Bilgisayar-destekli antikolinesteraz flavonoid türevlerinin sentezi ve intraoperatif kanser görüntüleme özelliklerinin incelenmesi

Çağımız insanının yoğun stres altında olmasından dolayı erken yaşlanma ve erken bunama gibi problemleri vardır. Günümüzde yaklaşık 20 milyon insan Alzheimer hastasıdır. Nörodejeneratif bir hastalık olan AH antioksidan ve antiradikal hatta antienflamatuar mekanizmalarla çok ilişkilidir. Bu tez çalışmasında bilgisayar-destekli ligand keşif ve tasarım prosedürleri uygulanarak aktif AChE ve/veya BChE enzim inhibisyonu gösteren flavonoid ailesinden 3-hidroksiflavon türevlerinin potansiyeli araştırılmıştır ve yüksek potansiyelli türevler tasarlanmıştır. Çalışmalarımız enzimlerin kristal yapısının protein veri bankasından (www.pdb.org) en uygunun seçilmesi ile sentezleyeceğimiz olan ligandların bu bölgeye docklanmasıyla başlamıştır. Daha sonra uyum skorları ve enzim içi kurdukları bağlar ve etkileşimleri GOLD (bilgisayar programı) ile incelenmiştir. Sentezlenmeden önce aktivite göstermeyeceği öngörülen bileşikler elenmiş böylelikle gereksiz zaman ve kimyasal madde sarfiyatı engellenmiştir. Bunun akabinde hedef bileşikler sentezlenmiş, spektral analizlerle yapı tayinleri yapılmış ve bu bileşiklerin antikolinesteraz aktiviteleri in vitro bir test olan Elman metodu ile araştırılmıştır. Bilgisayar destekli çalışmaların sonuçları ile in vitro testlerin sonuçlarının birbiriyle uyumlu olduğu gözlenmiştir. Tezin içerisinde de belirtildiği gibi yüksek uyum skoru ve etkileşim gösteren bileşiklerin aynı zaman da in vitro test sonuçlarının da iyi IC50 değeri verdikleri gözlemlenmiştir. Genel olarak tasarlanan bileşiklerin AChE'den ziyade BChE'ye karşı daha yüksek % inhibisyon ve daha düşük IC50 değerlerine sahip oldukları görülmüştür. Bu sonuçlardan bileşiklerimizin butirilkolinesteraz enzimine karşı seçimli olarak inhibisyon gösterdiği anlaşılmaktadır. 19.34 µM değeriyle BChE enzimine karşı FN34 bileşiğinin standart madde galantaminden de iyi bir IC50 değerini verdiğini görüyoruz ki aynı şekilde FN34 bileşiğinin AChE enzimine karşı da 78.47 µM ile en iyi ikinci değeri gösterdiği belirlenmiştir. Diğer taraftan FN28, FN11, FN23, FN24, FN35 ve FN 38 bileşiklerinin BChE'ye karşı inhibisyon değerlerine bakıldığında standart madde galantaminle yarışacak şekilde oldukça iyi değerler verdikleri görülmektedir. Yapı-aktivite ilişkisi (SAR) bakımından sonuçlar değerlendirildiğinde B halkasında hidroksil bulunduran FN15, FN28 ve yine FN34 bileşikleri 4'-konumunda bulundurdukları OH grupları sayesinde H-bağı yaparak enzimle olan etkileşimi artırdıklarından yüksek uyum içinde oldukları gözlenmişti. Nitekim in vitro test sonuçları incelendiğinde BChE'ye karşı FN34 bileşiği en iyi (IC50=19.36 µM) , FN28 bileşiği ise ikinci en iyi inhibisyon değerini (IC50=33.30 µM) vermiştir. Bunu takiben 4' konumundaki dimetilamin fragmentini bulunduran FN23 ve FN38 bileşikleri çevre aminoasitlerle yaptıkları hidrojen bağları sayesinde yüksek uyum skoru verip in vitro anti-butirilkolinesteraz testleri incelendiğinde de sırasıyla yine en iyi IC50= 39.95 µM ve IC50=38.44µM değerlerini vermişlerdir. Tez çalışmamızın temelini oluşturan Alzheimer hastalığının oksidatif stres ve inflamasyonla seyreden bir hastalık olduğu savından yola çıkarak ayrıca bu tezde sentezlenen tüm bileşiklerin ß-karoten lipid peroksidasyon yöntemi, DPPH serbest radikali süpürücü yöntem, ABTS katyon radikali giderim yöntemi ve CUPRAC yöntemi ile antioksidan potansiyellerini araştırdık. Bu dört testin sonuçlarına göre en iyi IC50 değerlerini ABTS katyon radikali giderim yöntemi ile elde ettik. Elde edilen sonuçlara bakıldığında FN38, FN21, FN41, FN23, FN15, FN27, FN28 VE FN5'in standart madde olan BHT ve α-Toc'den daha iyi değer gösterdiği görülmüştür. Bir 3HF türevi olan kersetin standart bileşikler içinde araştırılan her dört konsantrasyonda da en yüksek değerleri vermiştir. Yine bir radikal giderim