Bacillus subtilis M33'den hücre dışı alkali proteaz enziminin saflaştırılması ve karakterizasyonu

Alkali proteazlar, endüstrinin hemen her alanında kullanılmakta ve çok çeşitli kaynaklardan farklı metotlarla saflaştırılması gerçekleştirilmektedir. Bu çalışmada, topraktan izole edilen yeni bir B.subtilis M33'den hücre dışı alkali proteaz üretimi 37°C'de, 180 rpm çalkalama hızında 24-26 saat süresince gerçekleştirildi. Proteaz enzimi, %35-80 amonyum sülfat çöktürmesi ve DEAE selüloz anyon değişim kromatografisiyle %38,66 verimle ham homojenata göre 15,50 kat saflaştırıldı. Saflaştırılan enzimin molekül kütlesi sodyum dodesilsülfat poliakrilamit jel elektroforezi (SDS PAGE) ve jel filtrasyon kromatografisi ile yaklaşık 39 kDa olarak tayin edildi. Saflaştırılan proteaz enziminin optimum pH ve sıcaklığı sırasıyla 10,0 ve 55°C olarak bulundu. Enzimin 1 hafta boyunca pH 8,0-11,0 aralığında kararlılığını koruduğu görüldü. Enzimin fenilmetilsülfonilflorür gibi spesifik proteaz inhibitörüyle tamamen inhibe olduğu, etilen diamin tetra asetik asit inhibitöründen etkilenmediği, 2-merkapto etanol ve ditiyoteritol varlığında aktivitesinin arttığı dolayısıyla tiyol bağımlı serin proteaz olduğu belirlendi. Proteaz enziminin Mn2+, Mg2+ gibi metal iyonlarıyla aktive olduğu, Fe3+ ile aktivitesini kısmen kaybettiği görüldü. Enzimin oksidantlar (H2O2), yüzey aktif maddeleri (SDS, Triton X-100, Tween-80) ile ve ayrıca dimetil sulfoksit , etanol, aseton, benzen, n-Butanol, heptan, oktanol, toluen, metanol, asetonitril, 2-propanol gibi organik çözücülerle kararlılığını koruduğu tespit edildi. Enzimin çeşitli endüstriyel deterjanlar varlığında da aktivitesi incelendi. Proteaz enziminin, kazein, sığır serum albumini, ovalbumin gibi doğal substratlara olan spesifitesi incelendi. Saflaştırılan enzimin Km ve Vmak kinetik parametreleri kazein substratı kullanılarak sırasıyla 0,706 mg/ml, 3000 µM.min-1 bulundu.