile 31,8 mg kg-1 arasında değişen miktarlarda tespit edilmiştir. Nitrit ise 20 bal örneğinin sadece 12'sinde tespit edilmiş olup, miktarları 0,0891 ile 0,533 mg kg-1 arasında değişmektedir. Analiz sonuçlarının irdelenmesinde ana faktör olarak balların bitkisel orijinleri ve toplandığı bölgeler ele alınarak, istatistiksel anlamlılık ve çoklu karşılaştırma testleri ile ballar arasında farklılık olup olmadığı belirlenmiştir. Çam balı örnekleri, nitrat içeriği bakımından diğer bal örneklerine göre %95 güven seviyesi ile önemli derecede yüksek bulunmuştur (p < 0,05). Çam balı ile kestane balı arasında ise anlamlı bir farklılık bulunmamıştır (p > 0,05). Örneklerin nitrit miktarlarının çok düşük seviyede olması ise, balın nitrit bakımından güvenilir bir gıda olduğunun göstergesidir. Ek olarak bal, gastrik yaralar ve hipertansiyona karşı nitrik oksit üretimine yardımcı olabilir. Bu yüzden, bu hastalıklardan şikayetçi olan bireylerin diyet listelerine eklenebilir. Bu çalışmada, dünya bal üretiminin önemli bir kısmını gerçekleştiren Anadolu ballarının nitrit ve nitrat içerikleri belirlenerek, ülkemiz ve dünya balları ile karşılaştırma yapılması amaçlanmıştır. Çalışmanın sonuçları, ülkemizdeki bal üreticilerine, arıcılık konusunda faaliyet gösteren kuruluşlara, ihracatçılara ve tüketicilere yönelik bilgilendirilme konusunda önemli katkılarda bulunacaktır. Özellikle ihraca yönelik ballarda nitrit ve nitrat oranlarının belirlenmesi, bu oranların fazla çıktığı ballarda nedenlerin ve azaltılma yollarının düşünülmesi bal kalitesini arttırabilir.