Biyomühendislik Anabilim Dalı

Bioactivity test and cell studies of bioceramics produced from Clinocardium ciliatum and Turritella terebra

Hydroxyapatite and tricalcium phosphate are used in field of drug delivery and bone regeneration due to their high biocompability behaviours. Hydroxyapatite was examined since it is dispersed in a organic matrix of composite structure of bone. Hydroxyapatite and TCP have the ability to accelarate bone growth around the implant. Highly porous TCP exhibits excellent behaviour as bone implant since it dissolves after replaced by bone. Natural bioceramics can be obtained from different sources such as bone and sea shells. Most of marine structures contains calcium carbonate (calcite or aragonite) and they can be easily converted to bioceramic material. In this study calcium phosphate nanoceramics obtained via mechanochemical method using the sea shell Clinocardium ciliatum and sea snail Turritella Terebra as a calcium source. The characteristics of the calcium phosphate ceramics that produced from two different sources were studied in two different sintering temperature: 1000 °C and 1200 °C. The characterization of the produced materials were carried out via FT-IR, SEM, BET, XRD analysis. Biodegradability test in TRIS fluid and bioactivity tests were performed for the produced materials. Fast hydroxyapatite formation occurred when the materials were immersed in simulated body fluid and proliferation of cells in cytotoxicity test was registered. As a result, hydroxyapatite, β-TCP and α-TCP were produced and their biodegradability and bioactivity behaviors were determined.

Characterisation of immobilised Geobacillus stearothermophilus L-arabinose isomerase

The L-arabinose isomerase from Geobacillus stearothermophilus was studied for the production of D-tagatose, a low-calorie bulk sweetener. Industrially, D-tagatose is only produced in a chemical way. However, a lot of waste and by-products are formed in this way. A biological synthesis of D-tagatose is not yet commercially available. In this work first, L-arabinose isomerase was intracellularly expressed in E. coli. The enzyme was isolated and purified. Hereby, three different L-arabinose isomerase fractions were obtained, namely the intracellular enzyme, crude extract and purified enzyme. This work is first to characterise and compare three different immobilised enzyme fractions from wild type Geobacillus stearothermophilus in a systematic approach. The L-AI activity was determined of the different enzyme fractions obtained during the isolation and purification. The L-AI activity in the intracellular enzyme, crude extract and purified enzyme were 8.55 ± 0.13 U/ml, 7.95 ± 0.03 U/ml and 6.75 ± 0.06 U/ml, respectively. Furthermore, prior to immobilisation, the intracellular enzyme and crude extract were diluted to the same protein concentration as the purified enzyme. The diluted intracellular enzyme, diluted crude extract and purified enzyme were prior to the immobilisation experiment, subjected to a conversion experiment at 60°C and pH 7.0. After 48 hours of incubation, D-tagatose concentrations of 67.2 ± 0.8 g/l, 61.3 ± 3.2 g/l and 68.7 ± 2.2 g/l were found, respectively. Conversion to D-tagatose was proven for all the enzyme fractions. Next, the three enzyme fractions were entrapped in alginate beads and the optimal temperature and pH for the conversion of D-galactose to D-tagatose were determined. Experiments were carried out with temperatures ranging from 50 to 90°C at a pH of 7.0. For the optimal pH, experiments were carried out from pH 5.0 to pH 9.0. The D-tagatose concentrations were determined using cysteine-carbazole method. The different immobilised enzyme fractions showed an optimal temperature of 80°C. After 5 hours of incubation at 80°C and pH 7.0, a D-tagatose concentration of 54.2 ± 0.5 g/l, 27.9 ± 1.2 g/l and 36.1 ± 1.0 g/l was obtained for the diluted intracellular enzyme, diluted crude extract and purified enzyme, respectively. The optimal pH was 6.5 for the different beads. After 5 hours of incubation at 60°C and pH 6.5, a D-tagatose concentration of 23.2 ± 0.3 g/l, 10.5 ± 0.3 g/l and 13.2 ± 0.3 g/l was obtained for diluted intracellular enzyme, diluted crude extract and purified enzyme, respectively. The results within this study revealed that intracellular enzyme, crude extract and purified L-arabinose isomerase entrapped in alginate beads have the same optimal operational conditions for the conversion of D-galactose into D-tagatose. An optimal temperature and pH of 80°C and 6.5 were determined for each fraction individually. These findings will be useful for the biological conversion of D-galactose to D-tagatose. This is a first step of a bigger research to improve the productivity and stability of immobilised L-AI from Geobacillus stearothermophilus for the production of D-tagatose.

Analysis of intra-tumoral heterogeneity in context of tissue specific gene expression with computational approach

Identification of tissue-specific genes is essential for understanding molecular mechanisms. Intra-tumoral heterogeneity as diversity among cells and layers of tissues in only one single tumor limits therapeutic efficacy. Tumor heterogeneity is an important challenge for successful personalized medicine. We aimed to identify tissue-specific genes rigorously for examining intersection between differentially expressed genes (DEG) and tissue specific genes, analyzing cancer gene expressions in terms of tissue specificity, demonstration and interpretation of intra-tumoral heterogeneity, revealing specific molecular targets for tumors and elucidating roles of tissue-specific genes in biological processes. Gene expression, derived from five RNA-Sequencing projects, spanning 96 human tissues were used. Detection of tissue-specific genes not only included tau, but also required integrating of tau and statistical distance. This new method is defined as "extended tau". We investigated intersection of 16 different cancer DEG with specifically expressed genes in corresponding tissue. After that, gene expression data for 11 primary solid tumors, retrieved from The Cancer Genome Atlas (TCGA), were analyzed by integrating our tissue specificity findings. Significant genes obtained after all calculations were functionally annotated for identifying their roles. Consequently, we successfully assigned genes to multiple tissues by extended tau. Then discovered that DEG in a cancer tissue has low overlap with genes specific to that tissue. Most importantly, we identified candidate biomarkers for heterogeneity exhibiting gene expression in cancer tissue although its expression is restricted to unrelated tissue. The genes identified in our study were already shown in literature to be associated with tumor heterogeneity or genetic instability of cancer cells for various cancers. Our results are likely to contribute to the road paved by many researchers trying to understand cancer for many years by bringing the tissue-specific genes into the scene.

Boya duyarlı güneş hücrelerinde kullanılmak üzere doğal boya üretimi

Fosil yakıtların tükenmeye başladığı ve çevresel sorunların giderek arttığı günümüzde, yenilenebilir enerji teknolojileri oldukça önemli bir yere sahiptir. Bu anlamda en temel yenilenebilir enerji kaynaklarından birisi güneştir ve güneş enerjisinin elektrik enerjisine dönüştürülmesinde kullanılan fotovoltaik hücreler (PV) hızla geliştirilmektedir. Boya duyarlı güneş pilleri (DSSCs) çevre dostu ve düşük maliyetli olması sebebiyle üzerinde en çok çalışılan sistemlerdendir. Bu çalışmada DSSC sistemlerin yapıtaşlarından biri olan boya duyarlılaştırıcılar için dört farklı alternatif doğal boya kaynağı üzerinde karşılaştırmalı olarak çalışılmıştır. Böğürtlen (Rubus fructicosus), karadut (Morus nigra), yaban kirazı (Prunus serotina) ve frambuaz (Rubus ideaus) ön işlemden geçirilmesinin ardından 40°C'de 60 dakika ultrasonik banyoda ekstraksiyon işlemine tabi tutulmuştur. İşlem sonrasında elde edilen doğal boya ekstraktları vakumlu filtrasyon ve santrifüj ile içerisindeki meyve partiküllerinden arındırılmıştır. Boyaların, kırmızı renk veren en önemli doğal pigmentlerden biri olan antosiyaninler yönünden hangi pH değerinde daha zengin olduğunu belirleyebilmek amacıyla 5 farklı pH değerinde (1-2-3-4-4,5) çalışılmıştır. Hazırlanan boyaların UV-Visible Spektrofotometre ile analizi gerçekleştirilmiş, doğal boya ekstraktları hem pH yönünden hem de kendi içlerinde sahip oldukları pigment yoğunlukları yönünden karşılaştırılmıştır. Her boya için yoğun antosiyanin absorbsiyonunun 520 nm'de pH 1'de olduğu görülmüştür. Pigment yoğunluklarına göre ise boyalar çoktan aza yaban kirazı, böğürtlen, karadut ve frambuaz olarak sıralanabilmektedir. Aynı zaman da elde edilen doğal boyaların yapısal karakterizasyonu için Fourier Dönüşümlü Kızılötesi Spektroskopisi (FT-IR) ve Raman Spektroskopisi ile de analizleri gerçekleştirilmiştir. Doğal boyaların DSSC sistemlerindeki TiO2 yarıiletkeni yüzeyindeki boyama ve güneş ışığı altındaki solma özelliklerinin incelenmesi için F-katkılı kalay oksit (FTO) ile kaplı transparan cam ve TiO2 karışımı hazırlanmıştır. FTO cam TiO2 kaplanmış ve kaplanan camın TiO2 kısmı ise pH 1'deki dört farklı doğal boya içerisinde 24 saat bekletilmiştir. Boyama özelliklerine göre doğal boyalar sırasıyla; yaban kirazı, böğürtlen, karadut ve frambuaz şeklinde sıralanmıştır. Karadut ve frambuaz oldukça düşük renkler verdiğinden TiO2 yüzeyinde yaklaşık 2 ay kalırken yaban kirazı ve böğürtlen ise yaklaşık 4 ay kalabilmiştir. Sonuç olarak dört meyve arasında incelenen özellikler açısından en iyi sonucu yaban kirazı vermiştir ve DSSC sistemlerinde boya duyarlılaştırıcı olarak ümit veren bir malzemedir.

