İmplant yüzeylerinde biyofilm oluşumunun engellenmesine yönelik furanon türevlerinin kovalent immobilizasyonu

Biyofilm, yüzeye bağlı mikroorganizmalar tarafından oluşturulan, Ekstraselüler Polimer Matriks (EPS) ile çevrelenmiş bir yapıdır. Endüstriyel ve biyomedikal uygulamalarda kontrolsüz ve istenmeyen bölgelerde oluşan biyofilme bağlı hücre agregatları bu uygulamalarda ciddi ekonomik sorunlara neden olmaktadır. Endüstriyel sistemlerde biyofilm oluşumuna, dental yüzeyler, gıda endüstrisindeki üretim bandındaki kontaminasyonlar ve havalandırma sistemleri gibi birbirinden çok farklı sistemlerde sıklıkla karşılaşılmaktadır. Biyofilm oluşumunun insan sağlığı ile ilgili alanlarda yapılan çalışmalar genel olarak su sistemleri, dişçilik, protez ve implantlar üzerine yoğunlaşmaktadır. Biyofilm kaynaklı insan sağlığı problemleri, içme suyu kalitesindeki düşüş ve enerji üretim verimliliği gibi birçok konuda biyofilm oluşumunun verdiği hasarların maliyeti milyar dolarları bulmaktadır. Biyofilm oluşumuna bağlı genel sorunlar toplumlarda ciddi sağlık riski teşkil etmektedir. Hastane ortamına bağlı enfeksiyonlar, mide bağırsak enfeksiyonları, kulak, göz hastalıkları, biyofilme bağlı enfeksiyon risklerinin başında gelmektedir. Hem insan ve toplum sağlığı hem de ekonomik açıdan yaratmış olduğu zararlı etkileri nedeniyle, yüzey üzerinde mikrobiyal birikimi engelleyebilecek veya en azından büyümesini ve yayılmasını durdurabilecek yöntemlerin geliştirilmesine yönelik çalışmalar son yıllarda yoğun olarak yürütülmektedir. Doğada biyofilmi oluşturan mikroorganizmalar, salgıladıkları ekstrasellüler polimer matriks ile sarılıdırlar ve bu matriks, çevresel koşullardaki değişimlere karşı biyofilm yapısı içindeki mikroorganizmaları koruyucu bir katman görevi üstlenmektedir. Aynı zamanda bu katman toksik kimyasalların ve antibiyotiklerin geçişini engelleyerek biyofilm yapısındaki mikroorganizmalara koruyucu bir katman görevi görür. Hücre katmanları arasında bulunan kanallar, biyofilmin gelişmesinde hayati öneme sahiptir. Mikroorganizmalar ihtiyaç duydukları besinlere ve oksijene bu kanallar sayesinde erişirken, atıkların ve ikincil metabolitlerin uzaklaştırılması da yine kanallar ile gerçekleşir. Ayrıca mikroorganizmaların iletişim amaçlı kullandığı sinyal moleküllerinin iletimi bu kanallar üzerinden gerçekleşir. Enfeksiyon riskine karşı biyomedikal alanda biyosidal etkiye sahip antibiyotiklerin uzun süreli kullanımı, zaman içinde patojen mikroorganizmaların bu kimyasallara karşı direnç kazanmasına ve antibiyotiklerin biyofilm oluşumunu engellemede etkisiz kalmasına neden olmaktadır. Biyofilm oluşumunda mikroorganizmalar arasında iletişimi sağlamak amacıyla Açil Homoserin Lakton (AHL), sinyal molekülü olarak kullanılmaktadır. Bu molekül, biyofilmi oluşturan mikroorganizmalarca sentezlenerek hücre dışına salınmaktadır.AHL, diğer mikroorganizmaların hücre duvarında bulunan sinyal reseptörlerince algılanır ve antibiyotik direnç genleri, virülans faktörleri gibi çeşitli genetik elementlerinxxiv ekspresyonunu aktive eder. Bu iletişim sistemi literatürde "Quorum sensing" olarak adlandırılmaktadır. İletişim yolağının bloke edilmesine ise "Quorum quenching" adı verilmektedir ve mikroorganizmaların enfeksiyon ve koloni oluşumunun engellenmesinde hayati öneme sahiptir. Bu çalışmada antibiyotiklerin etki mekanizmasından farklı olarak AHL sinyal yolizinin bloke edilerek, mikroorganizmaların yüzey üzerinde koloni oluşumunun engellenmesi hedeflenmiştir. Sinyal yolizinin ve biyofilm oluşumunun engellenmesi maksadıyla, AHL molekülünün analogları olan halojenlenmiş furanonlar kullanılmıştır. AHL analogları 5-(dibromomethylene)-3-methylfuran-2(5H)-one (FU1 olarak isimlendirildi), 3-(bromomethyl)-5-(dibromomethylene) furan-2(5H)-one (FU2 olarak isimlendirildi), (Z-)-4-Bromo-5-(bromomethylene)-2(5H)-furanone (4Z olarak isimlendirildi), 5-(Bromomethylene)-2(5H)-furanone (2(5H) olarak isimlendirildi) halojenlenmiş furanonlar solüsyon içinde, herhangi bir yüzeye kovalent veya nonkovalent bağ ile bağlı olmadan yapılan çalışmalarda biyofilm oluşumunu engellemede etkin olduklarını göstermişlerdir. Bu çalışmada yüzeye kovalent olarak bağlanan moleküllerin