Çapraz bağlı immobilize α-galaktozidaz enzim agregatlarının hazırlanması, karakterizasyonu, rafinoz ve rafinoz tip oligosakkaritlerin hidroliz proseslerinde kullanım potansiyelinin araştırılması

α-D-Galaktozidazlar (α-D-galaktozid galaktohidrolaz, Melibiaz, EC. 3.2.1.22) basit ve kompleks oligo- ve polisakkaritlerin (rafinoz, melibiyöz, stakiyöz, galaktomannan) α-1,6-bağlı D-galaktoz birimlerini hidrolizleyen ekzoglikozidazlardır. Galaktoz konjugatlarının α-galaktozidik bağlarının transgalaktozilasyon reaksiyonlarında da görev yapan α-galaktozidazlar doğada oldukça yaygın olarak bitkilerde, hayvanlarda ve mikroorganizmalarda bulunurlar. Hem hidrolaz hem de transferaz aktiviteleri α-galaktozidazların endüstriyel ve medikal alandaki uygulamaları için oldukça önemlidir. α-Galaktozidazlar, gıda işleme ve hayvan besleme prosedürleri, şeker endüstrisi, kağıt ve kağıt hamuru endüstrisi, kan grubu dönüşümleri ve Fabry hastalığının tedavisi gibi çeşitli biyoteknolojik ve medikal uygulama alanlarına sahiptir. Enzim immobilizasyonu teknolojisi enzim stabilizasyonu için ana metodlardan birisi olduğundan son yıllarda oldukça önem kazanmıştır. Bu bağlamda, enzim immobilizasyonu teknolojisinde kullanılabilecek enzim immobilizasyon yöntemleri her geçen gün artmaktadır. Son yıllarda enzim immobilizasyonunda, çapraz bağlı enzim agregatlarının (Cross-Linked Enzyme Aggregates; CLEAs) hazırlandığı enzim immobilizasyon tekniği oldukça revaçtadır. İmmobilizasyon için bir taşıyıcıya gereksinim yoktur. Genellikle yeterli saflıktaki proteinler bifonksiyonel reaktiflerle çapraz bağlanarak çapraz bağlı enzim agregatları oluşturulur. CLEA' lar iyi mekanik özelliklerinin yanı sıra oldukça aktif enzim preparatlarıdır. Çünkü enzimatik aktivite içermeyen çok yüksek oranda yabancı materyal içermezler ve çok sert koşullarda bile artmış kararlılık gösterebilirler ki bu onların uygulamalarını daha da değerli hale getirmektedir. CLEA' nın önemli bir avantajı, immobilizasyon sırasında kullanılan proteinin çok saf olmasına gerek yoktur, ham enzim preparatları da kullanılabilmektedir. Bu çalışmada, mısırdan (Zea mays) izole edilen ve kısmi olarak saflaştırılan α-galaktozidaz enziminin çapraz bağlı enzim agregatları (CLEA) hazırlanarak immobilizasyon gerçekleştirilmiştir. Kullanılan immobilizasyon prosedürünün optimizasyonu için immobilizasyona çeşitli parametrelerin etkisi (amonyum sülfat konsantrasyonu, protein miktarı, glutaraldehit konsantrasyonu, tampon türü, konsantrasyonu ve pH' ı, çapraz bağlama süresi, çapraz bağlama sıcaklığı ve çalkalama hızı, BSA ilavesi) incelendi. Optimum koşullarda (1:5 (v/v) enzim: amonyum sülfat oranı, 7.5 mg protein ve % 0.1 (v/v) glutaraldehit, 6 saat, 4°Ϲ, 150 rpm) % 47 aktivite geri kazanımı ile CLEA hazırlandı. Hazırlanan immobilize ve serbest enzimlerin fiziksel ve kimyasal karakterizasyonu gerçekleştirildi. Enzim aktivitesine etki eden bazı parametreler (sıcaklık, pH, substrat spesifikliği ve konsantrasyonu, efektör konsantrasyonları, inhibisyon etkisi, stabilizatör etkisi) incelenerek kararlılık testleri (termal, pH, depo, operasyonel kararlılık) ve tekrar kullanılabilirlik yapıldı. İmmobilize ve serbest enzimlerin 40°Ϲ' de maksimum aktivite gösterdiği ve optimum pH değerlerinin sırasıyla pH 5.5 ve 6.0 olduğu gözlendi. Serbest ve immobilize enzimler için farklı substratlar varlığında (pNPG, stakiyoz, melibiyoz ve rafinoz) kinetik sabitler (kM, vmax ve kcat) belirlendi. Çeşitli efektörlerin enzim aktivitesi üzerine etkileri araştırıldı. α-Galaktozidaz CLEA' sının termal, pH, depo ve operasyonel kararlılıklarının serbest enzime kıyasla oldukça iyi olduğu belirlendi. Serbest ve immobilize α-galaktozidaz enzimlerinin soya sütündeki rafinoz ve rafinoz tip oligosakkaritlerin hidroliz proseslerinde kullanım potansiyeli ile ilgili çalışmalar yapıldı. CLEA ve serbest enzimin soya sütündeki rafinoz ve stakiyozun % 85' inden fazlasını hidrolizlediği belirlendi.