İnsan naif pluripotent kök hücrelerinin kimyasal ve genetik düzenleyicilerinin karakterizasyonu

Pluripotent kök hücreler, naif ve primed olmak üzere iki temel gelişimsel durumda bulunur. Naif pluripotent kök hücreler, daha geniş gelişimsel potansiyelleri nedeniyle erken embriyonik gelişimin modellenmesi açısından özel bir vaat taşımaktadır. Ancak, insan naif pluripotent kök hücrelerinin türetilmesi ve stabil olarak sürdürülmesi teknik açıdan halen zorludur. Bu tez, primed durumdan naif duruma geçişi kısıtlayan epigenetik mekanizmaları ortaya çıkarmayı ve dönüşüm verimliliğini artıracak stratejiler geliştirmeyi amaçlamaktadır. Bu kapsamda, birkaç kromatin düzenleyici faktörün (DOT1L, P300/CBP, MENIN ve BRD9) naif dönüşüm üzerindeki etkileri küçük molekül inhibitörleri kullanılarak değerlendirilmiştir. Naif dönüşümü izlemek için iki bağımsız reporter sistemi kullanılmıştır: biri OCT4'ün farklılaştırılmış enhancer kullanımına, diğeri ise KLF17 ekspresyonuna dayalıdır. İnhibitör uygulamaları, yakın zamanda geliştirilen bir kültür koşulu (HENSM) altında gerçekleştirilmiştir. Dönüşüm verimliliği, floresan marker ekspresyonu için akış sitometrisi ve naif-spesifik genler için RT-qPCR kullanılarak nicel olarak değerlendirilmiştir. Bulgular, DOT1L inhibitörü EPZ5676 ve MENIN inhibitörü VTP50469'un naif dönüşüm üzerindeki epigenetik engelleri anlamlı düzeyde azalttığını göstermektedir. Buna karşılık, P300/CBP ve BRD9'u hedefleyen inhibitörler daha sınırlı etkiler ortaya koymuştur. RT-qPCR sonuçları, DPPA3, TFCP2L1 ve KLF17 gibi naif markerların yukarı regülasyonunu ve primed ya da soy ile ilişkili genlerin aşağı regülasyonunu doğrulamıştır. Bu sonuçlar birlikte değerlendirildiğinde, DOT1L ve MENIN'in insan kök hücrelerinde naif pluripotensinin önünde önemli epigenetik bariyerler olarak işlev gördüğü anlaşılmaktadır. Ayrıca, bu laboratuvarda oluşturulan yeni bir KLF17-GFP reporter hattı fonksiyonel olarak karakterize edilmeye çalışılmış ve durum geçişlerini izlemeye yönelik naif-spesifik bir marker olarak potansiyeli değerlendirilmiştir. Tezin üçüncü bölümünde ise hem primed hem de naif iPSC'lerde gen silme çalışmalarını kolaylaştırmak amacıyla, AAVS1 güvenli bölgesine indüklenebilir Cas9 geninin entegre edildiği bir insan iPSC hattı genom düzenleme ile oluşturulmuştur. Genel olarak, bu çalışma, DOT1L ve MENIN gibi spesifik epigenetik düzenleyicilerin inhibe edilmesinin insan naif pluripotent kök hücrelerinin elde edilme verimliliğini önemli ölçüde artırabileceğini göstermektedir. Ayrıca, naif pluripotensinin düzenlenmesini incelemeye ve hem naif hem de primed koşullarda gen knockout çalışmalarına uygun yeni bir reporter sistemi ve genom düzenlenmiş bir iPSC hattı tanıtmaktadır.