Bupropion yüklü polilaktik asit ve polilaktik-ko-glikolik asit nanopartiküllerin sentezlenmesi ve kontrollü salımda değerlendirilmesi

Nanopartiküller; boyut olarak hücresel alıma imkan vermeleri, kolay optimize edilebilir olmaları, salım profillerinin kontrol edilebilirliği gibi eşsiz avantajlar sebebiyle ilaç salım sistemlerinde sıklıkla tercih edilmektedir. Doğal polimerlerin, optimizasyon zorlukları nedeniyle yaygın şekilde kullanılamaması, bu alanda sentetik polimerleri daha fazla tercih edilir kılmıştır. Bu çalışmada da sentetik polimerlerden PLGA ve PLA; yüksek biyolojik absorbsiyon kapasitesi, biyouyumluluk, biyobozunurluk, toksik olmama, sürekli ilaç salımına olanak verme ve FDA tarafından onaylanmış polimerler olma gibi önemli avantajları sebebiyle ilaç salım sistemleri olarak belirlenmiştir. Bupropion HCl, sigara bırakma tedavisinde etkin şekilde kullanılan ve etki mekanizması sinir sistemi olan bir dopamin/nöradrenalin geri alım inhibitörüdür. Mevcut ajanlara kıyasla güvenlik ve tolere edilebilirlik avantajları sunan Bupropion HCl çeşitli sinir sistemi hastalıklarının tedavisinde de etki göstermiş bir antidepresan olmakla birlikte günümüzde sigara bırakma tedavisine yönelik kullanılmaktadır. Bu tez çalışmasında istenen özelliklerde üretilen PLGA ve PLA nanopartiküllerine bupropion HCl yüklemesi yapılmıştır. Nanopartiküllerin karakterizasyonu Zeta-Sizer, FT-IR, UV-Vis ve SEM analizleri ile gerçekleştirilmiştir. Bupropion HCl yüklü nanopartiküllerin salım çalışmaları PBS tamponunda kümülatif salım tekniği kullanılarak gerçekleştirilmiştir. İlaç yükleme verimleri ve salım değerleri UV-Vis spektroskopisi ile tayin edilmiştir. Yapılan çalışmalar sonucunda ilaç salımının PLGA nanopartiküllerinden 12. günde, aynı miktarda etken madde (5 mg) yüklü PLA nanopartiküllerinden ise 15. günde %100 e ulaştığı görülmüştür. Her iki polimerik nanopartikülün de ilaç taşıyıcısı olarak kullanımının; kandaki etken madde düzeyini kontrol altında tutarak ilaç alım sıklığını azaltacağı ve bu sayede hasta konforunu artıracağı öngörülmektedir. Hem PLGA hem de PLA nanopartiküllerinin birçok antidepresan ilaç için uzun süreli ve kontrollü salımda bir model olabileceği düşünülmektedir.

Graphene oxide/hydroxyapatite nanocomposite scaffolds for tissue engineering

Tissue engineering (TE) provides the development of supporting and structural skeletal material for the regenerative medicine, the most therapeutic strategy of biomedicine. The scaffold can be used in accordance with the clinical requirements for tissue slits or degeneration. These scaffolds provide the materials necessary for the cells through diffusing the matrix, while the cells also hold onto this structure and grow into their own texture. These scaffolds enable the complex kinematic system in the joint to occur during daily activities, carrying the general mechanical response and motion applied forces of the body, and fulfill the unique mechanical properties of critical biomechanical functions, geometry, attachments and scaffolds. GO's superior properties and biocompatibility give a big potential to TE. Recent research has shown that GO promotes cell proliferation and differentiation depending on the high surface area and activates porous 3-D construction. Also the previous studies proved the mechanical property of the GO. In this study, tissue compatibility of scaffolds and different ratios of GO / HA nanocomposite materials performed. Cell culture tests and material characterization were performed and the results were compared with other literature studies. In this comparison, it was observed that the graphene oxide widened the hydroxyapatite surface area and increased cell proliferation. Sinterization is another effect to supply mechanic support. Some characterization tests were performed to develop produced different ratio GO scaffolds. The TEM analysis confirms the presence of the spherical shape morphology of the prepared hydroxyapatite nanoparticle with the particle size of around 30 to 50 nm but DLS particle size was higher than TEM results. Agglomeration is the reason of this differences. Besides, cell culture and characterization tests point out that the GO supports the cell proliferation cell adhesion with the well compatible features. GO increases the specific surface area and it aids to cell penetration and colonization. Therefore the cell- tissue compatibility and the osteogenesis (bone regeneration) was supplied by our GO-HA nanocomposite scaffolds. 0.5 % and 1% GO included scaffolds have perfect proliferation also, the cells seem very healthy. Dapi, Anti vinculin and Dio-6 tests support this result. On the other hand this study illustrates the increased amount of GO help to cell proliferation.

Akut mide mukoza hasarı üzerine Abelmoschus esculentus L.'nın anti-ülser etkisinin araştırılması

Abelmoschus esculentus L.(Malvaceae), geleneksel Türk tıbbında ülser ve gastrit gibi çeşitli hastalıkların tedavisinde kullanılan tıbbi bir bitkidir. Bu çalışmada, Abelmoschus esculentus (L.) ekstraktının(AEE) etil alkol ile oluşturulan akut mide mukozal hasarı üzerine hayvan modellerinde gastroprotektif etkisi incelenmiştir. Bunun için rat modellerinde etil alkol ile ülser oluşturuldu. 24 saat aç bırakılan ratlara 500 mg/kg, 250 mg/kg, 100 mg/kg Abelmoschus esculentus ekstraktı (AEE); 20 mg/kg famodin (Fam); 75 mg/kg quercetin (Que); etil alkol grubuna 1ml etil alkol ve sham grubuna ise izotonik NaCl eşit hacimlerde gavajla verilmiştir. Bir saat sonra tüm ratlar sakrifiye edilerek, mideleri çıkarılmıştır. Mideler büyük kurvatur boyunca kesilerek açılmış ve serum fizyolojikle yıkanmıştır. Mide mukoza lezyonları ile toplam mide alanı ve lezyon alanı hesaplanarak, ülser alanı/toplam mide alanı ülser indeksi olarak ifade edilmiştir. Oksidatif stresin göstergesi olan malondialdehid (MDA) ve redükte glutatyon (GSH) düzeyleri tam kanda ve dokuda; antioksidan özellik gösteren askorbik asit, serum β-karoten ve retinol serumda; Süperosit dismutaz (SOD), katalaz (CAT), glutatyon peroksidaz (GPx) ise eritrositlerde ölçülmüştür. Mide doku kesitlerinde mukozal ödem, hemoraji, inflamasyon, epitel hücre erozyonu ve interlökinler (IL-6, IL-1β) değerlendirilmiştir. Bioelement seviyeleri ise homojenize edilmiş dokularda incelenmiştir. Akut toksitite araştırması için farelere 100, 250, 500, 1000, 3000 ve 5000 mg/kg AEE dozları uygulanmıştır. Bu araştırmada herhangi bir tosik etki gözlemlenmemiştir. AEE-500, 250, 100, Fam-20 ve Que-75 sırasıyla 81.0, 67.5, 67.0, 76.3 ve 72.4 % ülser oluşumunu inhibe etmiştir. Tüm çalışma gruplarında MDA düzeyleri etil alkol grubu ile karşılaştırıldığında anlamlı olarak azalmıştır (p<0.001). AEE-500 grubunda β-karoten ve retinol düzeyleri sırasıyla anlamlı olarak % 40.2 ve % 45.4 artmıştır. GPx seviyesinin AEE-500 mg/kg uygulanan grupta en yüksek olduğu ve bu değerin sham grubu ile yakın olduğu görülmüştür. AEE-100 ve 500 mg/kg uygulan gruplarda SOD değerleri etil alkol grubuna göre daha yüksektir (p<0.001 ve p<0.01). CAT sonuçları değerlendirildiğinde AEE-250 ve 500 mg/kg grupları etil alkol grubuna göre istatiksel olarak anlamlı bulunmuştur (p<0.01). Antioksidan enzimlere paralel olarak Cu, Zn, Fe, Se ve Ca bioelement seviyeleri de etil alkol grubu ile kıyaslandığında anlamlı bir artış görülmüştür. AEE-500 grubu, etil alkol grubuna kıyasla ödem, kanama ve inflamasyon skorlarını önemli ölçüde azaltmıştır (p<0.05). AEE-500, 250 ve Fam-20 gruplarında apoptoz azalmış (p<0.001) ve etil alkol grubuna kıyasla daha yüksek bir pozitif hücre oluşumu gözlemlenmiştir (p<0.001). Özellikle AEE-500 mg/kg uygulanan gruplarda IL-6, IL-1β seviyelerinin etil alkol grubuna göre önemli derecede azalmıştır. Çalışma sonunda biyokimyasal ve histopatolojik veriler değerlendirildiğinde Abelmoschus esculentus L. ekstraktının (AEE) etil alkolle indüklenen gastrik hasar üzerine gastroprotektif bir etkiye sahip olduğu kanısına varılmıştır.

