Bacillus suşlarından elde edilen proteazlarla biyoaktif peptitlerin üretimi ve bazı özelliklerinin araştırılması

Bu çalışmada bitkisel proteinlerden enzimatik hidroliz ile biyoaktif peptit (BAP) üretimi gerçekleştirilmiştir. Çalışmanın ilk bölümünde, altı farklı bitkisel ürünün [siyez unu, kuru fasulye unu, sarı mercimek unu, karabuğday, beyaz kinoa ve Galya kavunu (çekirdek kısmı)] biyoaktif özellikte hidrolizat üretiminde protein öncülü olarak kullanım potansiyeli belirlenmiştir. Bitkisel protein izolatları alkali solvent yöntemi ile ekstrakte edilmiş ve dört farklı ticari proteaz (Alcalase, Flavourzyme, Neutrase, rTrypsin) ile uygun proteolitik tepkime koşullarında (50 °C, pH 7) hidroliz edilmiştir (%5 E/S h/h, 2 sa). Protein hidrolizatlarının antioksidan aktivitesi DPPH giderimi ile belirlenmiştir. İzolatların protein içeriği %24,7 (karabuğday) ve %76,7 (sarı mercimek), ekstraksiyon verimi %3,6 (karabuğday) ve %36,2 (sarı mercimek) arasında belirlenmiştir. Alcalase ve Flavourzyme ile daha fazla DPPH giderimi elde edilmiş, altı farklı bitkisel protein kaynağı arasında siyez protein hidrolizatları en yüksek aktiviteyi sergilemiştir (%30-73). Buna göre çalışmanın devamında BAP üretimi için siyez unu protein kaynağı olarak seçilmiştir. Siyez proteinlerinin ektraksiyon verimini arttırmak amacıyla pH (8-10) ve katı madde/çözgen oranının (%10-30 a/h) etkisi incelenmiştir. Buna göre pH 10 ve %10 koşulları optimum olarak belirlenmiştir (ekstraksiyon verimi: ~%23). Ayrıca, bakteriyel ham proteaz ile BAP üretilmiştir. Proteaz üretici bakteri izolatının seçilmesi için mikroorganizma tarama çalışması gerçekleştirilerek izolatların proteaz üretim yeteneği incelenmiştir. Bunun için sekiz farklı Bacillus suşunun süt tozu içeren katı besiyerinde proteolitik aktivitesi değerlendirilmiştir. Bacillus sp. EBTA7 suşundan elde edilen ham proteazın proteolitik aktivitesi en yüksek olmuştur. Seçilen bu suş için proteaz aktivitesi koşulları optimize edilmiş ve bunun için farklı pH (7-11) ve sıcaklık (50-80 °C) değerlerinde aktivite gerçekleştirilmiştir. Buna göre 60 °C ve pH 9 optimum aktivite koşulları olarak seçilmiştir (2056 U/mL). Seçilen Bacillus sp. suşu moleküler tanımlama sonucunda Bacillus mojavensis ile %99,86 oranında benzerlik göstermiştir. Çalışmanın devamında siyez unu ticari proteazlar (Alcalase, Flavourzyme, Neutrase, rTrypsin) ve Bacillus mojavensis sp. EBTA7 ham proteazı ile hidroliz edilmiştir. Hidroliz tüm proteazlar için iki farklı E/S oranında (h/a) gerçekleştirilmiştir (ticari proteazlar: %0,25 ve 1; ham proteaz: %50 ve 100). Hidroliz derecesi (HD) %6,0-35,6 arasında belirlenmiş, ham enzim için E/S oranındaki artışın HD'yi iyileştirdiği tespit edilmiştir. Proteinlerin SDS-PAGE profili genel olarak hidroliz derecesi bulgularıyla örtüşmüştür. Hidrolizatların biyoaktivitesi serbest radikallerin (DPPH ve ABTS) giderimi, demir (II) iyonu şelatlama aktivitesi ve toplam fenolik madde (TFM) içeriğinin