Barbunya proteini ve fenolik etkileşiminin incelenmesi

Son yıllarda sürdürülebilir, fonksiyonel ve sağlık destekleyici gıda ürünlerine yönelik artan tüketici talebi, bitki bazlı proteinlerin kullanımını ön plana çıkarmıştır. Ancak bitki bazlı proteinlerin çözünürlük, sindirilebilirlik ve oksidatif stabilite açısından sınırlamaları, bu proteinlerin gıda sistemlerindeki fonksiyonel uygulamalarını kısıtlamaktadır. Bu sınırlamaları aşmak amacıyla, proteinlerin doğal fenolik bileşiklerle etkileşimi yoluyla fonksiyonel özelliklerinin iyileştirilmesi, son yıllarda önem kazanan bir araştırma alanı haline gelmiştir. Bu kapsamda, yüksek protein içeriğine ve fonksiyonel amino asit profiline sahip barbunya fasulyesi (Phaseolus vulgaris L.), alternatif bir bitkisel protein kaynağı olarak dikkat çekmektedir. Bu çalışmada, barbunya protein izolatı (BPİ) ile gallik asit (GA) arasında non kovalent etkileşimlere dayalı kompleksler oluşturulmuş ve yapısal ile fonksiyonel özellikleri incelenmiştir. Yerel marketlerden temin edilen barbunya, öğütülüp ince toz haline getirildikten sonra yağından arındırılmıştır. Çalışmada, 1 kg ham barbunya örneğinden ortalama 104,45 g protein izolatı elde edilmiş, protein içeriğinde yaklaşık 3,15 kat artış gözlenmiş ve protein verimi %37,05 olarak hesaplanmıştır. Yağı uzaklaştırılmış barbunya küspesinden (kuru baz) %27,16 protein içeren hammadde kullanılarak, alkali ekstraksiyon ve izoelektrik çöktürme yöntemleriyle elde edilen BPİ'nin protein saflığı %85,56 olarak belirlenmiştir. BPİ, 20 mg/mL konsantrasyonda olacak şekilde 10 mM pH 7,0 sodyum fosfat tamponunda hazırlanarak 4 °C'de gece boyunca karıştırılmıştır. GA ise farklı konsantrasyonlarda (0, 250, 500, 750, 1000 µmol/g) aynı koşullarda tamponda çözündürüldükten sonra fosfat tamponunda çözdürülmüş BPİ ile 1:1 oranında karıştırılarak 25 °C'de 2 saat inkübe edilmiştir. Oluşan kompleksler, 6–8 kDa moleküler ağırlık kesme sınırına sahip diyaliz torbalarında 24 saat saflaştırılmış, ardından -18 °C'de dondurulup liyofilize edilmiştir. Oluşturulacak kompleks için saf ve kontrollü bir matriks sağlamak amacıyla hem yağı uzaklaştırılmış barbunya küspesinin hem de BPİ'nin fiziksel ve kimyasal bileşimi incelenmiştir. Barbunya örneğinde nem oranı %11,23 iken, protein izolatında bu değer %0,45'e düşmüştür. Benzer şekilde yağ içeriği barbunyada (kuru baz) %1,21 olarak belirlenmişken, izolat formunda %0,47'ye gerilemiştir. Kül içeriği ise barbunyada (kuru baz) %3,71 iken, BPİ örneğinde %5,63'e yükselmiştir. Barbunya örneğinde kuru bazda %27,16 olan protein oranı, izolat örneğinde %85,56'ya yükselmiştir. Kompleks örneklerinde ise, etkileşim sonrası protein içeriğinde meydana gelen olası değişimleri değerlendirmek amacıyla ölçüm yapılmıştır. Kontrol (0) grubunda protein içeriği %83,81 iken, en yüksek GA konsantrasyonunun uygulandığı grup olan 1000'de ise %81,96'ya düşmüştür. GA'in, barbunya proteini izolatının yapısal ve fonksiyonel özellikleri üzerindeki etkilerini incelemek için kapsamlı fonksiyonel analizler gerçekleştirilmiştir. Bu analizler sonucunda, GA konsantrasyonundaki artışla birlikte yüzey hidrofobisitesi 765,72'den 444,57'ye ve disülfit bağları 2,82'den 1,56 µmol/g'ye azalmıştır. Buna karşın serbest sülfhidril grupları 9,90'dan 27,47 µmol/g'ye yükselmiştir (p < 0,05). Fonksiyonel analizlerde su bağlama kapasitesi incelenmiş ve GA konsantrasyonunun artırılmasıyla %24,56'dan %32,49'a yükseldiği elde edilmiştir. Buna karşılık, yağ bağlama kapasitesi %92,67'den %54,08'e gerilemiş; en düşük jel oluşturma konsantrasyonu ise %7,50'den %5,00'e düşmüştür. Çözünürlük ise %82,04'ten %99,39'a önemli bir artış göstermiştir (p < 0,001). Ayrıca emülsiyon aktivitesi %73,55'ten %100'e; emülsiyon stabilitesi ise %36,30'dan %76,61'e yükselmiştir. Köpük kapasitesi %30,76'dan %46,15'e ve köpük stabilitesi %17,65'ten %26,31'e artmıştır (p < 0,001). Oluşturulan kompleks örneklerinde toplam fenolik içerik ve DPPH antioksidan aktivitesi üzerinde de etkiler gözlenmiş; ekstrakte edilebilir fraksiyon ve sindirim fazlarında kontrol grubuna göre anlamlı artışlar elde edilmiştir (p < 0,05). İn vitro ekstrakte edilebilir fraksiyonda toplam fenolik içerik 4,54'ten 31,75 mg GAE/g'ye yükselirken, bağırsak fazında bu değer 36,54'ten 47,40 mg GAE/g'ye ulaşmıştır. DPPH radikal süpürme kapasitesi ise başlangıçta %10,42'den %57,49'a; bağırsak fazında ise %33,96'dan %89,13'e yükselmiştir. Yapısal analizlerde ise, FTIR ve içsel floresan spektroskopisi kullanılmış; bu analizlerde pik şiddetinde değişimler ve floresan yoğunluğunda 36115'den 28604 a.u.'ya düşüş gözlenerek yapısal değişimler doğrulanmıştır. Ayrıca, DSC analizlerinde denatürasyon sıcaklığı 86,02 °C'den 94,89 °C'ye yükselirken, entalpi değişimi 218,29'dan 171,68 J/g'ye düşmüştür. Son olarak, SEM görüntüleri ile yapılan mikroyapı incelemelerinde 750 grubunda protein partiküllerinin sıkıca bağlandığı ve daha kompakt bir yapı oluştuğu tespit edilmiştir. Gallik asit ile barbunya protein izolatı arasındaki non-kovalent etkileşim, protein moleküllerinin yapısında serbest sülfhidril gruplarının artışı, disülfit bağlarının azalması ve hidrojen bağlarının güçlenmesi gibi değişikliklere yol açmıştır. Bu yapısal değişiklikler, protein yüzeyinde hidrofiliklik ve kompaktlık artışına neden olarak, çözünürlük, köpük oluşturma, emülsiyon stabilitesi ve jelasyon gibi fonksiyonel özelliklerde belirgin iyileşmeler sağlamıştır. Termal stabilite açısından yaklaşık %10'luk bir iyileşme gözlenmiştir. İn vitro sindirim testleri sonucunda, barbunya protein izolatı ile gallik asit arasında oluşturulan komplekslerin, sindirim süreci boyunca antioksidan aktivitede kontrol formuna göre istatistiksel olarak anlamlı (p < 0,05) şekilde %30'dan fazla artış sağladığı belirlenmiştir.