Bronkopulmoner displazi ile ilişkilendirilen belirli genlerdeki polimorfizmlerin Türk populasyonu üzerinde incelenmesi

Bronkopulmoner displazi (BPD), preterm infantlarda en sık görülen kronik akciğer hastalıklarından biridir. Merkezlerin kronik akciğer hastalığı ve BPD tanımlarının farklılıklarından dolayı BPD insidansı da merkezlere göre değişkenlik gösterse de çoğu Avrupa ülkesine göre, hamileliğin 30. haftasından önce doğan preterm infantların %30'undan fazlasına BPD teşhisi konmaktadır. BPD geliştirme eğilimi olan preterm infantlar, akciğer gelişiminin geç kanaliküler veya erken sakküler evresinde doğarlar ve sonuçta alveol sayıları matür bebeklere göre daha az olur. Günümüzde enflamasyon ve özellikle prematürite ile birlikte alveol gelişimindeki duraklama, sürfaktan eksikliği ve göğüs duvarının olgunlaşmaması BPD'nin en önemli etiyolojik faktörleri olarak görülmektedirler. BPD, genetik ve çevresel faktörlerin (hiperoksi, invazif mekanik ventilasyon ve sepsis) karşılıklı etkileşimi sonucunda meydana gelmektedir. Literatürde BPD riskine etki eden genetik faktörler ikiz çalışmaları, ailesel birikim, genom çapında ilişkilendirme çalışmaları (genome wide association studies, GWAS) ve hedef genlerde tek nükleotid polimorfizmleri (single nucleotide polymorphism, SNP) gibi farklı yaklaşımlar ile araştırılmaktadır. Bu tez çalışmasında, dünyada farklı populasyonlar üzerinde yapılmış çalışmalarda bronkopulmoner displazi (BPD) ile ilişkilendirilmiş bazı SNP'ler seçilerek, Türk populasyonunda da bu SNP allel ve genotip frekanslarının görülüp görülmediğinin multipleks reaksiyonlar ve MALDI-TOF kütle spektrometrisi yöntemi ile belirlenmiştir. Elde edilen veriler ayrıca hastaların klinik ve demografik bilgileri ile de karşılaştırılarak anlamlı bir ilişki kurulmaya çalışılmış ve BPD'nin Türk toplumuna özgü genetik tabanının anlaşılabilmesine katkıda bulunulması amaçlanmıştır. 96'sı BPD hastası, toplam 192 prematüre infanttan toplanan kan örneklerinden genotiplenen 45 SNP bölgesi arasından rs11003125, rs2233406, rs3138053, rs55716084 ve rs62468577 polimorfizmlerinin allel düzeyinde; rs4883955, rs833061 ve rs9953270 polimorfizmlerinin ise hem allel hem de genotip düzeyinde Türk populasyonunda BPD insidansı ile istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki içerisinde olduğu saptanmıştır. Bununla birlikte hastalardan toplanan klinik ve demografik verilerin araştırılan SNP'ler ile olan ilişkileri incelendiğinde ise pek çok polimorfizmin ailede görülen kronik akciğer, zatürre, BPD, RDS ve sigara kullanımı öyküsü ile anlamlı bir ilişki içerisinde olduğu bulunmuştur. Sonuç olarak bu tez çalışması ile toplumumuz için ilk kez BPD hastalığının genetik altyapısının araştırılması amacıyla çoklu polimorfizm bölgeleri yüksek doğruluk ile genotiplenerek BPD insidansı ile ilişkileri ortaya konmuştur.

Yeşil sentez ile elde edilen metal nanopartiküllerin antimikrobiyal ve antibiyofilm etkinliklerinin değerlendirilmesi

Nanoteknoloji alanındaki son gelişmeler, nano boyuttaki yapıların artan yüzey alanı ve sahip oldukları birçok farklı özellik nedeniyle günümüzde dikkat çekmektedir. Nanopartikül (NP) araştırmaları, bilim dünyasını dönüştürmeye katkıda bulunan çalışma alanlarına olağanüstü katkılar sağlamaktadır. NP'ler; tüketim ve endüstriyel ürünlerde uygulama alanı bulurken, benzersiz özellikleri ile çok önemli değişikliklere yol açacak ölçüde teknolojiyi geliştirmeye devam etmektedir. Ancak, NP'lerin artan üretimi, bunların kullanımı veya çevrede istenmeyen bir şekilde serbest bırakılmaları, tüketici ve çevre güvenliğini sağlayan süreçlere ve politikalara duyulan ihtiyaçları ortaya çıkarmaktadır. NP'lerin potansiyel olarak güvenli bir şekilde hazırlanması ve güvenli kullanım yöntemlerini bir araya getirdiğimizde oluşabilecek herhangi zararlı bir etkinin ortadan kaldırılması mümkün olacaktır. Farklı biyolojik yöntemler kullanılarak NP'lerin biyosentezi, farklı disiplinlerdeki sayısız uygulamalar için etkin olmaktadır. NP'lerin sentezi için farklı yaklaşımlar (fiziksel ve kimyasal) kullanılmasına rağmen, yeşil sentez yöntemi yüksek etkinliği, maliyet etkinliği ve çevresel faydası nedeniyle en çok tercih edilen yöntem haline gelmiştir. Yapılan tez çalışması kapsamında; bitki ekstraklarını kullanarak gümüş (AgNP), bakır oksit (CuONP) ve demir oksit (FeONP) NP'lerinin sentezinin ve karakterizasyonun gerçekleştirilmesi ve bu yolla sentezlenen NP'lerin biyolojik aktivitelerinin ortaya çıkarılması temel hedef olarak belirlendi. Ayrıca metalik NP'lerin boyutunun ve şeklinin, sentezde kullanılan bitki ekstrakt kaynağının NP'lerin göstermiş oldukları antimikrobiyal ve antibiyofilm etki başta olmak üzere çeşitli biyolojik aktivitelerindeki rollerinin belirlenmesi de çalışmanın temel hedeflerinden birini oluşturmaktadır. Bu amaç doğrultusunda; AgNP, CuONP ve FeONP farklı konsantrasyonlardaki Thymbra spicata L. var. spicata (Zahter) sulu yaprak ekstraktları kullanılarak oda sıcaklığında yeşil sentezle ile elde edildi. Cynara scolymus (Enginar) ve Mentha piperita (Nane) yaprak ekstraktları AgNP sentezinde kullanarak, ekonomik öneme sahip olan üç bitkinin yaprak özütleri aracılığı ile sentezlenen NP'lerin biyolojik aktiviteleri karşılaştırmalı olarak incelendi. NP'ler farklı spektroskopik ve mikroskobik analiz yöntemleri kullanılarak karakterize edildi. Sonuç olarak; bitki ekstraktları kullanılarak sentezlenen AgNP'lerin TEM analizi, AgNP'lerin boyut ve şeklinin bitki ekstraktı konsantrasyonu ile kontrol edilebileceğini ortaya çıkardı. TEM sonuçlarına göre T. spicata yaprak ekstrakt konsantrasyonunun arttırılması ile ortalama AgNP partikül çapının 70.2 nm'den 25.1 nm'ye düştüğü gözlemlendi. Ayrıca, TEM ile yapılan boyut analizlerine göre CuONP ve FeONP'lerin ortalama partikül çapının 25 ve 100 nm civarında olduğu tespit edildi. Aynı zamanda farklı tekniklerle NP'lerin boyut analizi incelendiğinde NP boyutunun DLS>AFM>TEM>XRD olarak sıralandığı ortaya çıktı. Üç farklı bitkinin yaprak ekstraktları kullanılarak sentezlenmiş AgNP'ler, iki farklı gram-negatif ve gram-pozitif bakteri karşısında antibakteriyel etkinlikte önemli farklılıklar sergiledi. C. scolymus yaprak ekstraktından elde edilen CsAgNP'lerin S. aureus'a karşı 18.53 mm çapında maksimum inhibisyon zonu ve 12.5 µg/mL MİK değeri ile en fazla antibakteriyel aktivite gösterdiği belirlendi. S. aureus için yapılan antibiyofilm aktivite çalışmasında sentezlenen NP'lerin antibiyofilm etkinlikleri belirlendi. Ayrıca, T. spicata yaprağı ekstraktını kullanarak sentezlenen AgNP'lerin antibakteriyel ve sitotoksik aktivitelerinin şekil bağımlı olduğu gösterildi. Yapılan tez çalışmasında, farklı şekillerdeki NP'leri bünyesinde barındıran örnekler, çoğunlukla küresel formda NP'lere sahip örneklere göre güçlü antibakteriyel ve sitotoksik aktivite sergiledikleri gözlemlendi. Elde edilen sonuçlar, AgNP'lerin biyolojik aktivitelerinin NP şeklinden ve sentezde kullanılan bitki ekstrakt kaynağından etkilendiğini ortaya koymaktadır. Ayrıca T. spicata yaprak özütü kullanılarak sentezlenen CuONP ve FeONP'lerin antimikrobiyal, antibiyofilm, antioksidan ve sitotoksik etkinlikleri değerlendirildi. Elde edilen sonuçlara göre, FeONP'lerin en az AgNP'lerin ise en fazla antibakteriyel aktivite gösterdiği gözlemlendi.

(E)-1-(2,2-dikloro-1-fenilvinil)-2-fenildiazen yüklü kitosan nanopartiküllerin sentezi ve kontrollü salımda değerlendirilmesi

Nanopartiküller çeşitli özgül özelliklerinden dolayı son yıllarda tıp ve nanoteknoloji alanlarında peptid ve protein taşınması, ilaç hedefleme ve kontrollü ilaç salım teknolojisi gibi çeşitli uygulamalarda kullanılmaktadır. Nanopartikül sentezinde yaygın olarak kullanılan doğal polimerlerden biri kitosandır. İyi derecede biyouyumluluğu, biyobozunurluğu ve eşsiz katyonik özelliği sayesinde kitosan, nanopartiküler taşıyıcı sistemlerde sıklıkla tercih edilmektedir. (e)-1-(2,2-dikloro-1-fenilvinil)-2-fenildiazen katalitik olefinasyon reaksiyonu gerçekleştirilerek sentezlenen yüksek fizyolojik aktiviteye sahip yeni organik bir bileşiktir. Molekülün antimikrobiyal aktivitesi S. aureus, P. aeruginoza, E.coli ve C. albicans gibi mikroorganizmalar üzerinde araştırılmıştır. Buna ilave olarak furacilin ve nitofungin gibi yaygın olarak kullanılan ilaçlarla ve etil alkol ile antimikrobiyal aktivitesi kıyaslanmış olup güçlü antibakteriyel ve antifungal özellik gösterdiği kanıtlanmıştır. Bu tez çalışmasında antibakteriyel ve antifungal özelliğe sahip yeni organik bir bileşik olan (e)-1-(2,2-dikloro-1-fenilvinil)-2-fenildiazen molekülünün biyouyumlu ve biyobozunur kitosan nanopartiküllerine yüklenerek biyouyumluluğunun, biyoyararlanımının arttırılması ve sentezlenen nanopartiküler sistemden molekülün kontrollü salımının incelenmesi amaçlanmıştır. Sentezlenen nanopartiküllerin zeta potansiyel ve partikül boyutları Zeta Sizer cihazı kullanılarak ölçülmüş, karakterizasyonu için FT-IR, UV-VIS ve SEM analizleri gerçekleştirilmiştir. Nanopartiküllerin enkapsülasyon etkinliği, yükleme kapasitesi ve reaksiyon verimi hesaplamaları yapılmış, salım çalışmaları ise PBS tamponunda kümülatif salım tekniği kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Yapılan çalışmalar sonucunda istenilen özelliklerde optimum nanopartiküller elde edilerek, ilaç salım çalışmaları gerçekleştirilmiş ve 30 günün sonunda salım değerlerinin %38 – 58 aralığında değiştiği tespit edilmiştir. Sentezlenen polimerik nanopartiküllerin ilaç taşıyıcısı olarak kullanımının kandaki etkin madde seviyesini kontrol ederek doz uygulamasını azaltacağı dolayısıyla hasta uyumluluğunu arttıracağı öngörülmektedir. Buna ilave olarak sentezlenen nanopartiküllerin benzer antimikrobiyal özellik gösteren moleküller için uzun süreli ve kontrollü salımda model olabileceği düşünülmektedir. Anahtar Kelimeler: nanopartikül, kitosan, (e)-1-(2,2-dikloro-1-fenilvinil)-2-fenildiazen, ilaç salımı

