Çilek meyvesinden proteaz enziminin saflaştırılması, karakterizasyonu ve uygulama alanlarının araştırılması

Bu çalışmada, çilek (Fragaria ananassa) meyvesinden izole edilen proteaz enziminin saflaştırılması, karakterizasyonu, immobilizasyonu ve uygulama alanlarının araştırılması amaçlanmıştır. Sefaroz-4B-L-tirozin-p-amino benzoik asit afinite kromatografisi kullanılarak 395,6-kat saflaştırılan proteazın molekül ağırlığı, sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi ile 65,8 kDa olarak belirlenmiştir. Saf proteaz için optimum pH ve sıcaklık değerleri sırasıyla 6 ve 40 °C olarak bulunmuştur. Saf proteazın, geniş bir sıcaklık ve pH aralığında oldukça kararlı olduğu saptanmıştır. Co2+ iyonları çilek proteazını çok kuvvetli bir şekilde aktive etmiştir. Cu2+, Hg2+, Cd2+ ve Mn2+ iyonları ise proteaz aktivitesini belirgin şekilde inhibe etmiştir. 2-propanol enzimi tamamen inhibe ederken, etanol ve metanol varlığında enzim kararlılığını daha iyi korumuştur. Çilek proteazı, doğal ve modifiye substratlar arasında en yüksek spesifikliği hemoglobine karşı göstermiştir. Enzimin sentetik substratlara karşı spesifikliğinin de araştırılmasının ardından, geniş bir substrat spesifikliğine sahip olduğu sonucuna varılmıştır. İnhibisyon çalışmaları çilek proteazının yüksek ihtimalle serin proteaz olduğunu ve aktivitesinin ortamdaki metal iyonlarından belirgin şekilde etkilendiğini göstermektedir. Bunun yanında, ham çilek proteazının Ca-aljinat küreciklerde immobilizasyonunun ardından, deterjan katkı maddesi ve süt pıhtılaştırıcı ajan olarak kullanımı test edilmiştir. Enzimin Ca-aljinat küreciklerde immobilizasyonu esnasında, aljinat konsantrasyonu %2 ve CaCl2 çözeltisi konsantrasyonu %3'de sabit tutulmuştur. Enzimle beraber immobilize edilen Co2+ iyonlarının (1 mM) enzim etkinliğini 8,4 kat arttırdığı saptanmıştır. İmmobilizasyon verimi sadece ham enzimi içeren kürecikler için %65, Co2+ iyonlarıyla birlikte ham enzimi içeren kürecikler için %69 olarak belirlenmiştir. İmmobilizasyon sonucunda enzimin optimum sıcaklık değeri değişmezken, optimum pH değerinin 6'dan 7'ye kaydığı görülmüştür. İmmobilizasyon sonrasında ham enzimin Vmax değerinde yok denebilecek kadar küçük bir azalma ve Km değerinde belirgin bir artış meydana gelmiştir. Çilek proteazının tekrar kullanılabilirlik özelliği ortalama düzeyde iken, depolanma kararlılığı yüksek bulunmuştur. Test edilen tüm parametreler açısından, çilek proteazının kararlılığının immobilizasyon neticesinde arttığı saptanmıştır. Gerçekleştirilen uygulama çalışmaları, çilek proteazının iyi bir deterjan katkı maddesi olarak değerlendirilebileceğini fakat süt pıhtılaştırıcı enzim alternatifi olarak etkisinin zayıf kaldığını göstermiştir.