Börülce bitkisinden (Vigna unguiculata) afinite tekniği kullanılarak peroksidaz enziminin saflaştırılması ve karakterizasyonu

Bu tez kapsamında amino benzohidrazid türevi moleküller tabanlı afinite kromatografisi tekniği kullanılarak börülce (Vigna unguiculata) peroksidaz enziminin ilk defa tek kademede saflaştırılması gerçekleştirildi ve enzimin biyokimyasal karakterizasyonu yapıldı. Sefaroz 4B-L-tirozin-4-amino-3-bromo-2-metilbenzohidrazid afinite jelinin kullanıldığı tek kromatografik adımda, %53,6 verime ve 91,6 kat saflaştırma katsayısına ulaşıldı. Elde edilen enzimin saflığını ve molekül ağırlığını belirlemek için yapılan SDS-PAGE'de 39 kDa'da tek bant gözlendi. Saflaştırmada ligand olarak kullanılan 4-amino-3-bromo-2-metilbenzohidrazid, 4-amino-3-bromo-5-florobenzohidrazid, 4-amino-3-bromo-5-klorobenzohidrazid ve 5-aminoizoftalohidrazid'in enzim ile etkileşimlerini analiz etmek için, her bir molekülün börülce POD üzerine inhibisyon etkisi incelendi ve saflaştırmada en etkili ligand olan 4-amino-3-bromo-2-metilbenzohidrazid için Ki değeri 970±130 µM olarak hesaplandı. Enzimin karakterizasyon çalışmaları kapsamında, enzim için optimum şartların; pH 6,0, iyonik şiddet 0,3 M ve 40 ºC olduğu bulundu. Ayrıca börülce POD'nin guaiakol, H2O2, 4-metilkatekol ve ABTS substratlarına olan ilgisini belirlemek amacıyla kinetik çalışmalar yapıldı ve bu substratlara ait KM değerleri sırasıyla 7,21 mM, 17,03 mM, 7,28 mM ve 49,21 mM olarak hesaplandı.