Development of recombinant oncolytic Coxsackievirus B3 for treatment of colorectal carcinoma

Colorectal cancer is one of the most death related cancer type in worldwide. Conventional cancer therapeutics show curable effect only in the patients at early stage of the disease. In case of the diagnosis at late stages, the survival rate decreases dramatically up to 10%. Therefore, novel cancer therapeutics are urgently needed. Oncolytic virotherapy is a new treatment approach which exploits the viruses against cancer. Clinical trials prove the efficiency of various oncolytic viruses in treatment of different tumors. Coxsackievirus B3 (CVB3), a single-stranded RNA virus of the picornavirus family, has been described as a novel oncolytic virus against lung carcinoma. However, CVB3 can induce severe diseases, such as pancreatitis, myocarditis and encephalitis, but the course of infections is decisively influenced by the particular strain of CVB3. In this thesis, firstly, it was aimed to investigate different laboratory strains of CVB3 (Nancy, 31-1-93, H3) which use the coxsackievirus and adenovirus receptor (CAR) and the strain PD which uses N- and 6-O-sulfated heparin sulfate (HS) for entry into colorectal tumor cells, for their potential to lyse these cells and for their safety profile. In vitro investigations showed variable infection efficiency and lysis of colorectal carcinoma cell lines by the CVB3 strains. The most efficient strain was PD, which was the only one that could lyse all five of the investigated colorectal carcinoma cell lines. Lytic activity of CAR-dependent CVB3 did not correlate with CAR expression on colorectal carcinoma cells, whereas there was a clear correlation between lytic activity of PD and its ability to bind to HS at the cell surface of these cells. Intratumoral injection of CVB3 Nancy, 31- 1-93 or PD into subcutaneous colorectal DLD1 tumors in BALB/c nude mice each resulted in strong inhibition of tumor growth. The effect was seen in the injected tumor, as well as in a non-injected, contralateral tumor. However, all animals treated with 31-1- 93 and Nancy developed systemic infection and died or were moribund and sacrificed at 6 and 8 days post intratumoral virus injection. In contrast, five of the six animals treated with PD showed no signs of a systemic viral infection and PD was not detected in any organ. These results indicate that PD has potential to be a potent and safe oncolytic CVB3 strain for use in the treatment colorectal carcinoma. To increase the tumor selectivity, so that to abolish the possibility of undesirable virus infection in healthy organs, target sites of pancreas-specific microRNA was inserted into the virus genome and recombinant CVB3 was analyzed in vitro and in vivo. Detargeting of the pancreas, which is the most susceptible tissue for CVB3 infection, by exploiting miRNAs, increased the survival rate of treated animals significantly. The virus was unable to replicate in the pancreas and all animals survived. In contrast, colorectal carcinomas were destroyed as efficient as the wild-type CVB3. Finally, it was aimed to increase the efficiency of CVB3 against infection resistant colorectal cancer cell line by using directed evolution strategy. Results showed that CVB3 can specifically adapted to colorectal carcinomas leading to breaking the resistance of the tumor cells against CVB3 infection.

Hidroponik sistemde besleyici film tekniği ile yüksek boylu maviyemiş ( Vaccınıum corymbosum L. ) yetiştirilmesi ve yetişme şartlarının optimize edilmesi

Bu çalışma, dünyada 1905 yılında kültüre alınan, özellikle Karadeniz bölgesi iklimine ve toprağına uyum sağlama potansiyelinden dolayı 2000li yıllarda Türkiye'de yetiştirilen ve üretimi devlet tarafından da teşvik edilen blueberry (maviyemiş) bitkisinin topraksız tarım hidroponik sistemde yetiştirilmesi ve yetişme koşullarının optimize edilmesini içermektedir. Yıldız Teknik Üniversitesi Kimya Metalurji Fakültesi Biyomühendislik bölümüne ait biyoteknolojik serada Mart 2015-Eylül 2015 ayları arasında yürütülmüştür. Araştırmada bitkisel materyal olarak yüksek boylu maviyemiş (Vaccinium corymbosum) türlerinden bluecrop tercih edilmiştir. Maviyemiş yetiştirilirken topraksız tarım hidroponik sistem metotlarından biri olan NFT (Nutrient Film Tecnique, Besleyici Film Tekniği) kullanılmıştır. Hidroponik sistem için 4 m uzunluğunda 40 adet tava, pompa, 8 tonluk 1 adet besleme tankı kullanılmıştır. Ortalama 1.5 m mesafe ile 95 adet maviyemiş dikilmiş, strafor köpükle sabitlenmiştir. Besin çözeltisi hazır alınmamıştır belli tuzlar ile hazırlanarak optimum besin çözeltisi elde edilmeye çalışılmıştır. Kullanılan tuzlar ve miktarları şöyledir: Amonyum Nitrat (NH4NO3) 437.5 ppm, Kalsiyum Nitrat (Ca(NO3)2. 4H2O) 962.5 ppm, Potasyum Nitrat (KNO3) 210 ppm Magnezyum Sülfat (MgSO4.7H2O) 437.5 ppm, Monopotasyum Fosfat (KH2PO4) 262.5 ppm, Demir Sülfat (FeSO4.7H2O) 6.75 ppm, Mangan Sülfat (MnSO4) 5.875, BORAX (Na2B4O7.10H2O) 9 ppm, Bakır (II) Sülfat (CuSO4) 8.75 ppm, Çinko Sülfat (ZnSO4) 11.25 ppm, Kobalt Sülfat (CoSO4) 7.5 ppm. Bu miktarlarda ölçülen pH değeri 7.1 dir. Asit (H2SO4) ile müdahale edilerek pH düşürülmüştür. İkinci kez hazırlanan besin çözeltisinde ise yapraklarda oluşan klorozun Mg ve K eksikliğinden olabileceği düşünülerek Kalsiyum Nitrat %20 artış ile 1155 ppm, Potasyum Nitrat %10 artış ile 231 ppm, Monopotasyum fosfat %10 artış ile 288.75 ppm olarak ayarlanmıştır. Bu değerlerdeki pH değeri ise 3 tür. Baz (KOH) ile müdahaleyle pH yükseltilmiştir. Maviyemiş yetişmesinde optimum pH aralığı 4.5- 5 olduğu için, pH devamlı olarak asit veya baz ilavesi ile sabit tutulmaya çalışılmıştır. Asit olarak H2SO4, baz olarak KOH kullanılmıştır. Besin çözeltisi stok olarak hazırlanmış günlük 1 l tanka besin çözeltisi ve 0.5 ton su eklenmiştir. Araştırma süresi boyunca bitki boy uzaması, yaprak rengi, yaprak sayısı, meyve sayısı seçilen 10 örneklem üzerinden takip edilmiştir. Bitkileri yüksek yaz sıcaklarından korumak için sera tavanında perdeleme yapılarak hem sera ortam sıcaklığı düşürülmüş hem de bitki gölgelenme isteği karşılanmıştır. Bitki boy uzamasına baktığımızda 5 ayda toplam 9 cm uzamıştır. Bu uzama Nisan 1. yarı ile Temmuz 2. yarı arasında olmaktadır. Topraklı tarımda iki yıldan daha kısa sürede meyve alımı mümkün değilken hidroponik serada 5 ay sonunda meyve alınmıştır. Maviyemiş meyveleri ilk olarak Ağustos ayında oluşmuştur. Ortalama meyve ağırlığı 2-3 g'dır.

Prostat kanserinin tanısında kullanılmak üzere prostat kanser antijen 3 temelli non invaziv kit geliştirilmesi

Prostat kanseri, erkeklerde en sık görülen kanser türlerinden biridir. Prostat kanserinin tanısı için hastaya uygulanan biyopsinin zahmetli ve rahatsız edici olmasından dolayı teşhis için biyobelirteçler kullanılmaktadır. Serum örneğinde Prostat Spesifik Antijen (PSA) tespiti prostat kanserinin tanısında en sık kullanılan invaziv olmayan bir yöntemdir. Fakat söz konusu yöntem hassaslık ve özgünlük açısından zayıf kalmaktadır. Bu araştırmanın amacı, prostat kanseri tanısında serum PSA seviyesine alternatif olarak idrarda Prostat Kanser Antijen 3 (PCA3) mRNA'yı tespit etmek için hassaslık ve özgünlük değerleri yüksek yeni bir kit geliştirmektir. Kartal Eğitim ve Araştırma Hastanesi'ne başvurmuş yaşları 55-70 arasında olan 82 vakanın rektal muayenelerinden sonra serum PSA değerleri ölçülmüş ve ardından biyopsi ile prostat kanseri varlığı araştırılmıştır. Çalışmaya alınan kişilerden 64'ü prostat kanseri ve 18'i sağlıklı bireylerdir. Bu vakalardan toplanan idrar örneklerinde PCA3 ekspresyon (mRNA) düzeyi, Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonuna (RT-PZR) dayanan geliştirdiğimiz kit ile tespit edildi. Ardından bu PCA3 seviyeleri PSA ve biyopsi sonuçları ile karşılaştırıldı. PCA3 mRNA seviyeleri ile altın standart olan biyopsi sonuçları karşılaştırıldığında testin hassaslığı %63, özgünlüğü %100, pozitif öngörüsel değeri (PPV) %100 ve negatif öngörüsel değeri (NPV) %43 olarak bulunmuştur. Analiz bulguları neticesinde, biyopsi sonucunda prostat kanseri teşhisi konan hasta grubunda PCA3 ekspresyonu görülme sıklığı %63 iken (n=40) sağlıklı grupta hiç gözlenmemiştir. Hasta grubu ile sağlıklı grup arasında PSA değeri ortalamalarının istatistiksel düzeyde anlamlı olarak farklılık gösterdiği belirlenmiştir (p<.001). Buna göre hasta grubunda PSA seviyesinin, sağlıklı gruba kıyasla daha yüksek olduğu bulunmuştur. Negatif öngörüsel değer, test ile sağlıklı olduğu belirlenen bireylerin gerçekten sağlıklı olma yüzdesini ifade eder. Dolayısıyla bu çalışmada PCA3 seviyesine göre sağlıklı tespit edilen 42 bireyden 18 bireyin gerçekten sağlıklı olup olmadığı biyopsisi alınmadan anlaşılamamaktadır. Geliştirdiğimiz PCA3 tespit kiti, prostat kanserini tek başına tespit etmede yeteri kadar hassas bulunamamıştır. Fakat bu kitin sonuçlarının, PSA ve biyopsi sonuçları ile birlikte değerlendirilmesi anlamlı görülmüştür.

