Centaurea zeybekii Wagenitz'nin in vitro çimlenmesi ve mikroçoğaltımı üzerine araştırmalar

ÖZETBu çalışmada endemik bir bitki olan Centaurea zeybekii Wagenitz'nin in vitroçimlenmesi ve mikroçoğaltımı üzerine araştırmalar yapılmıştır. Türünkapitulumlarından çıkarılan tohumlar (aken meyve) denemelerde başlangıç materyaliolarak kullanılmıştır. Çalışma iki aşamada planlanmıştır. Birinci aşamada, farklı invitro çimlendirme ortamlarının, gibberellik asitin, ışığın ve sıcaklığın çimlenmeüzerine etkisi araştırılmıştır. Bu denemelerde Centaurea zeybekii tohumlarınınoptimum in vitro çimlenme koşullarının belirlenmesi ve çimlenen fideciklerin dışortamlara aktarılarak populasyonun ex situ elde edilmiş bireyler kullanılarakgüçlendirilmesi hedeflenmiştir. kinci aşamada ise, in vitro koşullarda çimlenentohumlardan steril fide gelişimi için uygun ortamların belirlenmesinin yanı sıra, bufidelerin çeşitli kısımlarının eksplant olarak kullanılması ile aksiller ve adventifsürgün oluşumu teşvik edilmeye çalışılmıştır.Kapitulumlardan çıkarılan tohumlara öncelikle canlılık testi yapılmış ve canlılıkyüzde olarak belirlenmiştir. Temmuz ve Ağustos aylarında toplanan tohumlarauygulanan tetrazolium testinin sonuçlarına göre, Temmuz ayında toplanantohumların çok az bir kısmının boyandıkları (%30) ve bu boyanmanın da çok açıkrenkte olduğu gözlenmiştir. Ağustos ayında toplanan tohumların ise % 98'ininboyandıkları ve çok net olarak kırmızı renk aldıkları görülmüştür. TTC testisonuçlarına göre Ağustos ayında toplanan tohumların hemen hepsinin canlı olduklarıve uzun bir süre (20şC sıcaklık, %50-60 nemde) canlılıklarını koruduklarıbelirlenmiştir.lk denemede, GA3 destekli ve desteksiz değişik in vitro ortamlar kullanılmış, C.zeybekii türünün in vitro çimlenmesi için en uygun ortam araştırılmıştır. Tohumlarakan çeşme suyu altında yarım saat yıkandıktan sonra, 10 dakika boyunca % 70'liketil alkolde, ardından 15 dakika % 4.5'luk sodyum hipoklorit solusyonunda tutulupsterilizasyonları sağlandıktan sonra üç defa distile su ile yıkanmıştır. Steril edilentohumlar farklı konsantrasyonlarda (1, 2 ve 3 mg/L) gibberellik asit içeren veiçermeyen çimlendirme ortamlarına (Sıvı MS, White, B5, vitamin destekli distile su)alınarak, 24±2 şC'de 16/8 saat fotoperiyot koşulları altında kültüre edilmişlerdir. Budenemenin sonunda en yüksek çimlenme yüzdesinin vitamin destekli distile suya 1mg/L GA3 ilavesi ile hazırlanmış ortamda olduğu görülürken (% 80), bunu sırasıyla 2mg/L GA3 ilaveli White (%45) ve B5 (%45) ortamları izlemiştir. Denemenin bundansonraki aşamalarında maksimum çimlenmenin elde edildiği 1 mg/L GA3 ilavelidistile su ortamı temel ortam olarak kullanılmıştır.kinci denemede çimlenme üzerine ışığın etkisi araştırılmıştır. 1 mg/L GA3 ilavelidistile su ortamlarına ekilen bir grup tohum 16/8 saat fotoperiyoda tabi tutulurken,diğer bir grup karanlıkta 24 ±2 şC'de inkübasyona bırakılmıştır. Denemenin sonundaC. zeybekii tohumları karanlık koşullarda %80 çimlenme gösterirken, aydınlıkta buoran %78 olarak belirlenmiş ve çimlenme yüzdeleri karşılaştırıldığında ışık vekaranlık uygulamaları arasında önemli bir farklılık bulunmamıştır.Üçüncü denemede tohum çimlenmesi üzerine sıcaklığın etkisi araştırılmıştır.Sterilize edilmiş tohumlar 1 mg/L GA3 ilaveli distile su ortamlarına aktarıldıktansonra 15, 20, 25, 30 ve 35 şC'lik sıcaklıklarda kültüre edilmişlerdir. 24±2 şC'deinkube edilen tohumlar en yüksek çimlenme yüzdesine sahipken (% 79), bu değerinaltında ve üstündeki sıcaklıklarda çimlenme yüzdesinin düştüğü görülmüştür.In vitro koşullarda çimlendirilen (kotiledonları belirmiş) tohumların bir kısmıbahçe toprağı içeren saksılara alınmış ve iklim odası koşullarında yaklaşık 8 ayboyunca yaşatılabilmişlerdir. Çimlenen tohumların diğer bir kısmı ise en uygungelişim gösterecekleri in vitro ortamın belirlenmesi amacı ile B5, MS ve Whiteortamlarına aktarılmışlardır. Yaklaşık 8 hafta sonra (dört haftada bir alt kültüredilmiştir) fideciklerin gelişimleri (sürgün boyu, sürgün sayısı, yaprak sayısı, yaprakgenişliği, kök boyu, kök sayısı) incelenerek sonuçlar değerlendirilmiştir.Denemelerimizde White ortamına