Antihistaminik ilaçların drosophila melanogaster gelişimi üzerine etkileri

Antihistaminiklerin canlı gelişimi üzerine etkileri uzun zamandır mercek altına alınan bir konudur. Loratadin (Etil-4-(8-kloro-5,6-dihidro-11H-benzo[5,6]siklohepta [1,2b] piridin-11-ylidene)-1-piperidinkarboksilat) 2. kuşak antihistaminik ilaç etken maddelerindendir ve günümüzde alerjik cilt hastalıkları, özellikle atopik ekzema, akut nezlesi, kurdeşen, göz alerjisi, saman nezlesi gibi alerjik hastalıkların tedavisinde sıklıkla kullanılmaktadır İnsan başta olmak üzere genel anlamda da canlıların maruz kaldığı etkenlerin canlılar üzerine herhangi bir etkisinin olup olmadığının anlaşılmasında çeşitli araştırma yöntemleri kullanılır. Burada genel olarak maruziyet şekli dikkate alınarak bu yöntemler belirlenir. Ancak seçilen hücre hatları ya da model organizma türüne göre de farklı yöntemler kullanılabilir. Canlı vücuduna farklı şekilde nüfuz edebilen maddeler için, nüfuz etme şeklinden farklı olarak beslenme şeklinde de uygulamalar yapılabilir. Yapılan çalışmalarda, bu maddelerin organizmanın gelişim evrelerine etkisinin olup olmadığı da araştırma konularındandır. Aynı zamanda uzun süreli maruz kalınan etkenlerle çalışılırken kronik uygulamalar da yapılır. Diğer yandan, çalışmalarla bu maddelerin nesiller boyu etkilerinin olup olmadığı da araştırma konularındandır. Yapılan bu araştırmada da, kullanımı ile insan vücuduna nüfuz eden, kişiye bağlı olarak uzun süreli kullanımı söz konusu olan, antihistaminik ilaç etken maddesi loratadinin Drosophila melanogaster'in besin ortamı vasıtasıyla maruziyeti sağlanarak F1 ve F2 nesillerinde gelişim süreçleri ve davranışları üzerine etkisinin olup olmadığı araştırılması amaçlanmıştır. Drosophila melanogaster için 250 mL cam şişelerde besi yerleri hazırlandı. Ergin bireylerin toplanması için kültür şişelerinde çaprazlamalar yapıldı ve deney için kullanılacak olan stoklar oluşturuldu. Oluşturulan stok Drosophila melanogaster'ler ayrı kültür şişelerinde muhafaza edildi. Loratadin etken maddesinin eşik değerinin belirlenmesi için Dünya Sağlık Örgütü'nün sivrisinekler için önerdiği metod uygulanmıştır. Bunun için, 50 mL standart besiyeri içine farklı konsantrasyonlarda hazırlanan etken maddeden 1 mL ilave edilmiştir. 24 saat bekledikten sonra ölen ve canlı kalan birey sayıları not edilmiş ve ölüm yüzdeleri hesaplanmıştır. Bu işlemlerden sonra, deneyde kullanacak dozlar 25, 50 ve 100 µg/mL olarak belirlenmştir. Deney düzenekleri, 4,5 gram kuru Drosophila hazır besiyerine, belirlenen konsantrasyonlar olacak şekilde hazırlanan 9 mL Loratadin (LOR) etken madde eklenerek oluşturulmuştur. Etken maddenin metamorfoz süresine etkisini gözlemlemek için 20 dişi ve 20 erkek çaprazlanarak yumurta, larva, pupa ve ergin sineklerin ilk olarak ortaya çıktıkları gün kaydedilmiştir. F1 nesline ait metamorfoz süreleri kontrol ve deney grupları arasında karşılaştırılmıştır. F1 neslinden elde edilen ergin bireyler ise etken madde içermeyen besiyerlerine aktarılarak F2 nesli elde edilmiş ve gözlemler F2 neslinde de kaydedilmiştir. Diğer yandan larvalara madde uygulaması yapılması için erkek ve dişi bireyler