Buğday kahverengi pası (Puccinia triticina Eriks) efektör adayı PTTG-01827'nin hıgs yöntemiyle fonksiyonel analizi

Buğday kahverengi/yaprak pası bir mantar hastalığıdır. Etken olan Puccinia triticina Eriks (Pt), bitkinin fotosentez yapma yeteneğini azaltarak verim kaybına neden olur. Efektörler, patojenler tarafından konakçı savunmalarını bastırmak ve virülans başarılarını arttırmak için konakçı fizyolojisini modüle etmek üzere salgılanan proteinler/peptit molekülleridir. Bu nedenle, efektörlerin tespiti, hastalığı kontrol altına almanın en umut verici yollarından biri olarak görülmektedir. Bu çalışmada aday efektör genin fonksiyonel olarak analiz edilerek gerçek efektör olup olmadığının saptanması amaçlanmıştır. Bunun için daha önce proteomik çalışmada tanımlanan aday efektör PTTG-01827 susturuldu ve fonksiyonel olarak analiz edildi. Fungal gen susturma için HIGS yöntemi kullanıldı. HIGS, bitkilerin doğal savunma mekanizmalarından biri olan RNAi mekanizmasını kullanarak fitopatojenik fungal genlerin susturulmasında başarı ile kullanılan bir yöntemdir. Çalışmada PTTG-01827 efektör adayına özgü 350 bp uzunluğundaki DNA fragmenti tasarlanarak BSMV vektörüne klonlandı. HIGS yöntemi, PTTG-01827 geninin susturulması için optimize edildi. Hassas buğday çeşidi Morocco fideleri, PTTG-01827 fragmenti içeren rekombinant BSMV ile inokule edildi ve virüs aracılığı ile efektör adayına özgü dsRNA molekülleri, bitki hücrelerinde çoğaltılıp dağıtıldı. BSMV semptomlarının görüldüğü 10. Günde aynı bitkiler Pt ırk-1 ile inokule edildi. Böylece Pt ırk-1'in enfeksiyon gelişimi sırasında eksprese olan efektör mRNA'ları hedeflendi. qRT-PCR ve mikroskobik inceleme ile RNAi mekanizmasının etkinliği ve aday genin susuturulma düzeyi belirlendi. Pt enfeksiyon şiddetindeki değişiklikler ile genin susturulma düzeyi arasındaki koorelasyon değerlendirildi. HIGS uygulaması sonucunda, PTTG_01827'nin ekspresyonunda yaklaşık %50'lik azalma olduğu tespit edildi. Pt sporulasyonunda azalma ve hif gelişiminde yavaşlamanın eşlik ettiği ve enfeksiyon şiddetinin %50 oranında azaldığı gözlemlendi. Elde edilen bulgular, PTTG_01827'nin gerçek bir efektör olduğu yönündeki beklentileri desteklemektedir.