Coriolopsis polyzona MUCL 38443'ten lakkaz izoenzimi kodlayan genin klonlanması ve ifade edilmesi

Dünyada en çok bulunan biyokütleler arasında lignoselüloz, selüloz, hemiselüloz ve lignin polimeri bulunur. Lignin, odunsu bitkilerin en dış katmanında bulunur ve yapısının heterojen olması sebebiyle parçalanması zordur. Ligninin biyoparçalanması, küresel karbon döngüsü ve lignoselülozik hammaddelerin kullanıldığı endüstriyel uygulamalar açısından önem arz eder. Doğadaki bazı özel mantar türleri, lignin biyoparçalanmasını gerçekleştirebilmektedir. Bunlar arasında beyaz çürükçül mantarlar lignoselülozik kompleksleri parçalayabilme özelliğine sahip çoklu enzim sistemlerine sahip olmaları bakımından önemlidirler. Basidiyomisitler, lakkaz benzeri oksidatif enzimler üretip hücre dışına salgılayarak tüm odunsu lignoselüloz bileşiklerin yumuşak ve sert odunsu kısımlarının çürümesini sağlayabilirler. Basidiyomisit şubesinde bulunan Coriolaceae ailesine ait Coriolopsis polyzona, ligninolitik enzim üreticisi olan beyaz çürükçül bir mantardır. Lakkkazlar (EC 1.10.3.2) fenolik ve fenolik olmayan lignin temelli bileşiklerin oksidasyon reaksiyonunu oksijenin suya indirgenmesi reaksiyonuyla birleştirerek katalizleyebilen enzimlerdir. Lakkazlar, genellikle monomerik yapıda bulunan ve hücre dışına salgılanan glikoproteinlerdir. Lakkazlar, kâğıt, meyve suyu ve tekstil endüstrisi atık sularının detoksifikasyonu, tarımda kullanılan pestisit ve herbisitlerin biyoremediasyonu, medikal tanı ve biyosensör üretimi gibi pek çok alandaki uygulamalarda kullanımları sebebiyle önemlidirler. Fungus türleri farklı çevre koşullarında birden fazla lakkaz izoenzimi üretebilirler. Aynı suş tarafından üretilseler dahi biyokimyasal özellik ve enzim aktiviteleri bakımından farklılık göstermeleri sebebiyle yeni bir lakkaz olma olasılığı bulunan lakkaz izoenzimlerinin izole edilmesi ve detaylı karakterizasyonun yapılması gerekmektedir. Bu araştırmalar, lakkazların organizmalardaki fizyolojik rollerinin anlaşılmasının yanı sıra biyolojik uygulamalarda kullanılabilecek daha uygun lakkaz enzimlerinin bulunması bakımından önemlidir. Araştırma grubumuzun daha önceki çalışmalarında, beyaz çürükçül küf mantarı Coriolopsis polyzona MUCL 38443 suşunda, lakkaz izoenzimlerine ait üç farklı kısmî cDNA sekansları, Cplcc1, Cplcc2 and Cplcc3, karakterize edilmiştir. BLAST analizi sonucunda bu kısmî sekanslar daha önce National Center for Biotechnology Information (NCBI) veritabanına yüklenmiş lakkaz kodlayan sekanslarla yaklaşık %80 benzerlik gösterdiği gösterilmiştir. Grubumuzda yürütülen çalışmalar neticesinde öncelikle, Coriolopsis polyzona MUCL 38443 suşundaki Cplcc1 ve sonrasında Cplcc2 lakkazına ait tam boy cDNA dizileri elde edilerek, karakterize edilmiştir. Bu bulguların devamı olarak planlanan bu çalışmada, Coriolopsis polyzona MUCL 38443 suşundaki Cplcc3 kısmî cDNA'sına ait tam boy cDNA dizisi izolasyonu, karakterizasyonu ve Pichia pastoris X-33 suşunda ekspresyonu amaçlanmıştır. Cplcc3 kısmî cDNA dizisine özel dizayn edilen RACE primerleriyle, Coriolopsis polyzona MUCL 38443 total RNA'sı kalıp olarak kullanılarak 5' ve 3' RACE reaksiyonları gerçekleştirilmiştir. 