Aspergillus niger a-amilaz enziminin pichia pastoris'te rekombinant üretimi

Amilaz enzimi nişastanın parçalanmasını kataliz eder. a-amilaz enzimleri α-1,4 glikozidik bağı üzerine etki ederler. Gıda endüstrisinde fırıncılık ve meyve suyu üretimi başta olmak üzere, deterjan, tekstil ve kağıt endüstrisi gibi alanlarda amilazların kullanımı oldukça yaygındır. Endüstriyel alanda bu kadar çok kullanımı olan enzimlerin rekombinant üretimi son yıllarda çok çalışılan bir konu olmuştur. Pichia pastoris (P. pastoris) metilotrofik bir maya olup, rekombinant protein üretiminde başarılı bir şekilde kullanılan bir ekspresyon sistemidir. İndüklenebilen promotorlarının olması, ökaryotik proteinler için gerekli olan post-translasyonel modifikasyonları yapabilmesi, çok ucuz üreme ortamlarında gelişebilmesi ve çok yüksek hücre yoğunluklarına çıkabilmesi P. pastoris'in avantajları olarak sayılabilir. Bu çalışmada, Aspergillus niger (A. niger) a-amilaz enziminin üretimi ilk kez P. pastoris'te etanol ile indüklenebilen SNT5 promotoru kontrolü altında yapılmıştır. Bu amaçla kodon optimize şekilde temin edilen A. niger a-amilaz geni P. pastoris MK115-PDI suşuna transforme edilmiştir. Zeosin antibiyotiği içeren plakalardan seçilen tranformant Pichia hücreleriyle engelli erlenlerde 28 ˚C sıcaklık, pH 6.0 ve 225 rpm karıştırma hızında protein ekspresyonu yapılmıştır. Yapılan SDS-PAGE analizi sonucunda 58kDa büyüklüğünde a-amilaz enzimini ürettiği tespit edilen klon ile optimum protein üretim koşulları belirlenmiştir. Bu amaçla engelli erlenlerde farklı sıcaklık (20, 24 ve 28 ˚C) ve farklı pH (3, 4, 5, 6 ve 7) koşullarında protein üretimi yapılmış ve alınan örnekler analiz edilmiştir. 24 ˚C sıcaklık pH 6 ve pH 7'de yapılan üretimlerde sırasıyla 3349 U/mL ve 4519 U/mL enzim aktivitesi elde edilmiştir. a-amilaz enzimi üretimi 5L biyoreaktörde iki aşamalı fermantasyon stratejisi ile gerçekleştirilmiştir. Fermantasyon 24 ˚C sıcaklık, pH 6 ve çözünmüş oksijen seviyesi %20'de sabit tutularak 107 saat sürdürülmüştür. Fermantasyon sonunda en yüksek 65. saatte 2223 mg/L protein üretilmiş ve 44062 U/mL enzim aktivitesi hesaplanmıştır. Üretilen enzim karakterize edilmiş ve optimum çalışma sıcaklığı 60 ˚C ve pH'sı 7 olarak belirlenmiştir. Bu tez çalışması sonucunda, A. niger a-amilaz enziminin P. pastoris MK115-PDI suşunda etanol ile indüklenebilen SNT5 promotoru kontrolünde üretimi yapılmış ve endüstriyel boyutta üretimi için veriler elde edilmiştir.