ajanı olan DPPH serbest radikal giderim aktivitesi sonuçları incelendiğinde FN23'ün kersetinden sonra en iyi hatta diğer standart maddelerden bile daha iyi IC50 (58.60 µM) değeri verdiği görülmüştür. ß-karoten lipid peroksidasyonu inhibisyonu sonuçlarına bakıldığında ise FN5 200 µM konsantrasyonda 93.59 ile en iyi % inhibisyon değeri ve en iyi IC50 (70.06 µM) değerini vermiştir. Yapısında iki metoksi grubu bulunan FN5'in aktivite sonuçları metoksi grubunun molekülün lipofilik karakterini arttırmasına bağlı olduğu sonucunu göstermektedir. CUPRAC antioksidan aktivitesi sonuçlarında ise en yüksek konsantrasyonda (100 µM) en yüksek absorbans değerini 2.69 ile FN7 bileşiği vermiştir. Bu da standart madde BHA, BHT ve α-Toc'den daha yüksektir. Yine standart maddelerden bir 3HF olan kersetinin 3.16 ile en yüksek değeri verdiği izlenmiştir ki en üst değerin 4.00 olduğu bilinmektedir. Zaten literatür verileri incelendiğinde doğadaki en güçlü antioksidan maddelerin flavonoidler olduğu görülmektedir. 3-Hidroksiflavonların da C2-C3 arasında çifte bağa ve 3 numaralı karbonda hidroksil grubuna sahip olmaları nedeniyle en iyi antioksidan çekirdekler olduğu bu çalışma ile de ispatlanmıştır. Yaptığımız test sonuçları da 3HF'lerin oldukça iyi antioksidan çekirdekler olduğunu göstermiştir. Neredeyse yaptığımız bütün antioksidan deneylerinde iyi sonuç veren FN5, FN7 ve FN23 bileşiklerinde metoksi grubu bulunduğu görülmüştür. Ayrıca elde edilen test sonuçlarından OH grubu sayısı arttıkça antioksidan aktivitenin arttığı gerçeğidir. Yine hem enzim (AChE ve BChE) inhibisyon test sonuçları hem de in silico deney sonuçları incelendiğinde 4' konumundaki OH grubunun hem antikolinesteraz aktiviteyi arttırdığı hem de antioksidan aktivite ile paralel sonuçlar verdiği görülmüştür. Dünyada her yıl milyonlarca insan kansere yakalanmakta ve bu hastalığın çoğu zaman sonu ölümle sonuçlanmaktadır. Kanser tedavisi bazı durumlarda tümörlü dokunun çıkarılması ile başlar, kemoterapi ve diğer yardımcı tedavi yöntemleri ile devam eder. Biz bu tezde kanserli organın tümünü değil, sadece tümörlü dokunun çıkarılmasını hedefleyerek boyar madde ajanları ile görüntüleme sağlamayı hedefledik. Ameliyat sırasında yani intraoperatif olarak hasarlı dokunun floresans kaynaklı fotodinamik olarak görüntülenebilmesi için istenilen dalga boylarında floresans verecek bir 3-hidroksiflavon (FN15) sentezleyerek bunu iki polimerik zincirli amfifilik bir materyal haline dönüştürdük. Bunu polimerleştirme ve click reaksiyonları ile gerçekleştirdik. Elde ettiğimiz amfifilik karakterli bileşiği kanserli dokulara hedefli olarak gönderebilmek için (EPR effect) "gelişmiş geçirgenlik ve alıkonma etkisi" prensipleri çerçevesinde misel haline getirdik. Uygulamaya geçmeden önce 2 farede Ehrlich tümor modeli oluşturuldu. Ehrlich tümörü oldukça agresif kısa sürede büyüyen bir tümör modeli olduğundan bir hafta sonra kontrol edildiğinde, tümörlerin büyüdüğü görülmüştür. Farelerin ölümüne sebep olmasın diye elde edilen misel çok fazla bekletilmeden ameliyattan bir gün önce subkutan (karın boşluğuna) enjekte edilmiştir. Bir gün sonra ameliyat operatör doktor tarafından dikkatlice yapılmıştır. Ameliyat sırasında görüntüleme için UV lamba (366 nm) kullanılmıştır ve misellerin hedefli olarak tümörlü dokuya giderek boyama yaptığı görülmüştür. Böylece cerrahi girişim sırasında tüm dokunun değil, sadece kanserli alanın çıkartılması başarılmıştır. İleride doğal kökenli olan flavonoid bileşiklerinin genelde toksik etkilerinin olmadığı esasına dayanarak ileri klinik çalışmalarla ispatlanarak bu uygulamanın hayvanlarla sınırlı kalmayıp insanlar içinde uygulanabilir olacağını umuyoruz. Böylelikle cerrahi girişim masraflarını yükseltmeden ve hastaya fazla külfet yüklemeden belki de cerrahi alanda bir çığır açılmış olacaktır. Bu çalışma, İstanbul Teknik Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından desteklenmiştir (Proje No: BAP-40259).