Non-melanom cilt kanseri tedavisi için JAK1 sİRNA aracılı nanoterapötiklerin geliştirilmesi

Non-melanom cilt kanseri, henüz etkili tedavisi olmayan en yaygın kanser tiplerinden biridir. Uzun süre ve yüksek dozda uygulanan kemoterapötik ilaç tedavisi sonrasında görülen yan etkiler ve ilaçlara karşı kazanılan direnç nedeniyle bu sorunların aşılması ve düşük doz kullanımı ile daha etkin tedavi sağlanması için farklı girişimlerde bulunulmuştur. Bununla birlikte gen tedavisindeki başarılı sonuçlar ve ilerlemeler; gen susturma ve ilaç uygulamasının kanser tedavisinde ilaç/ilaç kombinasyon tedavilerine göre daha iyi bir yaklaşım olabileceği düşünülmektedir. Bu çalışma kapsamında, potansiyel siRNA aracılı terapötiklere olan ilgi göz önünde bulundurularak, hem JAK1 siRNA hem de 5-Fluorourasilin (5-FU) hedef dokuya taşınması amacıyla kombine lipozom formülasyonları geliştirilerek non-melanom cilt kanserinde terapötik etkinliği araştırılmıştır. Bu amaçla, sitotoksik bir kemoterapötik ajan olan 5-Florourasil (5-FU) ve/veya JAK1 (Janus kinaz 1) siRNA içeren farklı nanolipozom formülasyonları hazırlanarak boyut, polidispersite, zeta potansiyeli, morfoloji, enkapsülasyon etkinliği, sitotoksite ve stabilite açısından değerlendirilmiştir. Hazırlanan lipozom nanoformülasyonların boyutları 80-120 nm arasında olup PDI değeri ise 0.3'ün altında bulunarak homojen bir dağılım gösterdiği gözlenmiştir. Aynı zamanda hazırlanan lipozom formülasyonların 3 ay boyunca stabilitelerini korudukları tespit edilmiştir. Pozitif zeta potansiyel değerlerine sahip lipozomal nanoformülasyonların hücre içine kolaylıkla geçtiği izlenmiştir. 6-FAM veya cy5 işaretli siRNA içeren lipozomların inkübasyondan sonraki 30 dakika içinde hücre içine girdiği ve A-431 hücrelerinde uzun süre kaldığı floresan ve konfokal mikroskop ile gözlenmiştir. Hidrofilik bir aktif madde olan 5-FU'nun nanolipozomlara yüklenmesi, farklı ilaç/lipit oranlarında gerçekleştirilmiştir. 0.2 ilaç/lipid oranında en yüksek enkapülasyon etkinliği görülmüştür. Hazırlanan lipozomlardan 5-FU'nun ilk 2 saatte hızlı salımı gerçekleşerek daha sonra platoya ulaştığı ve birinci dereceden kinetik modele uyumlu salım profili sergilediği gözlenmiştir. Nanolipozom formülasyonların toksisiteleri değerlendirildiğinde; hücrelerin 24 saat inkübasyondan sonra 5x103 µg/mL'ye kadar tedavi konsantrasyonları için % 80'in üzerinde canlılıklarını korudukları görülmüştür. Uzun süreli inkübasyonda ise hücre canlılığının 5x103 µg/mL konsantrasyonda % 70'e düştüğü gözlenmiştir. 5-FU içeren nanolipozom formülasyonlarında 5 µM ve üzeri 5-FU konsantrasyonunda 24 saat inkübasyondan sonra hücre canlılığında önemli bir azalma ile sonuçlanmıştır (p<0.05). JAK1 mRNA ekspresyonunun değerlendirilmesi için RT-qPCR ve protein ekspresyonu için ise Western Blot analizi kullanılmıştır. Elde edilen sonuçlarda; JAK1 siRNA yüklü nanolipozomların başarılı bir şekilde A-431 hücrelerinin içine girdiği, hücre içerisinde uzun süre kaldığı ve JAK1 mRNA ekspresyon seviyesini % 50 oranında azalttığı gösterilmiştir. Benzer şekilde, JAK1 siRNA nanolipozomları ile tedaviden sonra JAK1 protein seviyesinde azaldıği gözlenmiştir. İn vitro gen susturma çalışmalarının tamamlanmasından sonra geliştirilen nanolipozom formülasyonlarının antitumoral etkinliği in vivo çalışmalar ile değerlendirilmiştir. Bu amaçla farelerin sağ yan bölgesine 1X106 A-431 hücre inokülasyonu ile tümör modeli oluşturulmuş ve tümör hacmi yaklaşık 50-100 mm3'e ulaştıktan sonra 5-FU veya JAK1 içeren nanolipozom formülasyonlarının intratümoral olarak uygulanmıştır. 5-FU, JAK1 siRNA veya her ikisini de içeren kombine nanolipozom formülasyonlarının kontrol grubuna kıyasla tümör hacmi artışının önemli ölçüde azaldığı görülmüştür (p<0.05). 28 günlük tedaviden sonra, tümör inhibisyon oranı yaklaşık % 80 olarak hesaplanmıştır. Tedavi gruplarında daha az tümör alanı gözlemlenmesinin yanısıra, 5-FU veya siRNA içeren gruplarda JAK1, ERK, AKT, pAKT, pERK protein ekspresyonlarının azaldığı gözlenmiştir. Ayrıca JAK1 siRNA yüklü nanoterapötiklerin in vivo'da güçlü bir şekilde apoptozu indüklediği görülmüştür. Bu bulgulara dayanarak, JAK1 siRNA ve 5-FU ile geliştirilen kombine lipozom nanoformülasyonlarının, non-melanom cilt kanserinin tedavisi için potansiyel bir nanoterapötik yaklaşım olacağı düşünülmektedir. Anahtar Kelimeler: nanoterapötikler, lipozom, JAK1 siRNA, 5-FU, gen susturma, tümör inhibisyonu