İmmünobiyosensörlerde biyomoleküllerin dedeksiyonu için immobilizasyon yöntemlerinin geliştirilmesi

Biyosensörler, bir biyolojik algılayıcı ile hedef analitin arasındaki etkileşimin yarattığı değişiklikten sinyal üreten bir transdüserin kombinasyonundan oluşan cihazlardır. Biyosensörlerin performans parametreleri; hızlı geriye dönme zamanı, dinamik cevap, tekrarlanabilirlik, seçicilik, kantitatif ölçüm sınırı, tespit sınırı, geniş ölçüm aralığı, doğrusallık ve hassasiyetdir. Biyosensörlerin hassasiyetine büyük ölçüde etki eden immobilizasyon etkinlikleri biyoalgılayıcı yüzeyde farklı methodlar ile gerçekleştirilmektedir. Tez kapsamında yapılan çalışmada elektrod yüzeyinde kendiliğinden oluşan tek tabakalar (self assembled monolayer (SAM)) oluşturularak analit immobilizasyonları gerçekleştirilmiştir. Tez çalışmasında geliştirilen kuvars kristal mikrobalans (QCM) immünosensöründe immobilizasyon etkinliğinin belirlenmesi çalışmaları için Fumonisin (FUM) biyomolekülü model olarak kullanılmıştır. FUM, Fusarium Moniliforme ve Fusarium Proliferatum isimli küf mikroorganizmaları tarafından üretilen bir mikotoksin türüdür ve diğer mikotoksinler gibi ABD Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) , Avrupa Komisyonu (E.C.) ve ülkemizde Türk Gıda Kodeksi tarafından getirilen regülasyonlar (düzenlemeler) ile izlenmektedir. FUM kontaminasyonunda laboratuvar odaklı enstrümantal analitik sistemler ile tayinlerin yanısıra yerinde tespit imkanları sunmasına bağlı olarak biyosensörler ile tayin metodları üzerine çalışmalar da geliştirilmektedir. Tez kapsamında FUM'ne karşı üretilen Monoklonal Antikorlar (Mab) kullanılarak FUM dedeksiyonu yapabilen QCM immünosensörü ilk kez geliştirilmiştir. Çalışmada immobilizasyon etkinliğinin önemini ortaya koyan stratejiler sayesinde regülasyonların belirlediği aralıklarda FUM tayini yapılabilen bir sensör geliştirildi. FUM'nin yüzeye immobilizasyonunda SAM ajanı olarak en sık kullanılan 11-merkaptoundekanoik asit'in yanısıra yine lineer ajanlardan 11-merkaptoundekanamid (MUD) ve 11-merkaptoundekanol (MUO) kullanılarak yüzey modifikasyonları yapıldı. İmmobilizasyon etkinliğinin arttırılmasında lineer ajanlara alternatif olarak; kendiliğinden SAM oluşturmaları, farklı topografik yapıları ile analiti sunma/yakalama kabiliyetleri ve yüksek derecede ıslanabilme özelliklerinden dolayı dendronlar kullanıldı. İmmobilize olan analitin elektrodlara ve birbirlerine olan uzaklıklarının ölçümlerdeki hassasiyet üzerine etkisinin belirlenmesi amacıyla 3 farklı nesilden (jenerasyon) dendronlar kullanıldı. Bu amaçla bis-MPA dendron-8-hidroksil-1thiol (G3 DND), bis-MPA dendron-16 hidroksil-1 thiol (G4 DND) ve bis-MPA dendron-32 hidroksil-1 thiol (G5 DND) dendronları ile FUM immobilizasyonları gerçekleştirildi. Yüzeyde dendronların kullanılması ile yüksek sensör yanıtlarının elde edilmesine karşın verilerde güven sınırlamasından dolayı iki katmanlı sensör yüzeyleri oluşturuldu ve MUD ile SAM oluşturulduktan sonra yüzeyde ikinci bir katman olarak dendronlar kullanıldı. Geliştirilen tüm elektrod yüzeyleri ölçümlerde algılama, hassasiyet, doğruluk ve tekrarlanabilirlik parametreleri açısından irdelendi. Biyosensörlerde immobilizasyon etkinliğini ortaya koyan bu çalışmalar sayesinde, 0.008 ppm algılama limitine sahip, güvenilir, tekrarlanabilir, yüksek hassasiyette FUM ölçümü yapabilen QCM immünosensörü geliştirildi.

Performance comparison of membrane bioreactor with dynamic membrane bioreactor

Membrane bioreactors (MBRs) used for wastewater treatment have begun to be used at an increasing rate in developed and developing countries in the last 10 years. It is anticipated that many conventional wastewater treatment plants will convert to the MBR technology in the coming years, and as a result, the final sedimentation basins will come to an end. MBRs are biological processes in suspension growth mode in which purified water and biomass are physically separated by membrane equipment. However, membrane costs, increased energy demand, clogging control and low flow bioreactor operating problems are among the major problems faced by membrane bioreactor systems. Dynamic membrane bioreactor systems (DMBR), due to its low operating cost, have provided a promising approach to solving these problems. The purpose of this study is to measure the pollution performance of two different membrane types, 0.45 μm and non-woven dynamic membranes, which are operated in the same aerobic membrane bioreactor (AeMBR) and fed with synthetic wastewater. During reactor operation, parameters of COD, turbidity, pH, temperature, electrical conductivity (EC), TMP, SADm and ORP were measured daily. The highest COD removal values were found to be 99.47% and 97.02% and the lowest turbidity values were found to be 0.12 NTU and 1.23 NTU for 0.45 µm real and non-woven dynamic membrane, respectively. The maximum and minimum permeate pH values of the AeMBR operated at room temperature, for 0.45 µm real and non-woven dynamic membrane, were found to be 7.98-7.94 and 7.37-7.43, respectively. The maximum and minimum values for electrical conductivity were measured as 574-577 μS and 470-471 μS, respectively, as 0.45 μm real and non-woven dynamic membrane. As a result of the TMP measurements, both membrane materials were subjected to chemical washing (1 hour 0.5% NaOCl and then 1 hour pH = 2 set in tap water) with the pressure rising 300 mbar or above. It is noted that in the measurements made after washing, the membranes acted as if they were used for the first time in operation. In the ORP measurements made in the reactor, the maximum and minimum values were measured as 177.4 and 114.2 for 0.45 µm real and non-woven dynamic membrane, respectively. Also, soluble microbial products (SMP) / extra polymeric substances (EPS), specific resistance to filterability (SRF) / supernatant filterability (SF), fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR), capillary suction time (CST), scanning electron microscopy (SEM) and denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) analysis were included in this study. The study consisted of three experimental periods and on the first day of each experimental period, a new membrane was placed in the module. The first experimental period was successfully operated at 10 LMH flux. During this time, approximately 98% COD removal and 1 NTU turbidity values were measured for both membrane types. During operation, the membranes exhibiting high filtration performance with only physical washing were subjected to chemical washing only once, with the pressure reaching 300 mbar and above. During the first experimental study, once in a week SMP / EPS and only once SEM, SRF / SF, CST, FT-IR and DGGE analysis were performed. In the second period of the experimental run, the flux was increased to 15 LMH and the reactor was run successfully. The average COD removal efficiencies in percentage for 0.45 µm real and non-woven dynamic membrane were recorded as 97% and 90%, respectively. However, physical and chemical washing was applied to both types of membranes against the fouling problems originating from the high flux. The chemical washout was reduced by 97% of the membrane flocking for both membrane types. After chemical washing, the turbidity values of the 0.45 µm real membrane did not change much (around 0.2 NTU) but the turbidity values of the non-woven dynamic membrane gave high values until the cake layer was formed after washing. Minimum turbidity values were found to be between 1-2 NTU for the non-woven dynamic membrane. During the second experimental period, once in a week SMP/EPS and only once SRF/SF and CST were performed and the results compared with the previous experimental period. In the last experimental period, the flux was increased to 20 LMH, during which time the non-woven dynamic membrane fouled swiftly and thus did not perform a successful filtration process. While the turbidity values of the non-woven dynamic membrane layer reached approximately 8 NTU levels, the turbidity values of the 0.45 µm real membrane remained at about 0.2 NTU. Both membranes reached a TMP of approximately 10 mbar as a result of chemical washing which means 97% of the fouling reduction. During the last experimental period, only once SMP/EPS, SRF/SF, CST, FT-IR and DGGE analyses were performed and the results were compared with the other analyses. As a result of FT-IR analysis, organic pollutants on the sludge have been assigned on the graph and for the SEM analysis, organic substances on the membrane were identified, thickness of the cake layer formed on the membrane was measured by cross-sectional image, and the types of micro-contamination causing the fouling were observed and significant information was obtained. Within the DGGE study, the numbers of bacterial species in the sludge that cause fouling were determined. Findings in this study showed that the use of DMBR is very low in terms of cost compared to MBRs and is at least as successful as MBRs in terms of functionality. Based on this information it is expected to shed light on DMBR and MBR studies to be made in the future and also benefit on the use of DMBR in real scale installations.