biyofilm oluşumunu engellemedeki etkisi incelenmiştir. Aynı zamanda yüzeye kovalent bağlı furanonun varlığında antibiyotiklerin biyofilm oluşumunu engellemedeki etkileri de incelenmiştir. Bu çalışmanın amacı, mikroorganizmaların endüstriyel ve özellikle tıbbi alanlarda sıkça kullanılan yüzeylerde biyofilm oluşumunun engellenmesi için furanon türevleri ile kaplı yüzeyler geliştirmektir. Medikal cihaz ve implant yüzeyleri mikrobiyal kontaminasyona ve buna bağlı enfeksiyon oluşum riski barındırmaktadırlar. Biyofilm engellemesine yönelik bugüne kadar yapılan çalışmalar da dikkate alınarak, yüzey üzerindeki oluşumu engellemek üzere, biyofilm oluşumunda büyük öneme sahip "quorum sensing" sinyal yolizini bloke ettiği bilinen halojenlenmiş furanonların farklı türevleri yüzeye kovalent olarak bağlanmıştır. Solüsyon içinde çözünmüş halde furanon türevlerinin patojen mikroorganizmaların biyofilm oluşumunu engellediği daha önce yapılan çalışmalarda kanıtlanmıştır. Bu çalışmada halojenlenmiş furanon türevlerinin kaplama malzemesi olarak kullanımının, Pseudomonas aeruginosa'nın yüzeye bağlanması üzerine etkisi incelenecektir. Pseudomonas aeruginosa fırsatçı patojeni biyofilm oluşturduğu bilinen ve biyofilm çalışmalarında model olarak kullanılan gram-negatif bir mikroorganizmadır. Geliştirilen yüzeyin, kateter, implant gibi medikal yüzeylerde ve endüstriyel sistemlerde uygulanarak uzun ömürlü koruma sağlanması hedeflenmektedir. Furanon moleküllerinin yüzeye bağlanmasında sol-jel yöntemi kullanılmıştır. SolJel'in serbest hidroksit grubuna karbodiimid reaksiyonu ile poliakrilik asit bağlanmıştır. Azid-nitren reaksiyonu ile yüzey üzerinde furanonun bağlanabileceği serbest nitren grupları oluşturulmuştur. Nitren gruplarına furanon, UV ışık altında fotokimyasal yöntemler kullanılarak bağlanmıştır. Yüzey kimyasında değişim, moleküllerin yüzeye bağlanışı ve yüzey morfolojisi AFM, FTIR ve SEM ile analiz edilmiştir. Bu çalışmada furanon molekülleri başarılı bir şekilde yüzeye kovalent olarak bağlanmıştır. AFM ve SEM çalışmaları ile kaplama çalışmalarındaki her aşamada morfolojik değişim görüntülenmiştir. FTIR çalışmaları ile elde edilen bulgular AFM ve SEM ile elde edilen görüntüleri doğrular niteliktedir. Yüzeye PAA bağlanmasından sonra yüzey pürüzlülüğü 2,059 ± 0,05nm'den 6,821 ± 0,5nm değerine çıkmıştır. Yüzey pürüzlülüğündeki değişim CFU sayımlarını da etkilemiştir. CFU sayımları ve CSLM görüntülemeleri FU1 ve FU2'nin biyofilm oluşumunu engellemedeki etkinliğini doğrular niteliktedir. FU2 molekülünün, FU1'e göre daha etkin olduğu gözlemlenmiştir. AZA bağlı yüzeyle karşılaştırıldığında FU2 bakteriyel bağlanmayı % 76 oranında azaltırken FU1 bağlanmayı % 60 oranında azaltmıştır. 4- Z and 2-5(H) bağlı yüzeylerin biofilm oluşumunu engellemeye yönelik bir etkinliği olmadığı tespit edilmiştir. FU2'nin toplam bakteriyel yükü AZA örneğinden 4 kat SS-SC örneğinden 5 kat daha az olduğu tespit edilmiştir. Tobramisin furanon türevleri ile birlikte kullanıldığında yüzeye bağlı bakteri miktarını tobramisin kullanılmayan örneklerle (FU2 için % 78,9 oranında, FU1 için %65.4 oranında) karşılaştırıldığında FU2 için % 96,7 oranında FU1 için %79,4 oranında azalttığı tespit edilmiştir. Furanon bağlı yüzeyler yabancı cisim enfeksiyon modeli kullanılarak in vivo test edilmiştir. Deney farelerinin % 68'inin 24. saatten önce öldüğü ve furanon kaplı yüzeyler CFU sayımının kontrol yüzeylere göre daha yüksek olduğu belirlenmiştir. eDNA konsantrasyonu ve CFU sayımı arasındaki ilişkiye de bu çalışma ile bakılmıştır ve eDNA miktarının CFU sayımı ile orantılı olarak değiştiği saptanmıştır. Bu proje ITU-Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü ve İtalya'daki Chimica del Riconoscimento Molecolare, CNR, araştırma grubunun işbirliği ile gerçekleştirilmiştir. İtalya'da görevli grup yüzey kaplamalarının ve biofilm örneklerinin ATR-FTIR görüntülenmesinde görev almıştır. Çelik yüzey üzerine kovalent bağlama çalışmaları CNR grubu tarafından yapılmıştır. Arçelik A.Ş. araştırmacılara burs sağlayarak kısmi olarak katkıda bulunmuştur. CSLM deneyleri ve hayvanlarla gerçekleştirilen deneyler Kopenhag Üniversitesi Danimarka'da gerçekleştirilmiştir.