Kemik doku mühendisliği için biyouyumluluğu arttırılmış biyobozunur doku iskelesi

Çeşitli hastalık, kaza ve travma durumlarında insan vücut dokularında deformasyonlar veya kayıplar meydana gelebilir ve bunların tedavisini sağlamak amacıyla kritik tıbbi müdahale gerekebilir. Bir hastanın kendisinden alınan dokunun vücudun başka bir bölgesine transplante edilmesi, başka bir insandan alınan dokunun transplantasyonu veya protez ile fiksasyon araçlarının kullanımı başvurulan en yaygın tedavi yöntemlerindendir ancak bu yöntemler donor yetersizliği, doku uyuşmazlığı veya implantın vücuttan çıkarılması için gerekebilecek cerrahi müdahale gibi çeşitli problemleri beraberinde getirebilmektedir. Doku mühendisliği, fonksiyonel doku ve organların yenilenmesini hedefleyen mevcut tedavi yöntemlerine bir alternatiftir. Doku fonksiyonunu onarmayı ve iyileşmesine destek olmayı amaçlayan; mühendislik ile doğa bilimlerinin birlikte çalışıldığı bir alandır. Doku iskeleleri hücre ekimini, tutunmasını, çoğalmasını ve farklılaşmasını kolaylaştırmak için üç boyutlu kalıplar olarak kullanılır. Çeşitli biyolojik moleküllerin salımı yoluyla dokuda gerçekleştirilmek istenen işlemler çeşitlendirilebilir ve/veya hızlandırılabilir. Doku mühendisliğinde kullanılan biyomalzemeler genel olarak sentetik polimerler, doğal polimerler ve seramikler olarak üç grupta incelenir. Doğal polimerler biyoyumlu ve biyobozunur yapıda olmaları ile birlikte sınırlı mekanik özelliklere sahiptir. Sentetik polimerler kolayca işlenilebilen yapıdadır ancak yeterli biyouyumluluk gösteremeyebilir. Doku iskelelerinin üretiminde, hücre ile dokuların doğal yapı ve karakteristiklerinin gözönünde bulundurulmaması, vücudun doku iskelesini hem biyouyumluluk hem de mekanik özellikler bakımından kabul etmemesine yol açabilmektedir. Seramik malzemelerin biyouyumluluğu göreceli olarak yüksektir ancak işlenmeleri genellikle zordur. Kemiğin yapısında bulunan hidroksiapatit gibi seramik malzemeler bu alanda en çok kullanılanlar arasındadır. Farklı gruplara ait bileşenlerin birlikte kullanılmasıyla, amaca uygun olarak belirlenen özelliklerin aynı yapı içerisinde toplanması mümkündür. İdeal doku iskelesinin elde edilebilmesi için seçilen biyomalzemenin bağışıklık yanıtına sebebiyet vermemesi gerekmektedir. Ayrıca doku iskelesinin mekanik stabilitesi ve yüzey kimyası ilgili dokuya uygun olmalıdır. Mekanik bütünlük, özellikle kemik ve kıkırdak dokuda, implantasyon süresi ve fonksiyonun gerçekleştirilebilmesi için gereken iyileşme süresi göz önünde bulundurularak belirlenmelidir. Vücut hücrelerinin bu doku iskelesi üzerine tutunması ve kendi hücre dışı matrislerini üretmesi beklenmektedir. Hücrelerin penetrasyonu, besin maddelerinin hücreler ile hücre dışı matrikse difüzyonu ve hücresel atıkların hücre dışına atılabilmesi için gözeneklilik oranı ve bağlantılı gözenek yapısı önemlidir. Geometrik özellikleri, gözenek yarıçapı ve gözeneklilik özellikleri belirlenebilen biyofonksiyonel doku iskelelerinin, yüksek oranda vaskülarize olmuş dinamik bir yapı olan kemik dokularda kullanımı gelecek vadetmektedir ve bu sebeple gözenekli doku iskelelerinin kullanımı oldukça yaygındır. Kemik doku mühendisliğinde ipek fibroinin kullanım potansiyelini konu alan yayın sayısında son yıllarda kararlı bir artış gözlemlenmektedir. İpek fibroin yüksek oksijen geçirgenliği, biyouyumluluğu, ayarlanabilen biyobozunurluk oranı, kimyasal kompozisyonu ve mekanik özellikleri ile tercih edilen, FDA onaylı bir biyomalzemedir. İpek fibroin çeşitli doku iskelesi formlarında üretilebilir. Poli(ekaprolakton) (PCL) ve poli-l-laktik (PLLA) asit polimerleri biyouyumluluk, biyobozunurluk özellikleri ile kemik doku mühendisliğinde kullanıma uygundur. PLLA, mekanik dayanımı iyi olmasına rağmen sert ve kırılgan yapı gösterir. Bununla birlikte PLLA hidrolizi sonucunda vücutta asidik bozunma ürünleri ortaya çıkmaktadır. PCL ile PLLA'in birlikte kullanımı, ortaya çıkan yapının mekanik direnç özelliğinin daha iyi olmasını sağlar