Brusellozun tanısında kullanılabilecek gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyon yönteminin geliştirilmesi

Bruselloz; dünya genelinde çeşitli klinik bulgulara, rölapslara ve komplikasyonlara neden olabilen, morbiditesi yüksek, mortalitesi düşük bir zoonozdur. İnsanlarda brusella enfeksiyonunun gerçek insidansı tam olarak bilinmese de endemik bölgelerde insidansın <0,01 ile >0,002 arasında olduğu bildirilmektedir. Rutin laboratuvar tanı sıklıkla kültür ve seroloji ile konmaktadır. Ancak kültür yöntemlerinin duyarlılığı hastalığın evresine, Brucella türlerine, kültür ortamına ve kullanılan kan kültürü tekniğine göre değişkenlik gösterebilmektedir. Ayrıca rutinde daha sık kullanılan serolojik yöntemlerin de çapraz reaktif mikroorganizmalara karşı gelişen antikorlar sebebiyle özgüllüğü düşüktür. Konvansiyonel tanı testlerinde karşılaşılan bu olumsuzluklar nedeniyle Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) temelli yaklaşımlar tanıda önem kazanmıştır. Bu yöntemler brusellozun hızlı ve güvenilir teşhisinde iyi bir alternatiftir. Bu çalışmada, brusellozun erken tanısında kullanılabilecek hızlı, özgün, duyarlı ve güvenilir bir mültipleks Gerçek Zamanlı PZR (mGz-PZR) yöntemi geliştirilmesi ve bu yönteminin konvansiyonel tanı testleri ile karşılaştırılması amaçlandı. mGz-PZR yönteminin en düşük saptama limiti (EDSL), 108-101 cfu/ml konsantrasyonda hazırlanan ve Brucella melitensis ATCC 23456 standart suşu içeren simüle serum ve tam kan örneklerinde araştırıldı. Bu örnekler öncelikle, Thermo ve Norgen DNA izolasyon kitleri ile ekstrakte edildi. Daha sonra Rotor-Gene (Corbett RG 6000, Australia) ve Bio-Rad (CFX-96 C1000 Touch Real-time system) cihazlarında, Maxima SYBR green, QuantiTect ve Ampliqon Tempase PZR master miksleri kullanılarak yöntemin EDSL'si belirlendi. Optimize edilen metodun validasyon çalışmaları yapıldıktan sonra yöntemin etkinliği, bruselloz şüpheli 57 hastaya ait serum örnekleri ve pozitif üreme sinyali veren 21 kan kültür şişesi üzerinde değerlendirildi. Yöntemin EDSL'si; Maxima SYBR green 2x master miks ile çalışıldığında, her iki thermal cycler cihazında 104 cfu/ml bulundu. Daha düşük konsantrasyonlardaki DNA'yı saptamak için kullanılan prob bazlı QuantiTect ve Ampliqon Tempase master miksleri ile kurulan reaksiyonlarda 102 cfu/ml yoğunluktaki örneklerde amplifikasyon sağlandı. Optimize edilen metodun validasyonu Thermo DNA ekstraksiyon kit-Ampliqon master miks ile serum örneklerinde yapıldı. Validasyon çalışmalarında yöntemin doğruluk, tekrarlanabilirlik, özgüllük ve duyarlılık değerlerinin oldukça yüksek olduğu belirlendi. Çalışmaya dahil edilen toplam 57 hastanın 33'ünün (%57,8) serum örneklerinde Gz-PZR ile pozitiflik saptandı. Kan kültürü mevcut olan 41 hastanın 21'inden Brucella spp. izole edildi ve bu 21 hastanın tamamının serum PZR'si B. melitensis varlığını gösterdi. İlaveten; kan kültürü negatif olup serolojik testlerin en az birinde anlamlı pozitiflik (STAT ≥1/160 ve/veya Coombs titre ≥1/320) saptanan 20 hastanın -ki bu hastalar CDC laboratuvar tanı kriterlerine göre olası bruselloz kapsamındadırlar- 12'sinde serum PZR pozitifliği kaydedildi. Yöntemimiz gerek serum örnekleri gerekse tam kan veya diğer klinik örnekler ile kan kültür şişesinden bruselloz tanısında güvenle kullanılabilir. Anahtar Kelimeler: Bruselloz, B. melitensis, Moleküler tanı, Gerçek zamanlı PZR, Optimizasyon, Seroloji