BAMLET proteini üretimi ve koaservasyon yöntemiyle stabilitesinin arttırılması

Enkapsülayon; gıda bileşenlerinin korunması, stabilizasyonu ve yavaş salınımı için kullanılan nispeten yeni bir teknolojidir. Bununla birlikte enkapsülasyon gıda dışında ilaç ve kozmetik gibi geniş bir kapsamda kullanılmaktadır. Bahsedilen alanlarda birçok çalışma mevcuttur. Ancak önemli terapötik etkiye sahip protein ve peptit kaynaklı ilaç etkin maddelerinin enkapsülasyonu ile ilgili çalışma sayısı fazla değildir. Bu tip ilaçların klinik kullanımı için üretim ve depolama koşulları gibi in vitro şartların kararlılığa etkisi yanında; in vivo koşulların (örn: enzimatik hidroliz) terapötik etki üzerine olumsuz sonuçları bulunmaktadır. Bu stabilite sorunlarını enkapsülasyon ile elimine etmek mümkündür. Bu tezde, terapötik etkiye sahip BAMLET proteini koaservatı oluşturularak stabilitesi arttırılmıştır (O7 w/w). Koaservasyonda pektin kullanılmış ve püskürtmeli kurutulmuştur. Proteinin stabilitesini etkileyen faktörler ve koaservasyon verimi incelenmiştir. Oral biyoyararlanımı arttırmak için yapılan çalışmada, mide asitliğine yakın bir pH seçilmek istenmiştir. Bu nedenle pH 3 koaservasyon için hedef pH değerini oluşturmuştur. Bağırsaklara gelindiğinde ilacın salınımı istenmektedir. Bu nedenle pH 7 ve sonrasında koaservasyonun yapısının bozulması ilacın salınması beklenmektedir. BAMLET (Bovine Alpha lactalbumin Made LEthal to Tumor cells) proteini tümorisidal etkiye sahip etkin bir proteindir. Memeli sütlerinden elde edilen ve α-laktalbuminin-oleik asit ile birleşiminden oluşan bu proteinin, ilaç etkin maddesi haline getirilme sürecindeki olumsuz koşullardan etkilenmesi önlenmeye çalışılmış hatta bu sayede ilaç haline getirilmesi olası hale gelmiştir. BAMLET proteinini üretmek için öncelikle inek sütünden α -laktalbumin elde edilmiştir. Literatüre uygun olarak 1 litre sütten 1.2 g α-laktalbumin elde edilmiştir. Proteinin oleik asit ile birleşimi sıcaklık uygulaması yöntemiyle gerçekleştirilmiştir. Alfa-laktalbumin ve BAMLET proteini, Ultra Performans Sıvı Kromatografisi (UPLC) ile tanımlanmıştır. Kromatogramda tek pik çıkmış ve literatürde tanımlandığı gibi 280 nm dalga boyunda sonuç elde edilmiştir. Elde edilen BAMLET için en uygun kaplama materyali pektin olarak belirlenmiştir. BAMLET proteini validasyonu için HPLC (yüksek performanslı sıvı kromatografisi) kullanılmıştır. Bunun için öncelikle doğrusal aralık ve kalibrasyon eğrisi oluşturulmuştur. Yöntemin doğruluğu ve kesinliği, standart sapma ve bağıl hata değerleri yaklaşık olarak % 4.3'den küçük olduğu verisi ile ispatlanmıştır. Ayrıca geri kazanım değeri BAMLET proteinini süt ve elma suyuna ilave edilerek hesaplanmıştır. Gıda preparatlarından elde edilen geri kazanım değerleri % 98.0 ile % 100.16 arasında olduğu belirlenmiş ve proteinin validasyonu sağlanmıştır. BAMLET proteininin pektin ile farklı oranlarda (O1-O7; protein:pektin) koaservatı oluşturulmuştur. Koaservasyon veriminin belirlenmesi için analitik yöntemlere başvurulmuş ve Flaş kromatografide absorbans ölçümleri yapılmıştır. En iyi verim, bulanıklık gözlemlerine paralel olarak O7 w/w Protein:pektin oranı olarak belirlenmiştir. Bu konsantrasyonda partikül büyüklüğü 335,6 nm ve ζ-potansiyeli -25,4 mV olarak ölçülmüştür ve koaservasyon veriminin moleküller arasında elektrostatik etkileşiminden büyük oranda etkilendiği belirlenmiştir. Daha sonra koaservat püskürterek kurutulmuş bu sayede kararlılığı arttırılmıştır. Fourier Transform Infrared (Kızılötesi) Spektroskopisi(FTIR) ile BAMLET, pektin ve koaservat (O7 protein:pektin w/w) üzerine yapılan analizde; BAMLET-pektin koaservatının 1653 cm ̄ ˡ ve 1572 cm ̄ ˡ 'aralığında oluştuğu gözlenmiştir. BAMLET (-COO ̄ ) karboksil grupları ile pektin amin grupları (-NH₃⁺) arasındaki elektrostatik etkileşimi bu aralıkta belirlenmiştir. FTIR koaservasyonun oluşum şeklini bağ yapıları ile ifade etmektedir. Püskürtülerek kurutulmuş BAMLET-pektin koaservatınn termal özelliklerinin belirlenmesi için diferansiyel taramalı kalorimetri (DSC) kullanılmıştır. Bu sayede püskürtülerek kurutulmuş koaservatın denatürasyon pik sıcaklığı ve denatürasyon entalpisinin (Td=163.57°C, ΔHd=261.6 j/g), hem BAMLET proteininin denatürasyon pik sıcaklığı ve denatürasyon entalpisinden (Td=136.33°C, ΔHd=35.95 j/g), hem de sıvı formadaki koaservatın denatürasyon pik sıcaklığı ve denatürasyon entalpisinden (Td=157.6°C, ΔHd=104.3 j/g) daha yüksek olduğu gözlenmiştir. BAMLET proteini dielektrik sabiti incelendiğinde (10.05 ±0.05) sıvı koaservatın polaritesinden (78.063 ±1.3) çok daha düşük olduğu görülmüştür. Solventin poleritesinin bir ölçütü olan dielektrik sabiti, BAMLET proteinin koaservatına göre daha az polariteye sahip olduğunu göstermiştir. Çözeltide daha büyük bir dielektrik sabiti olan solventin daha yüksek bir net yük yoğunluğuna sahip olduğu düşünülmektedir.