aktarılan fidelerin hemen hepsinin bir ay sonraöldükleri gözlenmiştir. B5 ve MS ortamlarındaki fideler yaklaşık 8 hafta sonramorfolojik kriterler açısından incelendiğinde fide gelişimi için en uygun ortamın MSolduğu sonucuna varılmıştır.Bitki gelişimi için en uygun ortam olarak belirlenen MS ortamında gelişenyaklaşık 4 haftalık steril fideler aksiller sürgün çoğaltımı için, primer köklerindenayrılarak farklı sitokinin tip ve konsantrasyonlarını (0.2, 0.5, 1 ve 2 mg/L BA, 0.2,0.5, 1 ve 2 mg/L KIN ve 0.001, 0.005, 001 ve 0.02 mg/L TDZ) içeren MS temelbesi ortamlarına aktarılmışlar ve 24±2 şC'de 16/8 saat fotoperiyot koşullarınınsağlandığı kültür odasına alınmışlardır. 4 haftalık süre sonunda artan sürgün sayılarıbelirlenerek aksillar sürgün çoğaltımı için en uygun sitokinin tip ve konsantrasyonu,sürgün sayısı ve sürgün boyu açısından değerlendirilmiştir. TDZ içeren ortamlaraaktarılan fidelerde aksiller sürgün çoğaltımı teşvik edilmesine rağmen, sürgünlerinkısa boylu kümeler halinde belirdiği ve hemen hepsinin hiperhidrik olduklarıgörülmüştür. En yüksek çoğalma oranı eksplant başına 14.85 (sürgün/eksplant)sürgün sayısı ile 1 mg/L BA ilaveli MS ortamında elde edilmiştir. Maksimum sürgünboyunun en yüksek ortalaması ise bitki büyüme düzenleyicisi içermeyen ve 2 mg/LKIN içeren MS ortamlarında elde edilmiştir. KIN ve BA içeren ortamlarda artansürgün boyuna karşılık, sürgün sayısında bir azalma yani konsantrasyona bağlı olaraksürgün sayısı artışı ile sürgün boyu arasında negatif bir ilişki olduğu gözlenmiştir.Direkt adventif sürgün rejenerasyonu denemelerinde in vitro koşullardaçimlendirilmiş steril fidelerin yaprakları eksplant olarak kullanılmıştır. ki aylık sterilfidelerin yaprakları aksiller tomurcukları olmaksızın abaksial yüzleri ortamla temasedecek şekilde BA (0.2, 0.5, 1 ve 2 mg/L), KIN (0.2, 0.5, 1 ve 2 mg/L) ve TDZ(0.001, 0.005, 0.01ve 0.02 mg/L) içeren ve içermeyen MS ortamlarında kültüreedilmişlerdir. TDZ ilaveli ortamlarda yüksek oranda kalluslaşma görülmüştür.Kalluslaşma oranları 0.001 mg/ L TDZ'de % 90, 0.005 mg/ L ve 0.01 mg/L TDZ'de% 100'ü bulurken, bu oran 0.02 mg/L TDZ'de %47.5' e düşmüştür. BA ilaveliortamlarda ise kalluslaşma oranları; 0.5 mg/L BA'da %52.5, 1mg/L BA'da %27.5 ve2 mg/L BA' da ise %35 oranındadır. 0.2 mg/L BA ilaveli ortamlarda kalluslaşmaoranı düşük (% 5) olmasına rağmen, organogenik cevabın nodüler kallus halindebelirmesi ve alt kültürlemeler ile bu durumun değişmemesi nedeniyle bu sitokinintipi de direk adventif sürgün rejenerasyonu için etkisiz bulunmuştur. KIN ilaveliortamlarda ise düşük oranlarda kalluslaşma görülmüştür. Kalluslaşma oranları 0.2mg/L KIN'de % 5, 0.5 mg/L KIN'de % 2.5, 1 mg/L KIN'de % 4 iken, 2 mg/L KINiçeren ortamda kalluslaşma görülmemiştir. Denenen tüm konsantrasyonlardayaklaşık iki hafta sonra yaprakların yüzeylerinde orta damara yakın yerlerdesürgünler belirmeye başlamış (küçük yaprak çıkışı) ve iyi gelişmiş sürgünler 6.haftanın sonunda gözlenmiştir. Direkt sürgün rejenerasyonu gözlenen ortamlardaeksplantların ortamla temas ettiği kısımlarında kalluslaşma görülmüş ancak bukalluslar zamanla karararak etkinlik göstermemişlerdir. Eksplant başına en yükseksürgün sayısı 1 mg/L KIN içeren ortamda (6.2 sürgün/eksplant) elde edilmiştir.Maksimum sürgün boyunun en yüksek ortalaması da (4.17 cm) yine bu ortamdagözlenmiştir. Sonuç olarak C. zeybekii türünün in vitro elde edilmiş steril fideyapraklarının eksplant olarak kullanılması ile direkt adventif sürgün rejenerasyonuiçin 1 mg/L KIN ilaveli MS ortamının eksplant başına en yüksek sürgün sayısı vemaksimum sürgün boyu açısından en iyi ortam olduğunu söylemek mümkündür.Aksiller ve adventif sürgün oluşumu denemelerinden elde edilen sürgünler stokkültürden ayrılarak köklenmeleri için 0.5, 1, 2 ve 5 mg/L IAA, IBA, NAA içeren MSve ½ MS ortamlarına alınmıştır. MS ve ½ MS ortamları arasında köklenme teşvikiaçısından belirgin bir farklılık görülmemiştir. Ancak köklenme son derece düşüktürve sürgünlerin sadece %15'i 0.5 mg/L IBA ilaveli ortamlarda köklendirilebilmiştir.Köklenen bitkicikler dış ortamlara kademeli bir şekilde aktarılarak aklimatizeedilmiştir.