incelenmesi ile değerlendirilmiştir. Hidrolizatların DPPH giderimi 17,7 ile 33,0 μmol troloks eş değeri (TE)/g, ABTS giderimi 107-190 μmol TE/g arasındadır. Demir şelatlama aktivitesi 0,09-3,08 mg EDTA/g, TFM miktarı 6,94-14,98 mg gallik asit eş değeri/g arasındadır. Ayrıca, hidrolizatların bazı teknofonksiyonel özellikleri incelenmiş, bunun için emülsiyon aktivite indeksi (EAİ), emülsiyon stabilite indeksi (ESİ), yağ tutma kapasitesi (YTK) ve köpürme özellikleri belirlenmiştir. Buna göre EAİ 28-61 m2/g, ESİ 11-227 dk, YTK 0,70-2,94 g/g, köpük genleşmesi %27-84 ve köpük stabilitesi %22-94 arasındadır. FTIR spektroskopisi ticari proteaz hidrolizatlarının ikincil yapısının ağırlıklı olarak β-plaka, ham proteaz hidrolizatlarının α-heliks olduğuna işaret etmiştir. Hidrolizatların zeta potansiyeli dağılımı -20,0 mV ile -3,19 mV arasında olup ham proteaz hidrolizatlarının zeta potansiyeli en yüksektir (-20 mV). Tüm hidrolizatların yüksek antioksidan kapasitede olduğu belirlenmiş, bununla birlikte Bacillus mojavensis sp. EBTA7 hidrolizatları çok daha yüksek YTK, emülsiyon ve köpük stabilitesi sergilemiştir. Çalışmanın son bölümünde, siyez protein izolatı (SPİ) ve ham proteaz ilk bölümde tespit edilen optimum üretim koşullarında ve yüksek kapasitede üretilmiştir. BAP üretimi ham proteaz ile gerçekleştirilmiş, substrat olarak SPİ (%67 protein) protein içeriği %5 olacak şekilde tampon çözeltide hazırlanmıştır (100 mM, pH 9). Hidroliz öncesi liyofilize ham proteaz 2056 U/mL aktivite değerine ayarlanmış ve hidroliz üç farklı E/S oranında (%30, 40 ve 50) gerçekleştirilmiştir (60 °C, 5 sa). Hidrolitik tepkime ortamı santrifüj edilerek sıvı üst faz toplanmış ve liyofilize edilmiş, ardından kurutulmuş hidrolizatların HD değeri belirlenmiştir. Buna göre %50 E/S ile istenilen HD değeri elde edilmiş (%19,9) ve çalışmanın devamında hidroliz bu oranda gerçekleştirilerek siyez protein hidrolizatı (SPH) aynı şekilde elde edilmiştir. Hidrolizat, farklı gözenek çapındaki (10 kDa, 5 kDa, 1 kDa) membranların kullanıldığı ultrafiltrasyon sisteminden geçirilerek moleküler ağırlığına (MA) göre ayrılmış ve ≤ 1 kDa, 1-5 kDa, 5-10 kDa ve > 10 kDa olmak üzere dört peptit fraksiyonu elde edilmiştir. MA fraksiyonlarının antioksidan ve antidiyabetik özellikleri in vitro spektrofotometrik analizler ile belirlenmiş ve %50 inhibe edici konsantrasyon (IC50) hesaplanmıştır. Ayrıca, fraksiyonların teknofonksiyonel özellikleri belirlenmiştir. Yüzey hidrofobisitesi (H0) ve amino asit kompozisyonu ile birincil yapı özellikleri, FTIR ve zeta potansiyeli ile ikincil yapı özellikleri ortaya konmuştur. Son olarak, MA > 10 kDa fraksiyonu hidrofobik etkileşim kromatografisi (HEK) ileri saflaştırılmıştır. Ultrafiltrasyon (UF) ile elde edilen peptit fraksiyonlarının protein içeriği %43,4-81,7 arasındadır. IC50 değerleri DPPH giderimi için 15,0-88,3 mg/mL, ABTS için 3,9-4,5 mg/mL ve demir (II) şelatlama için 0,17-0,34 mg/mL arasında belirlenmiştir. DPPH