çaprazlanarak aynı yaşta larvalar elde edilmiştir. Gelişen aynı evredeki larvalara test maddesi uygulanarak pupalaşmayan larva, ergin hale geçemeyen pupa ve gelişimini tamamlamayan bireyler sayılıp not edilmiştir. Ergin bireylerin stereo mikroskop altında fenotipleri incelenerek not edilmiş ve şişeden uzaklaştırılmıştır. Larva hareketinin ölçümü için %2'lik agarla kaplanmış petriler kullanılmıştır. Petrinin ortasına konulan bir adet larvanın bir dakika süresince kat ettiği mesafe milimetrik kağıt ile ölçülmüştür. Her konsantrasyonda 30 larva hareketine bakılmıştır. Test maddesinin negatif jeotaksis üzerine etkisine bakmak için dikey boş bir cam şişeye 20 sinek aktarılmıştır. Şişe, kağıt destesinin üzerine vurularak sineklerin şişenin tabanına inmesi sağlanmıştır. Daha sonra 10 saniyede 10 cm yüksekliği geçen bireyler kaydedilmiştir. Pupa pozisyon ölçümü üzerine etkisi için ise larvaların besin yüzeyinden pupa bölgesine kadar kat ettiği mesafe ölçülmüştür. Bunların yanında, ergin sineklerin, stereo mikroskop altında, morfolojileri incelenmiş ve gözlenen anomaliler F1 ve F2 nesli için not edilmiştir. Bu çalışmada ayrıca, loratadin etken maddesinin eşey oranına etkisi de incelenmiştir. LOR içeren besiyerlerinde gelişen sineklerde çeşitli morfolojik anormallikler gözlenmiştir. Bunlar kıvrık kanatlılık, püskül kanatlılık, mızrak kanatlılık ile birlikte kanat körelmesi şeklindeki fenotipik bozukluklardır. F1 ve F2 nesli incelendiğinde 50 µg/mL ve 100 µg/mL dozlarında normal birey sayısında istatistiksel olarak anlamlı azalma bulunmuştur. Larvadan pupaya geçiş oranları incelendiğinde kontrol grubu ve 25 µg/mL doz uygulanan larvaların %100'ünün pupa oluşturabildiği, 50 µg/mL uygulanan larvaların %94'ünün pupa oluşturabildiği, 100 µg/mL doz uygulanan larvaların ise %86'sının pupa oluşturabildiği gözlemlenmiştir. 50 µg/mL ve 100 µg/mL doz uygulanan larvaların diğer gruplara göre pupa başarısının azaldığı gözlemlense de, bu azalma anlamlı bulunmamıştır. Pupadan ergine geçiş oranları incelendiğinde, kontrol grubuna kıyasla deney gruplarının ergin sayılarında azalma olduğu gözlemlenmiştir. Yine bu farklılık anlamlı bulunmamıştır. Larva hareketi ölçümü incelendiğinde 25 µg/mL ve 50 µg/mL dozlarında LOR uygulaması kontrol grubuna kıyasla larva hareketinde yavaşlama olsa da istatistiksel olarak anlamlı bir azalmaya neden olmamıştır. 100 µg/mL doz LOR uygulaması ise kontrol grubuna kıyasla anlamlı bir azalmaya neden olmuştur. Literatürde, farklı canlı gruplarında, antihistaminik ilaç etken maddelerinin davranış üzerine etkisinin olup olmadığının araştırıldığı birkaç davranışsal toksisite çalışması yer almaktadır. Bu çalışmalarda bizim araştırmamızdakilerden farklı sonuçlar elde edenler olduğu gibi benzer sonuçlar elde edenler de vardır. Yanai ve arkadaşları (1999), genç erkek gönüllülerde histamin H1 reseptör doluluğu ve antihistaminik uygulamasından sonra doksepin ( H1 antagonisti) incelenmiştir. Aynı zamanda H1 reseptörü nakavt edilmiş farelerin davranışları gözlemlenmiştir. Bu çalışma sonucunda farelerde antihistaminiklerin ciddi bir etki göstermediği ancak insanlarda birincil nesil antihistaminiklerin