Knock out of GSH2 gene and production of γ-GC in nicotiana benthamiana leaves with Cas9 vector/cell penetrating peptide complex

Gama glutamat sistein (γ-GC), terapötik ve besin takviyesi potansiyeli olan bir bileşiktir, ancak mevcut üretim yöntemleri maliyetli ve verimsizdir. Bu tez, Nicotiana benthamiana bitki yapraklarında gen düzenleme teknikleri ile bu bileşiği daha verimli bir şekilde üretmeyi amaçlamaktadır. Bu yenilikçi yöntemin bitki ve sağlık biyoteknolojisi alanında önemli bir parametre olacağına inanılmaktadır. N. benthamiana bitkilerinde γ-GC üretimini artırmak için yeni bir teknik kullanılmıştır. İlk adımda, özel olarak tasarlanmış bir CRISPR/Cas9 vektörü (pKI1.1R) ve KLA-10 hücreye nüfuz eden peptitler (CPP) kullanılmıştır. Tasarlanan gRNA, CPP-pDNA kompleksi oluşturmak için KLA-10 peptidi ile birleştirildi ve CPP-pDNA kompleksi farklı N/P oranlarında N. benthamiana yapraklarına infiltre edildi. Bu aşamada Agrobacterium tabanlı transformasyon yöntemi de kullanılmış ve seçilen yöntemin etkinliği kontrol edilmiştir. Araştırmamızda, N/P:1'in üzerindeki oranların bitki yapraklarında nekroza neden olduğu tespit edilmiştir. Hem Agrobacterium tabanlı bitki transformasyon yönteminde hem de geliştirilen yöntemde glutatyon sentetaz 2 (GSH2) geninde istenen mutasyon tespit edilmiştir. Ancak moleküler analizler tüm sonuçların karışık profilde olduğunu göstermiş ve GSH miktarında önemli bir azalma gözlenmiştir.