Hücre–yüzey etkileşimlerinin incelenmesi için yüzey-destekli lipid zarların oluşturulması ve karakterizasyonu

Hücre-hücre/biyomolekül ve hücre-yüzey etkileşimlerinin araştırılması, hücre sinyal iletimi, hücre tutunma, çoğalma ve farklılaşma gibi temel mekanizmaları anlamak için önem arz etmektedir. Bu mekanizmalara ilişkin edinilecek detaylı bilgiler, etkin tıbbi sistemlerin geliştirilmesi ve iyileştirilmesi gibi konularda da aydınlatıcı olmaktadır. Yüzey-destekli Yapay Lipid Membranlar (YLM) özgül biyolojik etkileşimlerden sorumlu biyoaktif moleküller ile işlevselleştirildiğinde biyolojik zarların temel özelliklerinin incelenmesi, biyosensör yapımı, ilaç tarama platformları, kanser hücresi tespit platformları ve hücre-hücre / biyomolekül, hücre-yüzey etkileşimlerinin incelenmesi gibi birçok pratik uygulama için uzun süreli deneylere imkân sağlamaktadırlar. Biyomimetik YLM platformlar ayrıca atomik kuvvet spektroskopisi, yüzey plazmon spektroskopisi (SPR) ve disipasyon-izlemeli kuvartz kristal mikroterazi (QCM-D) gibi yüzeye-hassas karakterizasyon tekniklerinin kullanılmasına izin verir. Bu tez çalışması kapsamında, hücre-yüzey etkileşimlerini araştırmak için işlevsel YLM platformu oluşturulması ve tüm sürecin QCM-D sistemi kullanılarak gerçek-zamanlı takip edilmesi amaçlanmıştır. Bu şekilde mikroskop altında ayırt edilmesi mümkün olmayan hücre-yüzey etkileşimlerindeki değişikliklerin (yüzey özelliklerine, hücre tipine ve zamana bağlı) araştırılması mümkün olabilmektedir. Bu maksatla YLM yüzeyleri RGD ve osteokalsin mimetik (OSN) peptidleri ile işlevselleştirilmiş ve bu yüzeylerin osteoblast hücreleri ile etkileşimi incelenmiştir. RGD peptidi, çeşitli hücre dışı matris proteinlerinin bağlanma motifi olduğundan hücre tutunmasını teşvik ettiği için; OSN peptidi de hücre tutunmasından ziyade biyomineralizasyonu desteklediği bilindiğinden kontrol olarak seçilmiştir. Karşılaştırma maksadıyla paralel çalışmalar, benzer platformlar kullanılarak hücre kültür ortamında da gerçekleştirilmiştir. Tezin ilk kısmı tek aşamada oluşturulacak bir YLM platformu tasarlamak üzerine odaklanmaktadır. Polar yüzeyli lipozomların, muamele edilmemiş, hidrofobik altın yüzeyler ile etkileşime girmemesi nedeniyle, altın kaplı sensörler üzerinde yapılan model lipid membran çalışmalarının çoğunda lipozomların kırılıp-parçalanması ve lipid membran oluşumunu başlatması için çeşitli yüzey-modifikasyon stratejileri kullanılır. Tezin bu bölümünde, altın sensör yüzeyler üzerinde ayrıca bir modifikasyona gerek kalmadan, fosfatidilkolin temelli lipozomlara thiol-modifiye bir fosfolipid olan 1,2-Dipalmitoyl-sn-Glisero-3-Phosphothioethanol (DPPTE) dâhil edilerek YLM oluşturulması amaçlandı. Farklı DPPTE oran (% 0,01 ila % 100 mol/mol) ve çaplarında lipozomların bağlanma kinetikleri QCM-D ile izlendi. Sonuçların yorumlanması için iki rijit (...) ve iki viskoelastik (...) katman referans olarak kullanıldı. Viskoelastisite derecesi olarak değerlendirilen, frekans değişikliği başına düşen disipasyon değişimi, yani akustik oranın, DPPTE varlığında önemli ölçüde düştüğü gözlemlendi (yassılaşmış PC lipozomlar için 162,3 GHz-1 iken, % 100 DPPTE içeren lipozomlar için yaklaşık 89,5 GHz-1). YLM platformunun niteliğini değerlendirmek için, kuvartz kristal mikroterazi verilerine ek olarak yüzey plasmon spektroskopisi sonuçları da kullanıldı. QCM-D katmanlardaki su oranına da hassas iken, SPRnin su oranından bağımsız sonuçlar vermesi iki tekniğin sonuçlarının karşılaştırılarak daha gerçekçi yorumlar yapılmasına olanak sağladı. Optimum tiyollü-lipid oranı (% 1, daha düşük tiyol oranı ve daha yüksek rijitlik) ile elde edilen veriler, viskoelastik modelleme yoluyla yüzeydeki kuru-lipid miktarını, katman içi su miktarını ve kalınlık değerlerini hesaplamak için kullanıldı. Yüzey karakterizasyonu çalışmaları ek olarak AFM kullanılarak yüksek uzaysal çözünürlük ile gerçekleştirildi. Sonuçlar, model membranın minimum defektlerle neredeyse bütün/kesintisiz olduğunu, ancak kısmen kaynaşmış lipozom / üst üste gelmiş kimi lipid membran katmanları / çoklu lipid katman adacıkları nedeniyle de ideal bir lipid membrana kıyasla daha fazla disipasyona sahip olduğunu göstermiştir. Lipid membrandaki bu bölgesel yükseltiler membranın düzlemselliği kısmen bozarak genel membran kalınlığının ~ 7.0 nm'ye yükselmesine neden olmuştur. Buna rağmen tek aşamada altın üzerinde YLZ oluşturulması başarılı bir biçimde gerçekleştirilmiştir. Tezin ikinci bölümünde, QCM-D sistemi kullanılarak hücre - yüzey etkileşimlerinin nasıl gerçek zamanlı takip edileceği ve ne gibi değerlendirmeler yapılabileceği konusunda önçalışmalar yürütülmesi amaçlandı. Bunun için YLZ sistemi kullanılmadan değişik yüzeyler hazırlandı ve hücreler ile 18 saatlik etkileşimleri takip edilerek sinyal değişiklikleri yorumlandı. İlk olarak, insan fetal osteoblastik kemik (hfOB) hücre hattının dinamik tutunma davranışı, referans substratlar olarak, muamele edilmemiş hidrofobik ve hidrofilik kılınmış altın sensör yüzeyler üzerinde izlendi. Değerlendirmeyi kolaylaştırmak için hücre tutunması ışık mikroskopisi altında da gözlemlenerek sonuçlar karşılaştırıldı. Hücrelerin hidrofilik altın yüzeylerde yüzey temas alanlarını daha fazla arttırıp daha fazla yayıldığı görülmüştür. Ayrıca hücre dışı matrisin yeniden biçimlenmesi ile ilişkilendirilen hücre-yüzey arayüzünde artan rijitlik bu yüzeylerde daha yüksek gözlemlenmiştir. Bu önçalışmadan sonra, tutunma kuvveti ve kinetiği, hücre tutucu (poli-L-lisin ve fibronektin) ve itici (sığır serum albümin) yüzeyler üzerinde de karakterize edildi. Sonuçlar, protein aracılı özgül etkileşimlerin frekans değişiminden (Δf) çok disipasyonda (ΔD) veya akustik oranda (ΔD / Δf) değişime katkıda bulunduğunu gösterdi. Son olarak, QCM-D'nin sağlıklı ve kanserli hücreleri ayırt etme potansiyeli, hfOB hücrelerinin ve SaOS-2 (osteosarkom) kanserli hücrelerin sonuçları ile karşılaştırarak değerlendirildi. Kanserli hücrelerin referans yüzeylerle daha güçlü etkileştiği ve sağlıklı hücrelere göre daha fazla viskoelastik karakteristik gösterdiği gözlemlendi. Tezin son bölümünde, YLM'lerin RGD ve OSN ile işlevselleştirilmesi ve bu sistemlerin hücreler ile etkileşimlerinin QCM-D ile incelenmesi amaçlanmıştır. Bunun için ilk olarak, lipid membranların stabilitesi çeşitli ortam koşullarında belirlendi. PBS içerisinde, membranın yapısal bütünlüğünün beşinci güne kadar korunduğu gözlenirken, serumlu besiyeri ortamında ilk günden itibaren delikler oluşmaya başlamış, sayı ve boyutları zamanla artmıştır. Farklı lipidlerle (kolesterol, PS, DOTAP) zenginleştirilmiş YLM'lerin saf PC-YLM'a göre stabiliteleri artmıştır. Yapay lipid membranın yanal hareketliliği de FRAP yöntemi ile gösterildi. YLM'nin hem stabilite hem de akışkanlık karakterizasyonundan sonra, YLM yüzeylere peptit bağlanma kinetiği incelenerek altın yüzeylerine spesifik olmayan adsorpsiyonları ile karşılaştırıldı ve oluşan katmanların özellikleri QCM-D ile analiz edildi. Sonuçlar, YLM'ye konjüge edilmiş peptidlerin, pasif adsorpsiyonla yüzeye bağlanmışlara kıyasla daha yüksek yapısal esneklik taşıdığını gösterdi. Hücreler bu yüzeylerle inkübe edildiğinde, YLM platformlarındaki düşük yoğunluğa sahip hareketli RGD peptidlerin biyolojik aktivitelerini korudukları ve altın yüzeylerdeki yüksek sayıda hareketsiz peptitten daha etkili şekilde hücre adezyonunu arttırdığı görüldü. RGD-fYLM yüzeylerinde gözlenen hücre bağlanması ve yayılması, hücre kültüründe de doğrulanmıştır. Yalın YLM yüzeyine sınırlı sayıda hücre tutunmuş ve yuvarlak morfolojide kalmıştır. Hücreler OSN-kaplı yüzeylerde iyi yayılma göstermemiştir. Ölçülen yüksek akustik oranın hücrelerin spesifik tutunmasından kaynaklanmadığı, bunun yerine OSN'nin negatif yükü sayesinde yüzeye bağlanan proteinlerden kaynaklanan bir artış olduğu düşünülmüştür. Tez kapsamında esas olarak protein ve hücre tutunmasına dirençli olan YLM yüzeyleri başarılı bir şekilde işlevselleştirilmiş ve oluşturulan fYLM platformlarının, özgül hücre-yüzey etkileşimlerinin QCM-D aracılığıyla gerçek zamanlı ve işaretleme olmaksızın takip edilme potansiyeline sahip olduğu görülmüştür.