önerilen dozlarda alınmasından sonra bilişsel performansın bozulduğunu açıklamışlardır. Bizim çalışmamızda özellikle hareketlerdeki yavaşlama genotoksik etkinin yanında sedasyon etkiden dolayı da olabilir. Zhdanov ve arkadaşları (2023), birinci nesil antihistaminik ilaç olan kloropiramin ve ikincil nesil ilaç olan loratadin ve setirizinin yetişkin zebra balığı davranışı üzerine etkilerini incelemişlerdir. Üç ilaç da zebra balığı lokomotor aktivitesini önemli ölçüde değiştirmiş, kat edilen mesafeyi ve ortalama hızı arttığını belirtmişlerdir. Bizim çalışmamızda ise bu çalışmanın aksine LOR etken maddesi Drosophila melanogaster'in özellikle yüksek dozlarda kat edilen mesafeyi ve ortalama hızını azaltmıştır. MgO ile yapılan çalışmada bizim çalışmamızın sonuçlarına benzer şekilde magnezyum oksitin yüksek dozlarında (10 mM) larvaların daha çok besin yüzeyine yakın yerlerde pupa oluşturduklarını tespit etmişlerdir. Bu etkinin nedeni olarak magnezyum oksitin D. melanogaster enerji metabolizmasına negatif etkisi olduğunu açıklamışlardır. Bizim çalışmamızda da besin yüzeyine yakın yerlere pupa oluşturan larvaların enerji metabolizmasının yavaşlamasından dolayı olabilir. Loratadin etken maddesinin, uygulanan dozlar dikkate alındığında, belirli dozlarda (50 ve 100 µg/mL) Drosophila melanogaster'in gelişimini olumsuz yönde etkilediği gözlemlenmiştir. Sonuçlar incelendiğinde F1 neslinde metamorfoz sürecindeki gecikme 50 ve 100 µg/mL'lik dozlarda 3. instar, 2. evreden itibaren gözlenmeye başlarken 25 µg/mL dozda sadece ergin forma geçiş sürecinde gözlenmiştir. F2 neslinde ise sadece 50 ve 100 µg/mL'lik dozlarda ve ergin forma geçiş sürecinde değişiklik görülmektedir. Metamorfoz sürecindeki bu gecikmeler nedeniyle, LOR'in gelişimsel genler ya da bu genlerin işleyişi üzerindeki birtakım etkileri nedeni ile gelişimlerini olumsuz yönde etkilemiş olabileceği düşünülmektedir. F2 neslindeki etkinin F1 nesline göre daha az olmasının nedeni, deney sürecinde, LOR etken maddesine ebeveynlerin maruz kalması ve bu nedenle F1 neslinin bu etkene daha fazla muruz kalması, F2 neslinin doğrudan etken madde ile maruziyet yaşamaması gösterilebilir. Benzer bir yöntemle yapılan çalışmada asetil salisilik asit ve asetaldehitin Drosophila melanogaster'in F2 neslinde F1'e göre metamorfoz sürecinde gecikmenin daha az olduğunu açıklamışlardır. Bunun nedeni olarak asetilsalisilik asitin toksik etkisi F2 neslinde devam etmediğini belirtmişlerdir. Aynı zamanda sadece asetaldehit uygulanan bireylerin F2 neslinde de metamorfoz süresinin geciktiğini tespit etmişlerdir. Bu gecikmenin nedeni olarak asetaldahetin genlerin işleyişi üzerinde olumsuz etkiye neden olduğunu açıklamışlardır. Antidepresan ilaçlarla yapılan bir başka çalışmada sadece belirli dozlarda etki gösteren sertralin, larvaların pupaya geçiş süresini uzattığını tespit etmişlerdir. Uygulanan maddenin larva gövdesi içinde yer alan imajinal diskleri olumsuz etkileyerek çeşitli morfolojik ve fizyolojik bozukluğa neden olmasından dolayı bu geçişi uzattığını açıklamışlardır. Aynı zamanda çeşitli antidepresan etken madde uygulamaları D. melanogaster'de serotonin hormonu