The ubiquitin/proteasome system related role of Bag-1L in breast cancer

Meme kanseri dünya çapında önemli bir sağlık sorunudur. Gelişmiş ülkelerde bile halen kanserden ölümlere neden olan en önemli kanser tiplerinden birisidir. Meme kanserinin özellikle kadınlarda görülme sıklığının artması ve tedaviye yönelik yeni yaklaşımlara olan ihtiyaç artmakta ve bu alandaki araştırmalar hız kazanmaktadır. İnsan hücrelerinde, tek bir mRNA'dan alternatif translasyonla üç fonksiyonel BAG-1 izoformları ifade edilir. Hücrede lokalizasyonları değişen üç BAG-1 izoformlarının, BAG-1S (33 kDa), BAG-M (46 kDa) ve BAG-1L (52 kDa), farklı N-terminalleri mevcuttur. BAG-1L izoformu nükleer lokalizasyon sinyaline sahiptir ve büyük oranda nükleer bir proteindir. Nükleer lokalizasyon sinyalinin bir kısmı BAG1M'nin N-terminalinde bulunur, bu yüzden BAG-1M da nükleusa göç edebilir. Nükleer lokalizasyon sinyalinin çok az kısmını içeren BAG-1S nükleusta bulunmamaktadır fakat bazı koşullar altında bu sinyalin rol oynayabileceği bildirilmiştir. Aynı mRNA üzerinde BAG-1L ve BAG-1M izoformlarının ifadesi uç CUG ve AUG kodonlarıyla başlar, oysa BAG-1S ifadesi bir iç AUG kodonuyla başlar. BAG-1 izoformlarıyla, hücrenin hayatta kalması için sinyal iletiminde hubları oluşturan aday bir proteindir. Tümör hücrelerinde BAG-1L'nin nispeten yüksek ifade seviyeleri gözlemlendiği bildirilmiştir. Hücrenin hayatta kalmasında önemli bir protein olan BAG-1, başta meme kanseri olmak üzere birçok kanser çeşidinde ifade düzeylerinin arttığı gözlenmiştir. Bu yüzden dolayı kanser oluşmasında ve gelişmesinde incelenmesi gereken bir proteindir. Adoptör işlevine sahip BAG-1, bir anti-apoptotik proteindir. Hsp70/Hsc70 şaperonları, proteazom sistemi, Bcl-2 proteini, Raf-1 kinaz, nükleer hormon reseptörleri ve DNA gibi çeşitli moleküler hedeflerle etkileşime girebilir. Bu yüzden, çok çeşitli hücresel süreçlerin düzenlenmesinde yer almaktadır. HSP70/HSP90 hücrede bolca eksprese edilen ve hücre içindeki proteinlerin doğru katlanmasında ve işlevlerini kazanmarında önemli rol oynayan moleküler şaperonlardır. HSP90, HSP-aracılı anormal proteinlerin proteazomal degradasyonunda görevli olduğu bir çok yayında gösterilmiştir. Protein katlanma süreci endoplazmik retikulumda gerçekleşir. Bu sürece ER'de bulunan ısı şoku proteinleri, lektin proteinleri, disülfit izomerazlar katılır. Protein katlanmasında proteinin stabilitesini arttıran N-glikozilasyon gerçekleşir. N-bağlı glikanlar, proteinin çözünürlüğünü arttırır ve protein katlama yollarını doğrudan etkiler. α-glukosidaz I ve α-glukosidaz II enzimleri, katlanan proteinin N-terminalinde bulunan iki glikozu uzaklaştırır. Calnexin (ER membrana bağlı) ve Calreticulin (ER lümeninde) lektin şaperonlarıdır ve protein katlanmasını destekler. ER'deki lektin şaperonları ve BiP şaperonu arasında bir bağlantı vardır. BiP, hidrofilik N-glikanların eklenmesinden önce, yeni sentezlenen proteinin hidrofobik uzantısıyla etkileşir. BiP, N-terminal yakınındaki glikan içeren glikoproteinlerin olgunlaşmasında daha az rol oynaması olasıdır, çünkü bunlar hidrofiliktir, böylece BiP'nin bağlanması önlenir ve lektin şaperonlarının bağlanması teşvik edilir. Lektin şaperonları son glikana bağlanır ve sonra katlama işlemini kontrol ederler. Buna ek olarak, lektin şaperonları oksidoredüktaz ERp57 (PDI) ile kovalent olmayan şekilde etkileşir, böylece substrat üzerinde disülfid bağlarının oluşmasını ve izomerizasyonunu tetikleyebilir. PDI, disülfid izomeraz protein ailesinin bir üyesidir ve ER lümeninde bulunur. Disülfid bağının oluşumu nedeniyle proteinlerin konformasyonel esnekliği sınırlar ve proteinlerin yapısal sertliğini arttırır. ER'deki kalite kontrol mekanizmasına rağmen, protein katlanması yetersiz olduğunda ve protein düzgün bir şekilde katlanamadığında, anormal proteinler ER'de akümüle olur. Bu nedenle, katlanamamış protein cevabı (UPR) yolağının aktivasyonu gerçekleşir. UPR sisteminin bir parçası olan ERAD yolağıyla anormal proteinlerin ER'den sitozole retrotranslasyonu meydana gelir. ERAD yolağı, seçilmiş anormal proteinlerin retrotranslokasyonuna ve ubikuitin bağımlı proteazomal degradasyonuna aracılık eden bir dizi süreçten oluşur. Substrat dislokasyonunu yönlendiren enerji, ubikuitin bağımlı heksamerik AAA+ ATPase VCP (p97) tarafından adenosin trifosfat (ATP) hidrolizinden elde edilir. VCP, ERAD dislokasyon komplekslerine çeşitli ERAD bileşenleri ile doğrudan etkileşirek dahil olur. ERAD substratının polubikuinitinasyonu, VCP ile ekstraksiyonu kolaylaştırılır ve proteazomal degradasyonu için bağlanma bölgesi olarak işlev görür. Ubikuitin, substrat üzerinde N-terminaldeki lizin tortularına kovalent olarak bağlanabilen 76 amino asitten oluşan küçük bir proteindir. Ubikuitin ilavesi, E1 ubikuitin-aktive edici enzimi, E2 ubikitin-konjuge enzimini ve ubikuitinin substrata nihai transferine aracılık eden E3 ubikitin ligazını içeren ardışık enzimatik reaksiyonlar yoluyla gerçekleşir. CHIP (E3 ligaz), yanlış katlanmış proteinleri şaperonlardan proteazomlara yönlendiren bir sistemin parçasıdır. İki modülatör, BAG-1 ve CHIP, sitosolik bozunma yollarında rol oynar, ve moleküler şaperonları, nativ olmayan polipeptidlerin katlanması ve parçalanması arasındaki karar sürecinin merkezine yerleştirir. BAG-1'in etkileşim partneri olan ubikuitin/proteazom sistemiyle yanlış katlanmış ya da katlanamamış proteinlerin degredasyonu gerçekleşir. Proteazom ile ilgili çalışmalarda, proteazom inhibisyonunun toksik etkilerine kanser hücrelerinin, normal hücrelere kıyasla daha hassas olduğu gösterilmiştir. Kanser hücrelerinin daha yüksek hassasiyetinin ardındaki mekanizma belirsiz olmasına rağmen, proliferasyonunu ve anti-apoptotik yolakları düzenlemek için proteazomu kullanma olasılıkları yüksektir. Ubikuitin/proteazom sistemine katılan BAG-1'in kanser tedavisinde hedef molekül olabileceği düşünülmektedir. Retrotranslokasyon sırasında, anormal proteinlerin proteazomal degradasyonu için ubikitinler proteinlerin tanınması için işaret olarak eklenir. Ubikuitinasyon degrede olacak proteinlerin proteazoma iletilmesi dahil olmak üzere birçok biyolojik süreçte etkilidir. BAG-1L izoformunun içerdiği UBL domaininden dolayı ubikuitinin katıldığı biyolojik süreçlerde BAG-1L'nin de rol oynayabileceği düşünülmektedir. Ayrıca, araştırmacılar BAG-1'in östrojen reseptörü üzerindeki etkisini araştırmış ve BAG-1L'nin östrojene bağımlı transkripsiyonu arttırdığını, ancak BAG-1M veya BAG-1S'nin transkripsiyonu artırmadığını bulmuşlardır. Araştırmacılar BAG-1L östrojen reseptörleri ile etkileşirerek reseptör aktivitelerini arttırdını belirtmiştir. Bu çalışmada, meme kanserli (MCF-7) ve epitel hücre hatlarında (MCF-12A) ve aynı zamanda meme dokularında BAG-1L ile ilişkili komplekslerin izolasyonunu içeren proteom-merkezli bir strateji benimsedik. BAG-1L ile ilişkili komplekslere katılan proteinler, C ve N-terminal TAP-etiketli BAG-1L pürifiye proteinlerden yapılan izoform-spesifik LC-MS/MS analizi ile tanımlanmıştır. BAG-1L ile ilişkili komplekslerde yer alan proteinlerin tanımlanması, meme kanserinde BAG-1L'nin adaptör rolünü kesin olarak ortaya çıkarmaktadır. Yaptığımız kanser hücre hattı immünoblotma deneyleriyle BAG-1L'nin ERAD mekanizmasındaki proteinlerle (BiP, HSP70, PDIA3, VCP, RAD23B, CANX ve CALR) kompleks oluşturduğunu ispatladık. Meme epitel hücre hattı imünoblotlama deneyleriyle ise kanser hücre hattına kıyasla farklılıklar gözlemledik. ERAD proteinlerinden HSP90 ve CHIP'in epitel hücrelerde BAG-1L ilişkili komplekste yer almadığını belirledik. Tümörlü ve normal meme dokularıyla yaptığımız immunoblotlama deneyleriyle, tümör dokularında ERAD mekanizması proteinlerinin, HSP70, RAD23, VCP ve CHIP, ifade düzeylerinin arttığını gözlemledik. Ayrıca, yine tümörlü ve normal dokularla yaptığımız immünopresipitasyon deneyleriyle, tümörlü dokularda ERAD proteinlerinin BAG-1 ile birlikte çöktüğünü yani BAG-1 ile etkileştiğini ispatladık. Biyoinformatik araçlarla yapılan diğer analizlerle, protein kalite kontrol sistemine BAG-1L izoformunun katıldığını ve hücre içi homeostazı korumak için ERAD mekanizmasında rol oynadığını belirledik. BAG-1L izoformunun proteazomla etkileşimi zayıf bir şekilde karakterize edittik, ubikitin aracılı proteazomal bozulmada BAG-1L izoformunun rolünün ayrıntılı bir şekilde anlaşılması eksiktir. Özellikle, proteozom mekanizmasının bileşenleri olan VCP/p97 ve RAD23 ile BAG-1L'nin protein-protein etkileşimlerinin bulunması, ubikuitine bağımlı proteazomal degradasyonda BAG-1L'ın rolünün belirlenmesinde kritiktir.