Re-establishment of fertilization competency of the oocyte via CRISPR/DCAS9 epigenome edıtıon technology

Kadın ve erkek infertilitesi günümüz dünyasının en başta gelen önemli problemlerinden biridir. Infertilite sebepleri arasında sayılan çevresel ve genetik faktörler birçok araştırmaya konu olmaktadır. Melamin, endüstride çok sıklıkla yapıştırıcıların hammaddesi olarak, lamine yüzeyleri ve gereçleri kaplamak amacıyla kullanılan ve infertiliteye sebep olabilecek çevresel faktörler arasında sayılan bir malzemedir. Melamin, süt ürünlerine eklendiğinde nitrojen içeriği sebebiyle yanlış protein artışlarına sebep olabilmektedir. Bunun yanısıra, kimyasal melamine uzun süre maruz kalınması, yenidoğanlarda karaciğer, böbrek ve fertilite problemlerine neden olmaktadır. Oosit kalitesini düşürmesi sebebiyle kadınlarda infertiliteye sebebiyet verdiği gösterilmiştir. Son zamanlarda melaminin, sperm IZUMO1 reseptörü olarak tanımlanan JUNO ekspresyonunu baskıladığı da yapılan araştırmalarca ispatlanmıştır. JUNO'nun döllenme için gerekli ve JUNO hasarı olan farelerin infertil olmasına bağlı olarak, melaminin fertilite üzerindeki etkisinin JUNO baskılanması ile ilişkili olduğu öne sürülmüştür.Bu projede bu ilişkiyi araştırmak ve potansiyel klinik bir yaklaşım geliştirmek amacıyla, oositlerde çevresel faktör kaynaklı infertilite modeli oluşturmak ve CRISPR/dCas9 aktivasyon sistemlerini kullanarak döllenme kapasitesini eski haline getirmek amaçlanmıştır. Bu amaç doğrultusunda, ilk olarak CRISPR/dCas9 SAM ve Tet1 sistemleri kullanılarak HEK293T hücrelerinde JUNO genini aktive edilmiştir. SAM sistemi kullanılarak JUNO gen ekspresyonunda 200 kat artış sağlandığı qPCR ile gösterilmiştir. Fare spermlerinin, JUNO proteininin sperm bağlama kapasitesini ve yaklaşımımızın potansiyelini doğrular şekilde, JUNO ile aktive olan HEK293T hücrelerine bağlandığı gösterilmiştir. Stratejimizin klinik potansiyelini test etmek amacıyla, bastırılmış JUNO ekspresyonuna sahip fare modeliyle melamin, sham ve kontrol gavaj olmak üzere 3 farklı deney grubu oluşturulmuştur. Farelere her iki günde bir sonda ile 50 mg/kg melamin verilmiştir. Üç haftalık tedaviden sonra, melamine maruz kalan oositlerde JUNO ekspresyonunda önemli bir azalma olduğu gösterilmiştir. Bunun yanısıra, melaminin toplam oosit sayısını azalttığı, atretik foliküllerin sayısını arttırdığı ve JUNO ekspresyonunu granulosa hücrelerinde azalttığı gösterilmiştir. Yaklaşımımızın tedavisel potansiyelini göstermek amacıyla, JUNO ekspresyonu azaltılmış olan oositlere dCas9 bazlı aktivatör proteinler ve kopyalanan gRNA mikroenjeksiyon metoduyla verilmiştir. qPCR ve IF yöntemleri kullanılarak, JUNO ekspresyonunun oositlerde tekrar arttığı gösterilmiştir. Fertilizasyon testi kullanılarak melamin uygulanmış oositlerde 2 hücreli embriyo oranı %46 olarak bulunurken, melamin uygulanmış ve dCas9 bazlı aktivatör enjekte edilmiş oositlerde bu oran %76'ya çıkmıştır. Sonuçların tümüne bakıldığında başarılı bir infertilite modeli oluşturulduğu ve CRISPR/dCas9 aktivasyon sistemlerini kullanarak oositlerin döllenme kapasitesini geri kazandırılabildiği gösterilmiştir. Bu çalışma, farklı infertilite problemlerinin üstesinden gelmek için uygulanabilecek özgün bir yaklaşım önermektedir.