Bacillus sp. kaynaklı pullulanaz enzimini kodlayan genin klonlanması ve ekspresyonu üzerine çalışmalar

Bu çalışmada Bacillus sp. kaynaklı pullulanaz geninin izole edilmesi ve Pichia pastoris'te pullulanaz enziminin rekombinant üretimi üzerine çalışılmıştır. Gen kaynağı olarak, daha önce tamamlanmış bir çalışma ile sünmüş ekmekten izole edilmiş olan Bacillus suşları taranmıştır. Pullulanaz geni, moleküler biyoloji yöntemleri kullanılarak B. subtilis BK07 izolatında bulunmuştur ve izole edilmiştir. Elde edilen genin C-ucuna PZR yolu ile çoklu histidin etiketi eklenmiştir. Histidin etiketli gen, pPICZ?A vektörüne bağlanmış ve P. pastoris KM71H suşuna aktarılmıştır. Ardından metanol indüksiyonlu protein üretimi gerçekleştirilmiştir. Çalışmada B. subtilis PY22 suşu pozitif kontrol olarak kullanılmış ve analizler bu suş için de eş zamanlı olarak gerçekleştirilmiştir.P. pastoris'te üretilen BK07 ve PY22 pullulanaz enzimlerinin optimum çalıştığı koşullar, sırası ile pH8-40°C ve pH6-40° olarak saptanmıştır. BK07 pullulanaz aktivitesi 8,46 U/ml, PY22 pullulanaz aktivitesi 2,95 U/ml olarak tespit edilmiştir. Spesifik enzim aktiviteleri ise sırası ile 144 U/mg ve 51 U/mg olarak saptanmıştır. SDS-PAGE ve Western blot analizleri BK07 pullulanazının moleküler ağırlığının yaklaşık 81 kDa, PY22 pullulanazının ise yaklaşık 90 kDa olduğunu göstermiştir.ANAHTAR KELİMELER: Pullulanaz, Pichia pastoris, Bacillus sp., Rekombinant protein üretimi