Insan granüloza hücrelerinde FSH reseptörünün ekspresyonunu arttırmak için CRISPR /DCAS-9 sistemlerinin uygulanmasi

FSH, ovaryumda folikülogenezin desteklenmesi ve steroid hormonlarının üretimi için gereklidir. FSH'nın eksikliğinde foliküler gelişim durur. Granüloza hücrelerinde FSH' dan bağımsız büyümeden FSH' ya bağımlı büyümeye geçiş FSH reseptörünün (FSHR) bu hücrelerdeki anlatımına bağlıdır. CRISPR aktivasyonu, endonükleaz görevi bulunmayan bir CRISPR protein varyantı olan dCas9' un DNA'yı değiştirmeden genlere bağlanma yeteneğine dayanır. CRISPR aktivasyon (CRISPRa) sistemleri DNA' ya bağlanır ve gen anlatımını geliştirmek için transkripsiyon faktörlerini kullanır. CRISPRa stratejileri, füzyon proteinleri ve Cas sisteminin yeniden mühendisliği dahil olmak üzere çeşitli transkripsiyonel aktivatörleri kullanır. SunTag, SAM ve VPR' nin tümü, ilk dCas9- VP64 tekniğine göre önemli gelişmeler göstermiştir; bu nedenle, çeşitli hücrelerdeki genleri aktive ederken seçilebilecek birkaç seçenek vardır. Araştırmamızın ana hedefi, insan granüloza hücre hattında (HGRC) FSH reseptörünin anlatımını artırmak için CRISPR dcas9 teknolojisinin kullanılıp kullanılamayacağını belirlemek ve bu uygulamanın hücre içi yolaklardaki olası etkilerini incelemektir. dCas9 sisteminin FSHR' yi aktive edebildiğini ve artan FSH reseptör aktivitesinin steroidojenik, yaşamı sürdürme ve ölüm sinyalizasyonunda yer alan birkaç alt yolu etkilediği sonucuna ulaşılmıştır. İnsan granüloza hücrelerinde FSHR' yi etkinleştirmek için dcas9 sistemini kullandıktan sonra, FSHR, AKT, aromataz, MAPK8, MAPK1, ESR1, MTOR, p53, kaspaz 3' ün gen anlatımını önemli ölçüde arttığını gösterdik. vii FSHR ile ilgili proteinler incelendiğinde FSHR, AKT, aromataz ve p-38 MAPK' da protein seviyesinin yükseldiği de gözlendi. dcas9 ile aktive edilen FSHR' nin işlevselliği, follitropin alfa (Gonal-f) tedavisi kullanılarak test edildi. FSHR, AKT, aromataz, MAPK8, p53 ve kaspaz 3' ün gen anlatım seviyesinin bütün zamanlara bağlı olarak artması gösterilmişken, ESR1 ve MTOR' un gen anlatımının geçici olarak arttığı gösterilmiştir. Araştırmamızda, dcas9 teknolojisinin gen ve protein seviyelerinde FSHR' yi etkili bir şekilde artırmak için kullanılabileceği ortaya konmuştur. Genom düzenleme teknikleri kullanılarak arttırılmış FSH reseptörü, in-vitro oosit maturasyonunda, kadınlarda sık görülen FSH duyarlılığı sorunlarının araştırılmasında özellikle, polikistik over sendromu (PCOS), overin aşırı ve yetersiz duyarlılığı, kanser hastalarındaki çalışmalarda yardımcı olabilir. Anahtar Kelimeler: Folikül, FSHR, Granüloza Hücresi, CRISPR/dcas9