üretimini uyarmış olabileceğini, bunun sonucunda gelişimsel gecikmeye neden olabileceğini açıklamışlardır. Bizim çalışmamızda da gözlenen gecikme benzer nedenlerden dolayı olabilir. Drosophila melanogaster üzerinde yapılan başka bir çalışma sonucunda, nanopartikül olan magnezyum oksit (MgO)'in pupa oluşturma ve pupadan çıkış başarısında azalmaya yol açarak olumsuz etkilere neden olduğunu açıklamışlardır. Bu çalışmaya benzer şekilde bizim çalışmamızda da LOR etken maddesinin, 50 µg/mL ve 100 µg/mL dozlarında pupa oluşturmada ve bütün dozlarda pupa çıkış başarısında azalmaya yol açtığı görülmüştür. Ancak bu azalma istatistiksel olarak anlamlı değildir. Bu nedenle LOR etken maddesinin bu kriterler bakımından anlamlı bir etki yaptığı söylenemez. Aynı zamanda karsinojenite ve genotoksisite üzerine de yapılmış bir çalışma bulunmamaktadır. Ancak ilaç piyasaya sürülürken elde edilen raporlar incelendiğinde ratlarda, farelerde ve insan periferal lenfositlerinde negatif sonuç verdiği belirtilmiştir. İncelenen başka raporlarda fare ve ratlarda karaciğer tümörlerinde yapılan uzun dönem karsinojenite çalışmalarında ilaç etken maddesinin karsinojenik etkisinin olduğu sonucuna varılmıştır. Bizim çalışmamızda da LOR'in belirli dozlarda, Drosophila melanogaster gelişimini olumsuz yönde etkilediği sonucuna varılmıştır. Diğer yandan, kanat yapılarında morfolojik anormalliklere neden olduğu için LOR'in Drosophila melanogaster üzerinde, aynı zamanda, genotoksik etkisinin olabileceği de değerlendirilmektedir. İki sülfonamid bileşiğinin Drosophila melanogaster üzerinde teratojenik değerlendirilmesi yapılmıştır. Yapılan bu çalışmada bizim çalışmamızın sonuçlarına benzer şekilde madde içeren besiyerinde gelişen bireylerde kıvrık kanatlılık, mızrak kanatlılık anormallikleri tespit etmişlerdir. Bunun nedeni olarak öncelikle iki sülfonamid bileşiği içeren besiyerinde gelişimini tamamlayan bireylerin uygulanan doz azaldıkça birey sayısında azalma meydana geldiği ve bu bileşiğin birey gelişimine olumsuz etki ettiğini açıklamışlardır. Bu olumsuz etki kanat yapısında fenotipik anormallik oranına da yansımıştır. Bizim çalışmamızda da gözlenen anormallikler bireyin normal gelişimine olumsuz etki ettiği için kanat yapısında değişiklik meydana getirmesinden dolayı olabilir. Sonuç olarak; bu çalışmada kullanılan loratadin etken maddesinin, özellikle uygulamada kullanılan yüksek dozlarının, Drosophila melanogaster gelişimi ve davranışı üzerine olumsuz etkilerinin olduğu söylenebilir. LOR etken maddesinin Drosophila melanogaster üzerine etkisinin olup olmadığına dair literatürde herhangi bir çalışma bulunmamaktadır. Bu çalışma, loratadinin Drosophila melanogaster üzerine canlı gelişimi ve davranışları üzerine yapılmış ilk çalışma olması nedeniyle, ileride yapılacak olan diğer çalışmalara kaynak oluşturma niteliğindedir. Ancak loratadin ve benzeri antihistaminik ilaç etken maddelerinin canlılar üzerine toksik ve davranışsal etkilerinin tam olarak ortaya çıkarılması için başka model organizmalar başta olmak üzere değişik hücre hatları ve canlı grupları ile ve de farklı metodlar ile daha fazla çalışmaların yapılması gerekmektedir.