5' ve 3' cDNA uçlarını içeren reaksiyon ürünleri dizilenmiş ve analizleri gerçekleştirilmiştir. Bu analizler sonucunda Cplcc3 adlandırılan kısmî cDNA dizisinin, gerçekte CpLcc2 korunmuş bakır I ve IV bölgesini içeren geninin bir parçası olduğu ortaya çıkarılmıştır. Cplcc2 genine ait açık okuma çerçevesi daha önceki çalışmada pGEMT-Easy PZR klonlama vektörüne klonlanmış ve karakterizasyonu yapılmıştır. Bu sebeple, çalışmamızın amacına uygun olarak, doğruluğu kontrol edilmiş olan Cplcc2 açık okuma çerçevesi kesim enzimleri ile kesilip çıkarılmış ve maya mekik ekspresyon vektörün pPICZB'ye klonlanmıştır. Cplcc2 geni kendi sinyal sekansı ile klonlanarak, ifade edileceği konak organizmada üretildikten sonra hücre dışına salınması amaçlanmıştır. Rekombinant vektör metilotrofik bir maya olan Pichia pastoris transformasyonunda kullanılmış ve Cplcc2 lakkazının heterolog olarak ifade edilmesi sağlanmıştır. Transformantların rekombinant CpLcc2 lakkaz üretimi ve salınımı, ABTS içeren minimal besi yerlerinde kontrol edilmiştir. Lakkaz üreten ve salınımı yapan transformantların etrafında yeşil alan oluşturduğu gözlemlenmiştir. Lakkaz üreten 16 transformanttan en iyi üretim yapan transformant, metanol içeren sıvı besi yerinde büyütülerek ve alınan örneklere lakkaz aktivitesi deneyi yapılarak belirlenmiştir. En iyi üretim yapan koloni X33-8 olarak belirlenmiştir. En iyi üretim koşullarını belirlemek amacıyla, enzim üretimine ve aktivitsine etkisi olabilecek faktörler optimize edilmiştir. Bu amaçla, farklı büyüme ortamlarının, metanol konsantrasyonunun, bakır konsantrasyonunun, L-Alanin konsantrasyonunun ve büyüme sıcaklığının etkisi araştırımıştır. Bu çalışma sonucunda optimum koşullar, BMGY/BMMY büyüme ortamı içerisinde % 1.5 metanol, 0.8 mM bakır sülfat ve % 0.4 L-alanin eklendikten sonra 250 rpm ve 28°C olarak saptanmıştır. Elde edilen optimum koşullar, grubumuzda daha önce karakterize edilen, Coriolopsis polyzona MUCL 38443 organizmasına ait, rekombinant CpLcc1 lakkazı ile benzerlik göstermektedir. Rekombinant CpLcc2 lakkazı optimizasyonu yapılan koşullarda üretilmiş ve üretim ortamına salınan enzimin aktivitesi lakkaz aktivitesi deneyi ile belirlenmiştir. En yüksek rekombinant CpLcc2 lakkaz aktivitesi 1159.041 U/l olarak belirlenmiştir. Optimizasyon çalışmaları sonucunda lakkaz aktivitesi 17.37 kat arttırıldığı gözlemlenmiştir. Rekombinant olarak ifade edilen CpLcc2 lakkazının aktivitesinin, rekombinant olarak edilen CpLcc1 lakkazından yüksek olduğu belirlenmiş ve Cplcc2 lakkazının ifade seviyeleri göz önünde bulundurularak endüstriyel ve biyoteknolojik uygulamalara daha uygun olabileceği düşünülmektedir. Optimize edilen koşullara göre üretilen rekombinant lakkaz CpLcc2 lakkazının yaklaşık moleküler ağırlığı Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi (SDS-PAGE) ile analiz edilmiş ve SDS-PAGE moleküler ağırlık standart eğrisi oluşturularak 72.4 kDa olarak belirlenmiştir. Belirlene bu moleküler ağırlık, daha önce çalışılmış Coriolopsis polyzona WR710-1 suşundan elde edilen 71 kDa büyüklüğündeki nativ lakkazla tutarlılık göstermiştir. Rekombiant Cplcc2'nin SDS-PAGE ile belirlenen molekül ağırlığının, protein sekansına göre belirlenen hipotetik moleküler ağırlıktan fazla olduğu belirlenmiştir. Bu fazla ağırlık, rekombinant enzimin ifade edildiği konak organizmada gerçekleştirilen glikozilasyondan kaynaklanabileceği ve glikozilasyon seviyesinin %28.3 olabileceği belirlenmiştir. Bu glikozilasyon seviyesinin, fungus orijinli lakkazlarda görülenden daha yüksek olduğu ifade edilmiştir. Bunun yanı sıra, daha önce aynı organizmadan rekombinant olarak üretilen Coriolopsis polyzona MUCL 38443'e ait CpLcc1 lakkazında böyle bir glikozilasyon belirlenmemiştir. Pichia pastoris konakçısında, optimum koşullarda üretildikten sonra, CpLcc1'e kıyasla elde edilen total aktiviter göz önünde bulundurulduğunda CpLcc2 aktivitesinin daha yüksek olmasının CpLcc2'de görülen glikozilasyondan kaynaklandığı düşünülmektedir.