Clostridium botulinum Tip A'dan proteaz enziminin kısmi olarak saflaştırılması ve karakterizasyonu

Bu çalışmada Clostridium botulinum Tip A ATCC 7948'den proteaz enziminin kısmi olarak saflaştırılması ve karakterizasyonu araştırılmıştır. Proteaz enzimi üretimi %1 tripton, %1 pepton, %0,5 maya ekstraktı, %0,1 çözünebilir nişasta, %0,3 CH3COONa, % 0,05 L-sistein, %0,03 sodyum tiyoglikolat, %0,5 NaCl ve % 1 glukoz içeren besiyerinde 37 0C'de 20 saat süresince gerçekleştirilmiştir. Proteaz enzimi, %85 amonyum sülfat çöktürmesi ve DEAE selüloz anyon değişim kromatografisiyle %6,12 verimle ham ekstrakta göre 3,67 kat saflaştırılmıştır. Enzimin spesifik aktivitesi 650 U/mg'dır. Enzimin optimum pH ve sıcaklığı sırası ile 8 ve 50 0C'dir. Enzim 40 0C'de 3 saat boyunca aktivitesinin yaklaşık tamamını korumuştur. 60 ve 70 0C'de ise ilk 15 dakikada aktivitesinin büyük bir kısmını kaybetmiştir. Enzimin aktivitesi Zn2+, Ca2+, Co2+, Mg2+ ve Ni2+ iyonları varlığında artış gösterirken, Cd2+ ve Sn2+ iyonları enzimi inhibe etmiştir. Al3+, Fe3+, Na+ ve Sr2+ iyonları varlığında ise enzim aktivitesini korumuştur. Enzim kazein, jelatin, soya fasulyesi unu ve BSA gibi doğal substratlar karşısında en yüksek aktiviteyi kazeine karşı göstermiştir. Enzim etanol, matanol, DMSO, 2-propanol ve asetondan etkilenmezken n-butanol ve hekzan varlığında aktivitesini sırası ile %39 ve %23 oranında kaybetmiştir. Deterjan katkı maddelerinden olan Triton X-100 ve Tween 80 enzim aktivitesini artırmıştır. SDS karşısında ise enzim aktivitesini korumuştur. %2'lik ve %5'lik H2O2 varlığında enzimin aktivitesinde artış gözlenmiştir. Enzim metaloproteaz inhibitörü olan EDTA tarafından inhibe edilmiştir. PMSF varlığında ise aktivitesinde düşüş gözlenmiştir. Bu inhibisyon profili enzimin metaloproteaz olduğunu ve aktif merkezinin yakınında serin kalıntılarının bulunduğunu göstermiştir.Bilim Kodu: 201.1.020Anahtar Kelimeler : Metaloproteaz, Clostridium botulinum, saflaştırma karakterizasyonSayfa Adedi: 81Tez Yöneticisi : Prof.Dr. Elif LOĞOĞLU