gideriminde peptit MA'sı ile aktivite arasında pozitif bir korelasyon tespit edilmiş, MA > 10 kDa ile en yüksek aktivite elde edilmiştir. ABTS giderimi için UF uygulamasının aktivite üzerinde anlamlı bir etki yaratmadığı gözlenmiştir. Demir (II) şelatlama kapasitesinin küçük boyutlu peptit fraksiyonları için (≤ 1 kDa ve 1-5 kDa) daha yüksek olduğu tespit edilmiştir. Demir iyonu indirgeyici antioksidan güç peptit konsantrasyonuna bağlı lineer olarak artmış ve hidroliz sonucunda zayıflamış, UF uygulaması ile (> 10 kDa için) önemli ölçüde iyileşmiştir. Hidroliz işlemi proteinlerin TFM içeriğini zenginleştirmiştir. Bununla birlikte TFM tüm fraksiyonlar için benzer düzeyde tespit edilmiştir. Fraksiyonların antidiyabetik özelliği α-amilaz inhibitör aktivitesi ile incelenmiş ve dikkate değer bir inhibitör aktiviteye rastlanmamıştır. Fraksiyonlar için EAİ 5,3-29,3 m2/g, ESİ 15,2-27,0 dk, YTK 0,32-9,21 g/g, köpük genleşmesi %11-77 ve köpük stabilitesi %1-87 aralığında tespit edilmiştir. MA > 10 kDa fraksiyonu EAİ, YTK ve köpürme genleşmesi ve stabilitesi açısından en iyi fraksiyon olarak belirlenmiştir. MA > 10 kDA için H0 değeri diğer fraksiyonlara kıyasla oldukça yüksek olup, bu durum amino asit kompozisyonun belirlenmesi sonucu bu fraksiyonun zengin hidrofobik amino asit içeriği ile doğrulanmıştır. FTIR spektrumu ile ikincil yapısı α-heliks belirlenen siyez proteinlerinin hidroliz sonrası bu yapısının korunduğu gözlenmiştir. UF ile elde edilen MA fraksiyonlarının ikincil yapısı ise > 5 kDa için ağırlıklı olarak α-heliks, < 5 kDa için β-plaka olarak belirlenmiştir. Peptit fraksiyonlarının zeta potansiyeli -14,1 ile -27,7 mV arasında tespit edilmiştir. Toplam amino asit kompozisyonunun belirlenmesiyle hidroliz ve UF uygulaması sonrası hidrofilik ve hidrofobik amino asitlerin sayısının arttığı ve daha çok hidrofilik özellikteki amino asitlerin açığa çıktığı gözlenmiştir. Asp, Glu, Ser, Gly, Tyr, Trp, Leu ve Lys miktarı MA > 10 kDa fraksiyonunda yüksek tespit edilmiş ve bu fraksiyonun Met hariç bütün esansiyel amino asitleri içerdiği belirlenmiştir. MA > 10 kDa fraksiyonunun HEK ile saflaştırılması sonucunda iki farklı hidrofobik karakterde ileri fraksiyon elde edilmiştir. İleri fraksiyonların kütle spektrometresi analizi sonucu içeriğinde yüksek molekül ağırlıklı glütenin (88 kDa) proteinlerine rastlanmıştır. Özetle, çalışmanın ikinci bölümünde laboratuvar ortamında üretilen ham proteazın enzimatik hidroliz ile BAP üretiminde kullanılabilirliği gösterilmiş, elde edilen peptit fraksiyonlarının genel olarak gelişmiş antioksidan özellikte olduğu belirlenmiştir. Ayrıca, ultrasiltrasyon işleminin peptit antioksidan ve fonksiyonel özelliklerini iyileştirdiği tespit edilmiştir. Sonuç olarak, çeşitli bitkisel proteinlerden BAP üretiminin gerçekleştirildiği bu çalışmada siyez proteinlerinin enzimatik hidroliz ile biyoaktif ve teknofonksiyonel özelliklerinin yüksek ölçüde iyileştirildiği belirlenmiştir.