Covid-19 hastalığında sitokin fırtınasını tedavi etmek üzere yeni IL-1 reseptör antagonist geliştirilmesi

Covid-19 hastalığının en ölümcül sonuçlarından biri akut solunum sıkıntısı sendromudur (ARDS). SARS-CoV-2 virüsüyle enfeksiyon olunması sonucu aşırı aktifleşen bağışıklık sistemi, "sitokin fırtınası" denilen, interlökinlerin de dahil olduğu yüksek miktarda ani sitokin salımına sebep olur. İnterlökin-1β (IL-1β), inflamatuvar hastalıklarda sitokin fırtınasına sebep olan en önemli sitokinlerin başında gelmektedir. Bu nedenle IL-1β'nın uyardığı yolağı baskılamak umut vadeden bir tedavi yolu olarak görülmektedir. Vücutta üretilen interlökin-1 reseptör antagonisti (IL-1Ra) de IL-1β ile aynı reseptöre bağlanarak bu yolağı inhibe eder. Piyasada anakinra ismiyle satılmakta olan FDA onaylı rekombinan IL-1Ra proteini de, inflamatuvar tepkiyi azaltmak amacıyla, romatizmal eklem iltihabı, tip 2 diyabet ve ailevi Akdeniz ateşi gibi otoinflamatuvar hastalıkların tedavisinde 2001'den beri kullanılmaktadır. Bu nedenle, Covid-19 hastaları üzerinde de klinik çalışmalarda kullanılmış ve sitokin fırtınasını baskılayıcı rolü sayesinde Covid-19 tedavisinde önemli bir potansiyele sahip olduğu gösterilmiştir. Bu tezin ilk kısmında, iki yeni IL-1Ra rekombinan proteinlerinin in vitro karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir. Bu rekombinan proteinler, Dr. Cem Albayrak'ın ve Dr. Serdar Uysal'ın grupları tarafından Türkiye'de satışı olmayan anakinraya yerli alternatif olarak üretilmiştir. Tezin bu kısmında ürünlerin biyoaktivitesi ve hücre canlılığı üzerindeki etkisi araştırılmıştır. Biyoaktivitelerinin belirlenmesi amacıyla, genetik olarak değiştirilmiş HEK-Blue hücreleri kullanılarak proteinlerin, IL-1β uyarımı ile sentezlenen SEAP miktarı üzerindeki etkisi QUANTI-Blue ajanı kullanılarak ölçülmüş ve IC50 değeri hesaplanmıştır. Ayrıca IL-1Ra-His6'nın, IL-1β ile uyarılmış MRC-5 akciğer fibroblast hücre hattının IL-6 üretimini inhibe etmesi ELISA kullanılarak gösterilmiştir. Son olarak, üretilen proteinlerin HEK293T ve MRC-5 hücrelerinin canlılığı üzerindeki etkisi CTG tayin kiti kullanılarak belirlenmiştir. Kitosan, biyouyumluluğu, biyobozunabilirliği, mukoz yapışma özelliği ve bağışıklık sistemini düşük seviyede uyarması açısından en umut vadeden biyomalzemelerden biri olmuştur. Bu özellikleri sayesinde kitosan, yara iyileştirme, doku mühendisliği ve gen/ilaç dağıtımı gibi biyomedikal uygulamalarda kullanılmak için mükemmel bir aday haline gelmiştir. Kitosanın potansiyeli, nanopartikül bazlı dağıtım sistemlerinde kullanılması ile, özellikle de yüksek miktarda genetik materyal taşıyabilirliği sayesinde daha da artmıştır. Tezin ikinci kısmında, TRAIL hapsedilmiş, PEG bağlanmış kitosan türevi ile sentezlenmiş nanopatiküllerin transfeksiyon ve geçirgenlik arttırma yeterlilikleri araştırılmıştır. Kitosana 5 kDa PEG molekülü bağlanarak fizikokimyasal özellikleri geliştirilmiştir. Ardından tümör nekroz faktörü (TNF) α-aracılı apoptoz-indükleyen ligand (TRAIL) yerleştirilmiş plazmid DNA, PEG bağlanmış kitosan ve TPP çapraz bağlama ajanı kullanılarak sentezlenen nanoparçacıkların içine hapsedilmiştir. Sentezlenen nanoparçacıklar, taramalı elektron mikroskopisi kullanılarak karakterize edilmiştir. Ayrıca TRAIL hapsedilmiş nanoparçacıklar 3 farklı gliyoblastom (GBM) hücre hattı (A172, LN18, T98G) üzerine verilmiş ve transfeksiyon etkinlikleri deneysel olarak akış sitometrisi kullanılarak araştırılmıştır. Nanopartiküllerin geçirgenlik arttırma yeterliliklerini belirlemek amacıyla Calu-3 epitel hücreleri kullanılmış ve transepitel elektriksel direnç değişimi ölçülmüştür.