Mikrobiyal hücre tabanlı ve hücre dışı PET degradasyonsistemlerinin geliştirilmesi ve karşılaştırılmalı analizi

Plastikler, çok yönlü kullanım alanları ve düşük üretim maliyetleri nedeniyle modern endüstride yaygın olarak kullanılmakta olup, PET özellikle tek kullanımlık ambalajlarda en sık tercih edilen polimerlerden biridir. Çevrede biriken PET atıklarının biyolojik olarak parçalanabilmesi için ester bağlarını hidrolize eden mikroorganizmalar giderek daha fazla tanımlanmaktadır. Bu çalışmada, çevreye yaygın şekilde dağılan ve doğada zor parçalanan polietilen tereftalat (PET) atıklarının biyolojik yollarla parçalanabilirliğini değerlendirmek amacıyla hem hücre tabanlı hem de hücresiz (cell-free) sistem kullanılmıştır. Çalışmanın temel amacı, farklı sistemlerdeki PET degradasyon verimlerini karşılaştırmak ve elde edilen ürünleri kantitatif ve kalitatif olarak analiz ederek sistemlerin etkinliğini moleküler düzeyde ortaya koymaktır. Deneylerde yüksek kristaliniteye sahip (% >30) 5 mg PET kullanılmış, hücreli sistemde 48 saat sonunda %1,29'luk bir degradasyon oranı ile yaklaşık 0,333 mM TPA ve 0,0007 mM EG üretimi gözlemlenmiştir. Hücresiz sistemde ise aynı miktardaki PET, 24 saatlik sürede %5,39 oranında parçalanmış; 1,199 mM TPA ve 0,0042 mM EG üretimi tespit edilmiştir. HPLC analizleri ve HOTP floresan sonuçları TPA oluşumunu doğrularken, SEM görüntüleri özellikle hücresiz sistemde PET yüzeyinde belirgin morfolojik bozulmalar olduğunu göstermiştir. İstatistiksel analizler, iki sistem arasında elde edilen ürün miktarlarında anlamlı farklılıklar olduğunu ortaya koymuş (p<0,05) ve hücresiz sistemin verimliliği yaklaşık 4,2 kat daha yüksek bulunmuştur. Bu fark, hücresiz sistemde enzimlerin doğrudan ve daha kontrollü bir ortamda çalışabilmesi, metabolik yan etkilerden arındırılmış bir sistem kullanılması ve ortam koşullarının daha hassas şekilde optimize edilebilmesiyle ilişkilendirilmiştir. Elde edilen bulgular, cell-free sistemlerin PET biyobozunumu açısından daha yüksek verim ve hız sunduğunu göstermiştir. Bu durum, enzimlerin inhibitör etkilerden uzak, daha kontrol edilebilir koşullarda çalışabilmesiyle doğrudan ilişkilidir. Öte yandan hücreli sistemlerin avantajı uzun süreli enzim üretimi potansiyeline sahip olmaları olsa da, hücresel metabolizmanın oluşturduğu kısıtlamalar nedeniyle bu sistemlerde degradasyon etkinliği sınırlı kalmıştır. Çalışma genelinde elde edilen veriler, cell-free platformların plastik atıkların biyolojik dönüşümünde ileri düzeyde mühendislik yaklaşımlarıyla daha da geliştirilerek endüstriyel ölçekte uygulanabilirliğe ulaşabileceğini ortaya koymaktadır. Bu bağlamda, sürdürülebilir plastik geri dönüşümüne katkı sağlamak amacıyla cell-free sistemlerin daha detaylı araştırılması ve optimizasyonuna yönelik çalışmaların artırılması gerekmektedir.

Botanik hava filtrasyon sisteminde mikroçoğaltım yöntemi ile elde edilen ficus elastica roxb. bitkisi kullanılarak kapalı ortam havasındaki uçucu organik bileşiklerin (toluen ve etanol) uzaklaştırılması

Uçucu organik bileşikere (UOB) maruz kalmanın insan sağlığı açısından olumsuz etkileri yapılan araştırmalarla ortaya konmuştur. İç ortam havasında bulunan UOB'ler giderilmediği durumlarda ciddi sağlık sorunlarına sebep olmaktadır. Bu bileşiklerin giderilmesinde çeşitli yöntemler kullanılmaktadır. Bunlardan birisi de botanik biyofiltrasyon sistemleridir. Bu sistemler sürdürülebilir, toksik olmayan, ucuz, çevre dostu ve verimli olması nedeniyle üzerinde durulması gerekmektedir. Bu tez çalışmasında Ficus elastica bitkisi ile oluşturulan botanik hava filtrasyon sisteminde toluen ve etanol UOB'lerinin uzaklaştırılma verimleri; bileşik konsantrasyonu, bağıl nem, süre değişkenleri kullanılarak optimize edilmiştir. Mikroçoğaltılmış bitkilerle, optimum koşullarda sağlama deneyleri gerçekleştirilmiştir. Ek olarak uzaklaştırma işleminden sonra meydana gelebilecek desorpsiyon konsantrasyonları ve tüm bu süreçte UOB maruziyeti kaynaklı olarak bitkide meydana gelebilecek değişimler incelenmiştir. RSM (Yanıt Yüzey Metodu) optimizasyonu sonuçlarına göre F. elastica ile toluen ve etanol bileşikleri için %90 üzerinde UOB uzaklaştırma verimine ulaşılabileceği görülmüştür. Elde edilen optimum şartlarda toluen için maksimum uzaklaştırma %92,01 etanol için ise %97,16 olarak bulunmuştur. Mikroçoğaltılmış yeni bitkilerle yapılan testlerde, UOB'ye maruz kalma sıklığıyla orantılı olarak, test sayısı arttıkça uzaklaştırma veriminde artış görülmüştür. Uzun süreli maruziyetin bitkide stres yanıtı olan antioksidan bileşiklerin artmasına, klorofil miktarında azalmaya ve stoma yapılarında doku hasarına sebep olduğu gözlenmiştir. Sonuç olarak botanik filtrasyon sistemleriyle UOB'lerin yüksek verimlerde uzaklaştırabildiği, bu verimin yapılacak optimizasyon çalışmalarıyla daha da yüksek seviyeye ulaşabileceği görülmüştür. Botanik filtrasyon kapalı iç ortam havasındaki insan sağlığını tehdit eden bileşenler için ekonomik, verimli ve sürdürülebilir sistemlerin gelişiminde büyük bir öneme sahiptir.

Kombine klostridial aşı üretiminde kullanılmak üzere C. perfringes beta, epsilon ve C. novyi alfa toksinlerini üreten rekombinant suş geliştirilmesi

Enterotoksemi ve enfeksiyöz nekrotik hepatitis, küçükbaş hayvanlarda yüksek ölüm oranları ve ciddi ekonomik kayıplara yol açan, Clostridium türlerinin neden olduğu önemli bakteriyel hastalıklardır. Enterotoksemi, genellikle C. perfringens tip C ve D suşlarının toksinleriyle, enfeksiyöz nekrotik hepatit ise C. novyi tip B'nin toksinleriyle ilişkilidir. Bu hastalıkların kontrolünde geleneksel olarak aşılar ve hijyen/beslenme önlemleri kullanılmaktadır. Ancak klasik aşıların üretiminde yaşanan zorluklar, toksinlerin bağışıklık sistemini yeterince uyaramaması gibi sorunlar, daha etkili ve güvenli aşı stratejilerine olan ihtiyacı artırmıştır. Bu nedenle, rekombinant DNA teknolojisi ve sentetik biyoloji gibi modern yaklaşımlar, tanımlı antijenlerle yüksek verimli ve ölçeklenebilir aşı üretimine olanak sağlamaktadır. Bu tez kapsamında, enterotoksemi ve enfeksiyöz nekrotik hepatitise karşı etkin bir aşı adayının geliştirilmesinde kullanılmak üzere rekombinant E. coli suşlarının tasarımı ve inşası gerçekleştirilmiştir. Hedef toksin genlerini taşıyan "pCpDetx, j23119-pelB-CpDetx, pET-28 (a)-pelB-CpDetx, j23119-pelB-CpCcpb, pET-28 (a)-pelB-CpCcpb, j23119-pelB-CnBtcn-alpha, pET-28 (a)-pelB-CnBtcn-alpha" olmak üzere yedi farklı plazmid aracılı suş geliştirilmiştir. Bu plazmidler oluşturulurken ilave gen dizilerinin tasarıma eklenmesi ile daha yüksek seviyede protein ekspresyonu amaçlanmıştır. Ayrıca plazmidler, yüksek seviyede toksin üretimi sağlayabilecek konak sistemlerinde (ör. E. coli BL21 (DE3), C41 (DE3), C43 (DE3)) test edilmiştir ve E. coli C43 (DE3) suşu yüksek protein ekspresyonu gözlemlenmiştir. Ayrıca CpDetx ve CpCcpb toksin genlerin plazmid aracılı inşalarının yanı sıra, bu genler hem ayrı ayrı hem de ikili olarak genoma entegrasyonları da başarılı bir şekilde tamamlanmıştır. Bu doğrultuda "E. coli cpb+, E. coli etx+ ve E. coli etx+ cpb+ " olarak adlandırılan genoma entegre suşlar elde edilmiştir. Üretilen rekombinant toksin proteinlerinin ekspresyon düzeyleri SDS-PAGE ile analiz edilmiş, bant yoğunlukları karşılaştırılarak en uygun plazmid ve konak kombinasyonu belirlenmiştir. Elde edilen sonuçlara göre, pET tabanlı ekspresyon plazmidini taşıyan (pET-28 (a)-pelB-CpDetx, pET-28 (a)-pelB-CpCcpb, pET-28 (a)-pelB-CnBtcn-alpha) E. coli C43 (DE3) suşu, toksin genleri için yüksek düzeyde protein ekspresyonu sağlamıştır.