ve doğal pH'ın korunmasına yardımcı olur. Üç boyutlu biyomimetik doku iskelelerinin üretiminde çözücü uçurma (solvent casting-particulate leaching), faz ayırma (phase separation), gaz köpüklendirme (gas foaming), hızlı prototipleme (rapid prototyping) ve elektroeğirme (elektrospinning) kullanılan yöntemlerden bazılarıdır. Elektroeğirme farklı biyopolimerlerin birlikte kullanımına olarak veren, yüksek gözenekliliğe sahip ve fonksiyonel üç boyutlu doku iskelelerinin üretiminde kullanılan, uygulanabilirliği yüksek ve pratik bir yöntemdir. Bu çalışmada elektroeğirme yöntemi kullanılmıştır. Elektroeğirme cihazının başlıca bileşenleri güç kaynağı, mekanik pompalama sistemine yerleştirilen enjektör ve toplayıcı alandır. Polimer çözeltisi enjektöre beslenerek elektrik alan uygulandığında, enjektörün ucunda konik damlacık (Taylor cone) meydana gelir. Elektrostatik yük, damlacığın yüzey gerilimini aştığında iletken toplayıcı alana doğru bir polimer jet akışı oluşur. Çözücü buharlaşır ve nanoiplikler alan üzerinde birikmeye başlar. Yüzey alanı – hacim oranının yüksek olması, hücre tutunmasının arttırır. Polimer çözeltisinin konsantrasyonu, iletkenliği, viskozitesi gibi özellikler prosesi etkilemektedir. Bu çalışmanın amacı, nanoiplik yapılı doku iskelesinin doğal bir polimer olan ipek fibroin proteini ile kaplanması sonucunda daha hidrofilik bir yüzey elde edilerek, hücrelerin doku iskelesine tutunma ve doku iskelesi üzerinde çoğalma davranışlarının gözlemlenmesidir. Bu amaçla, elektroeğirme yöntemi ile üretilen PCL/PLLA nanoiplik yapısı ipek fibroin solüsyonu ile kaplanmıştır. Kaplamada dip coating yöntemi kullanılmıştır. Bu teknik ile belirli nanoyapılara sahip biyofonksiyonel çok ince film yüzey kaplamaları yapılabilmektedir. PCL/PLLA nanofiber yapının elde edilebilmesi için, çözücü olarak metanolkloroform (1:3 v/v) belirlenmiş ve 1:1 oranında kullanılan polimerler 4 saat süre ile karıştırılmıştır. Değişik konsantrasyonlar (%9-11 (w/v)) çalışılmış ve elde edilen yapıların taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile görüntüleri alınmıştır. Literatürde çapı 1 µm'den az olan fiberlerin nanofiber olarak değerlendirilmesi ve çalışmaların bu yönde ilerlediği gözönünde bulundurularak, çapı 998.1 ± 246.0 nm olan PCL/PLLA (%10 w/v) nanofiberin kullanılmasına karar verilmiştir. İpek fibroin ekstraksiyonu ile canlı vücudunda bağışıklık sisteminin reaksiyonuna sebebiyet veren serisin proteinleri uzaklaştırılmış ipek fibroin solüsyonu elde edilmiştir. PCL/PLLA (10 %w/v) nanofiberleri üzerine ipek fibroin solüsyonu ile sırasıyla 1 kat, 2 kat ve 3 kat olacak şekilde kaplanmıştır. Deneyler sonunda 3 kat kaplama yapılmış, 24 saat karıştırma ile hazırlanan %10 (w/v) konsantrasyonundaki nanofiberin hücre tutunması ve büyümesi için uygun olduğu gözlemlenmiştir. İpek fibroinin konformasyonal değişikliğini gerçekleştirmek ve β-sheet kristalin yapı oluşumunu sağlamak için hazırlama aşamasında %50 (v/v) metanol ile muamele işlemi uygulanmıştır. Fourier Transform Infrared Spektrofotmetre (FTIR) cihazı ile ipek fibroin kaplama işlemi ve metanol muamelesinin kimyasal yapıya etkisi incelenmiştir. Elde edilen spektrum, kaplama işleminin konformasyonel değişikliğe sebep olmadığını, bununla birlikte metanol ile muamelenin doku iskelesinde β-sheet yapısı oluşturduğunu göstermiştir. Doku iskelelerine ekilmiş insan osteoblast hücrelerinin (hfOB) doku iskelesi üzerinde çoğalmasını ve yüzeyin kimyasal karakteristiklerinin etkisini incelemek amacıyla 1, 4. ve 7. günlerde MTS analizi yapılmıştır. En fazla hücre çoğalması PCL/PLLA nanofiberi üzerinde, en az çoğalma ise metanol ile muamele edilmiş ipek fibroin kaplı PCL/PLLA nanofiberi üzerinde görülmüştür. Hidrofilik özelliklerinin belirlenmesi için PCL/PLLA (136°), ipek fibroin kaplı PCL/PLLA (86°) ve metanol ile muamele edilen ipek fibroin kaplı PCL/PLLA nanofiberlerinin (79°) su temas açısı ölçümleri yapılmıştır. Hidrofilik özellik arttıkça, hücre tutunmasının azaldığı gözlemlenmiştir.