Arkeik bir bakteri olan Haloarcula hispanica 2TK2 suşundan alfa amilaz üretimi

Enzimler biyolojik reaksiyonları katalizleyen, protein yapılı moleküllerdir. Son yıllarda biyoteknoloji alanındaki gelişmelerden dolayı; farklı kaynaklardan üretilen termostabil ve alkali stabil enzimlerin özellikle gıda ve deterjan sanayide kullanımı oldukça yaygınlaşmıştır. Enzimler bitkisel kaynaklardan, hayvansal kaynaklardan ve mikrobiyal kaynaklardan üretilebilmektedirler. Mikroorganizmalar kısa sürede hızlı üreyebildikleri için ve ürettikleri enzimlerin kontrolünün kolayca yapılabilmesinden dolayı; özellikle potansiyel enzim kaynakları olarak tercih edilmektedirler. Mikrobiyal kaynaklardan elde dilen enzimlerin aktivitelerinin yüksek olması, daha az yan ürün oluşturmaları, daha stabil ve ucuz olmaları nedeni ile; mikrobiyal kaynaklardan enzim üretimi konusu her geçen gün önem kazanmıştır. Halofilik arkealar ve haloarkeal proteinler çok yüksek tuz konsantrasyonlarına kolayca adapte olabilme özelliğine sahiptirler; bu nedenle haloarkeal proteinler ekstrem ortamlarda stabilitelerini ve fonksiyonlarını sürdürebilmektedirler. Halofillerde birçok haloarkel enzim tespit edilmiştir, bunlardan bir tanesi olan alfa amilaz enzimi endüstriyel anlamda oldukça önemli bir enzimdir.Bu çalışmada; Türkiye Tuzköy Tuz Madeni'nden izole edilen Haloarcula hispanica 2TK2 suşunundan elde edilen ?-amilaz enziminin özellikleri araştırılmıştır. 25 - 80 °C sıcaklık değer aralığında, 1 - 6 M tuz konsantrasyonu değer aralığında ve pH 4 - 10,8 değer aralığında; ?-amilaz aktivite tayin çalışmaları yapılmıştır. Maksimum enzim aktivitesinin elde edildiği; optimum pH, sıcaklık ve tuz konsantrasyon değerleri sırasıyla; 6,9, 52 °C ve 5 M olarak saptanmıştır. Ayrıca kültür ortamlarının tuz konsantrasyonları arttıkça, rölatif aktivite değerlerinin herbir numune için arttığı ve kültür ortamlarına eklenen nişastanın; halofilik bir arkea olan Haloarcula hispanica 2TK2 suşundan üretilen ?-amilazın aktivitesini önemli ölçüde arttırdığı saptanmıştır. Bunun yanısıra, elde dilen alfa amilaz enziminin; triton X 100, tween 80 ve propilen glikol gibi yüzey aktif maddelere karşı direnci araştırılmıştır. Bu çalışmada elde edilen sonuçlar gösteriyor ki; Haloarcula hispanica 2TK2 suşunun ve elde edilen arkeal enzimin tuz toleransı oldukça yüksektir, enzim aktivitesi açısından oldukça geniş bir pH ve sıcaklık değer aralığına sahiptir ve çeşitli yüzey aktif kimyasallara karşı direnci oldukça yüksektir. % 50 (v/v) Triton X 100, % 50 (v/v) Tween 80 ve % 50 (v/v) propilen glikol varlığında dahi kalan enzim aktivitesi sırasıyla; % 49,87, % 47,62 ve % 66,47 olarak saptanmıştır. Yüksek tuz konsantrasyonları gibi ekstrem şartlar altında fonsiyonlarını ve stabilitelerini koruyabilen enzimlerin kullanımını gerektiren endüstriyel prosesler için potansiyel aday olarak dikkate alınabilir.Anahtar Kelimeler: ?-Amilaz, Haloarcula hispanica 2TK2, spektrofotometrik yöntem, rölatif aktivite, tuz toleransı

İlaç ve DNA taşıyıcı amfifilik blok kopolimerlerin RAFT yöntemi ile sentezi ve karakterizasyonu

Yapısal kararlılıkları, toksisitelerinin düşük olması, ilaç/gen taşıma kapasitelerinin yüksek olması, küçük boyutta olmaları ve suda çözünürlükleri sebebiyle blok kopolimerler polimer terapötikler içinde önemli bir sınıfı oluşturmaktadırlar. Blok kopolimerler; hidrofobik ve hidrofilik bloklardan oluştuğunda hidrofobik etkileşimlerle, iyonik ve noniyonik hidrofilik bloklar içerdiğinde elektrostatik etkileşimle veya uygun gruplar yapıya eklendiğinde kovalent bağlarla bir araya gelerek sulu çözelti içinde misel oluştururlar. İlaç veya DNA gibi moleküller blok kopolimer misel çekirdeğine yüklenerek bu moleküllerin hem fizyolojik engellerle etkileşimlerinde azalma hem de hedef dokuya ulaşım oranlarında önemli bir artış sağlanmaktadır. Tez çalışmasında, DNA veya ilaç taşıma ve salım potansiyeline sahip, amfifilik blok kopolimerlerin RAFT (tersinir katılmalı ayrışmalı zincir transfer; ?reversible addition-fragmentation chain transfer?) polimerizasyonu ile sentezi ve karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir. Bu çalışma ile 4-vinilpiridin (4-VP) ve oligoetilenglikol metil eter metakrilat (OEGMA) monomerleri kullanılarak, monodisperse yakın özellikte olan, DNA veya ilaç taşımaya uygun, ek modifikasyonlara izin verecek fonksiyonel gruplara sahip, amfifilik diblok kopolimerler elde edilmiştir. Polimerin yapısındaki fonksiyonel gruplar hedefleyici veya işaretleyici moleküllerin yapıya bağlanmasını olanaklı hale getirmektedir. Tez çalışması kapsamında öncelikle 4-VP ve OEGMA monomerleri için uygun RAFT ajanı ve reaksiyon şartları belirlenmiştir. Ardından, OEGMA RAFT yöntemiyle polimerleştirilmiş ve makroCTA haline getirilmiştir. MakroCTA zincirinin ucundan 4-VP monomeri polimerleştirilerek hidrofobik ilaç taşımada kullanılabilecek poli(OEGMA)-b-poli(4-VP) kopolimeri elde edilmiştir. Daha sonra, bu kopolimerdeki 4-VP birimleri kuarternerleştirilerek DNA taşımaya uygun pozitif yüklü blok kopolimerler elde edilmiştir. Sentezlenen polimerler GPC, FTIR spektroskopisi ve NMR spektroskopisi ile karakterize edilmiştir. Kopolimerlerin çözelti davranışları ve kuarterner kopolimerin c-myc genini inhibe eden oligonükleotidle oluşturduğu kompleksler ışık saçılması spektroskopisi, floresans spektroskopisi, atomik kuvvet mikroskobu ve UV spektroskopisi ile incelenmiştir. Poli(OEGMA)-b-poli(4-VP) blok kopolimerlerinin pH 5?in altındaki pH?larda çözeltide tek başlarına bulunduğu ancak pH 5?in üzerinde misel oluşturdukları saptanmıştır. Ayrıca belirli blok kopolimerlerin sıcaklığa duyarlı oldukları bulunmuştur. Kuarternerleştirilmiş pozitif yüklü kopolimerlerin de ODN ile kompleks oluşturduğu ve sıcaklığa bağlı olarak oluşan yapının değiştiği gözlenmiştir. Sonuçta, ilaç taşıyıcı olarak kullanılabilecek pH?a ve sıcaklığa duyarlı amfifilik blok kopolimerler ile gen terapi çalışmalarında kullanılabilecek sıcaklığa duyarlı pozitif yüklü blok kopolimerler elde edilmiştir.

Akut miyokard infarktüsünde iskemi modifiye albumin, oksidatif stres ve antioksidan enzim düzeylerinin araştırılması

İskemi, arterlerin kasılması veya tıkanması sonucu arterin beslediği bölgeye oksijen sağlanamaması durumudur. En yaygın görülen ve hayatı tehdit eden iskemiler kardiyak ve serebral iskemilerdir. Akut miyokardiyal iskemi (AMİ) halen tüm dünyada en sık görülen ölüm sebeplerinden biridir. Akut kardiyak iskemiye bağlı gelişen semptom ve bulguların hepsi akut koroner sendrom (AKS) olarak bilinmektedir. Miyokardiyal iskemide tanıda EKG bulgularıyla beraber, CK-MB, Troponin düzeylerinin belirlendiği biyokimyasal testler kullanılmaktadır. Ancak bu testler bazı vakalarda tanıda yetersiz kalmaktadır. Son yıllarda bu yöntemlere göre daha avantajlı olduğu düşünülen iskemi modifiye albumin (İMA) adlı yeni bir parametre üzerinde çalışılmaktadır. Yapılan araştırmalarda, İMA?nın iskemi doku oluşumundan itibaren artmaya başladığı ve 48 saat içinde normal seviyelere döndüğü bulunmuştur. İMA?nın en önemli oluşum nedeninin iskemik dokuda üretilen serbest radikallerin olduğu düşünülmektedir. Bu çalışmada klinik, EKG ve biyokimyasal parametrelerle AMİ tanısı konulan hasta grubu ile kontrol grubu arasında, miyokardiyal iskemi ile bağlantılı olduğu düşünülen parametrelerin sistematik olarak incelenmesi yapılmıştır. Bu amaçla AMİ hasta grubu ve sağlıklı kontrol gruplarında, İMA seviyeleriyle beraber glutatyon peroksidaz (GPx), süperoksit dismutaz SOD ve katalaz KAT enzimlerinin aktivitesi araştırılmış, ve oksidatif stresin en önemli belirteçleri olan GSH ve MDA seviyeleri her iki grupta karşılaştırılmıştır. Sonuç olarak, AMİ tanısı konulan hastalarda İMA seviyeleri kontrol grubuna göre yüksek bulunmuştur. Hasta grubunda MDA seviyesinin yükseldiği, GSH seviyesinin ise düştüğü gözlenmiştir. Kardiyovasküler hastalıkların oluşumunda büyük etkisi olduğu düşünülen oksidatif stresin sonucu olarak hasta grubunda (SOD), (GPx) ve (KAT) enzimlerinin aktivitelerinin kontrol grubuna göre azaldığı bulunmuştur. Miyokard infarktüsü ile bağlantılı olan bu parametrelerin sistematik olarak incelenmesi yapılmıştır ve bu parametrelerin hastalığın erken teşhisinde, hastalıktan korunmada ve hastalığın gelişim mekanizmasının anlaşılmasına önemli katkılar yapacağı düşünülmektedir.

Bitkisel atıklardan karbonizasyon yoluyla farklı kullanım amaçlı katı materyallerin üretimi

Biyokütlenin karbonizasyon işlemiyle, havasız veya inert ortamda ısı etkisiyle bozundurulmasıyla, karbon içeriği yüksek katı, sıvı ve gaz ürünler elde edilmektedir. Biochar olarak adlandırılan karbonizasyon katı ürünü, biyoyakıt, metal indirgeyici, toprak iyileştirici ve aktif karbon gibi pek çok uygulama alanına sahip bir materyaldir. Toprak iyileştirici materyal olarak kullanımında, toprak asitliğini gidermesi, toprak katyon değiştirme kapasitesi ve su tutma kapasitesini iyileştirmesi, toprak için yararlı mikroorganizmlar için yaşam alanı oluşturması en önemli özelliklerindendir. Dünya nüfusundaki artış ile birlikte daha fazla sayıda yiyecek gereksiniminin oluşması, verimli tarım arazilerinin azalması, topraklı tarımın yanısıra topraksız tarım tekniklerinin de gelişmesini sağlamıştır. Biochar tarımda toprak iyileştiriciliğinin yanısıra topraksız tarımda da toprak yerine geçebilecek bir materyal olarak da kullanıma sahiptir. Hidrofonik sistem topraksız tarım yöntemlerinden birisi olup, besin solüsyonunda optimum bitki yetiştirme tekniğidir. Hidrofonik sistemlerde bitki kök ortamını destekleyici pek çok çeşitlilikte inert ve organik substratlar kullanılır. Biochar, sahip olduğu fiziksel ve kimyasal özellikleri ile hidrofonik sistemlerde, organik substrat sınıfında kök ortam destekleyici olarak çok yüksek bir kullanım potansiyeline sahiptir. Bu çalışmada, zeytin çekirdeği ve domates sapından split tipi boru reaktör kullanılarak farklı deney koşullarında biochar üretimi gerçekleştirilmiş ve sıcaklık, azot gazı debisi ve ısıtma hızının karbonizasyon katı ürün verimi üzerine etkisi incelenmiştir. En yüksek katı ürün (biochar) verimi değerleri 773 K karbonizasyon sıcaklığı, 5K/dak ısıtma hızı ve 500 ml/dak sürükleyici azot gazı debisi koşullarında sırasıyla zeytin çekirdeği için % 32.58 ve domates sapı için % 37.53 olarak elde edilmiştir. Karbonizasyon katı ürünlerinin karakterizasyon işlemleri, FTIR, TGA, SEM ve BET cihazları kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Karbonizasyon katı ürünlerinin hem toprağa ilavesi şeklinde hem de direkt topraksız tarım katı ortam materyali olarak kullanımını araştırmak amacıyla domates fidesi yetiştirmede denenmiş, farklı oranlardaki karışımlarıyla perlit ve hindistan cevizi lifi gibi diğer topraksız tarımda kullanılan materyallerle karşılaştırması sunulmuştur. Tüm katı ortam materyalleri içinde, en uzun domates fidesi zeytin çekirdeği biocharı ortamında elde edilmiştir. Elde edilen tüm sonuçlar, zeytin çekirdeği biocharının topraksız tarım teknikleri için katı ortam materyali olarak kullanımını desteklemektedir.

HPMA ve poli(Q4-VP) bazlı çift katmanlı antimikrobiyal yara örtüsünün üretimi ve karakterizasyonu

Bu tez çalışmasında kendiliğinden iyileşmesi güç ve enfeksiyon riski yüksek olan yaraların iyileşmesini hızlandıracak ve yarayı bakteriyel istiladan koruyarak yara bölgesinde oluşabilecek ikincil travmaları önleyebilecek özellikte, toksik madde salım sorunu olmayan, poli(Q4-VP)-HPMA bazlı çift katmanlı yara örtülerinin geliştirilmesi amaçlanmıştır. Yara örtüsünün antibakteriyel tabakasını oluşturan poli(Q4-VP) polimerinin sentezi iki aşamada gerçekleştirilmiştir. İlk aşamada 4-vinil piridin monomerinden serbest radikal polimerizasyonu ile poli(4-vinil piridin) polimeri sentezlenmiştir. İkinci aşamada ise üretilen poli(4-VP) polimeri 6-bromokaproik asit ile alkillenme reaksiyonuna sokularak antibakteriyel özellik göstermesi beklenen poli(Q4-VP) polimeri sentezlenmiştir. Sentezlenen polimerlerin yapısal analizi FT-IR ile gerçekleştirilmiştir. Yara örtü malzemesinin ilk katmanını oluşturacak olan makrogözenekli süngerimsi yapı HPMA'nın kriyojelasyonu ile hazırlanmıştır. Malzemenin ikinci katmanını oluşturan antibakteriyel poli(Q4-VP) membran ise elektroeğirme yöntemiyle kriyojel yapı üzerine yerleştirilmiştir. Oluşan çift katmanlı yara örtüleri SEM ile karakterize edilmiştir. Son olarak yara iyileşmesini arttırması amacıyla kriyojel tabakaya doğal iyileşme prosesinde etkili olan askorbik asit (C vitamini) yüklenmiş, C vitamini salımı UV spektrofotometre ile izlenmiştir. xiii Üretilen çift katmanlı yara örtülerinin antibakteriyel özellikleri S.aureus'a ve antifungal özellikleri C.albicans'a karşı incelenmiştir. Tez çalışması sonunda, çift katlı antibakteriyel özellikte, yüksek şişme kapasitesine sahip, yara iyileşmesini uyarıcı özellikte, geçici örtüler elde edilmiştir.

Alzheimer amiloid beta peptidine ait farklı amino asid dizilerinin polielektrolitler ile konjugasyon reaksiyonlarının incelenmesi

Amiloid terimi, özellikle son yıllarda bilim dünyasında önemli bir araştırma konusu haline gelmiştir. Bunun en önemli sebebi, Alzheimer hastalığına neden olan en önemli etkenlerden birinin amiloid beta birikimlerinin meydana gelmesidir. Alzheimer hastalığı, yanlış katlanmış olan Amiloid Beta peptidlerinin beyinde plaklar şeklinde birikim oluşturması sonucu meydana gelmektedir. Bu plaklar genellikle 39-43 amino asitten oluşan ve amiloid beta (Aβ) denen küçük peptid dizilerinden oluşmaktadır. Aβ çok daha büyük bir protein olan ve amiloid öncül protein (APP) olarak bilinen daha büyük bir proteinin çeşitli enzimlerle parçalanması sonucu meydana gelir. Sonuç olarak oluşan Aβ peptid fragmentleri sinir hücrelerinin dışında birikerek senil plaklar denilen yapıları oluştururlar. Bu tez çalışmasında, çağımızın en önemli hastalıklarından biri olarak görülen Alzheimer hastalığına ait peptid bazlı aşı modeli, tanı kiti geliştirilmesi gibi alanlarda kullanılabilecek biyolojik aktiviteye sahip peptid- makromolekül biyokonjugatları ve fiziksel kompleksleri geliştirilmesi amaçlanmıştır. Amiloid beta (Aβ) peptidinin antijenik özellikteki 2 farklı amino asid dizisi ticari olarak satın alınmıştır. Her iki peptid dizisi ayrı ayrı 4 farklı taşıyıcı makromoleküle farklı mekanizmalar ve bağlanma dereceleri ile hem kovalent olarak bağlanmış, hem de bu taşıyıcılar ile fiziksel kompleksleri elde edilmiştir. Bu çalışmada kullanılan taşıyıcı makromoleküller şunlardır: Poliakrilik asid (PAA), [Poli(N-vinil-2-pirolidon-ko-akrilikasid) veya VPAA], Dekstran aldehit (DA) ve Bovin Serum Albumin (BSA)'dir. Bu taşıyıcı moleküllerden PAA ve BSA ticari olarak alınmış olup, VPAA ve DA ise bölümümüzde sentezlenmiş ve karakterizasyonları yapılmıştır. Her iki peptid dizisinin de amino ucuna Triptofan amino asidi eklenerek bu peptidlere floresans özellik kazandırılmıştır. Böylelikle peptidlerin ve daha sonra sentezlenen biyokonjugatların florosans spektrofotometre cihazı ile incelenmesine olanak sağlanmıştır. Sentezlenen bütün biyokonjugat ve komplekslerin fizikokimyasal yapıları incelenmiş ve karakterizasyonları yapılmıştır. Biyokonjugat ve komplekslerin oluşumu, farklı spektroskopik ve kromatografik yöntemlerle aydınlatılmıştır. Elde edilen sonuçlar kıyaslandığında, sulu çözeltide karbodiimid varlığında kovalent bağlar ile oluşan biyokonjugatların daha verimli ve güçlü bağlandığı görülmüştür. Konjugasyon reaksiyonunun oluşumu sırasında floresans boya kullanılarak Floresans Rezonans Enerji Transferi (FRET) yöntemi yardımı ile; intermoleküler mesafe hesabı yapılıp, biyokonjugattaki donör ve akseptör arasındaki mesafe hesabı ile elde edilen bilgiler, saf peptidin konformasyonu ve biyokonjugat oluşumu durumunda peptidin konformasyonundaki değişimler hesaplanmış ve sayısal değerlerle de ifade edilmiştir. Ayrıca literatürde ilk kez Trp içeren Amiloid beta (1-21) peptid dizisi modellenmiş, moleküler mekanik yöntem ile minimum enerjiye sahip olduğu optimize geometrisi belirlenmiştir. FRET yöntemi ile deneysel verilere dayalı elde edilen sayısal değerlerin, teorik olarak hesaplanan değerler ile örtüştüğü ispatlanmıştır. Sentetik aşı modeli olarak tasarladığımız Amiloid beta (Aβ) peptidinin-taşıyıcı makromolekül biyokonjugatları için; in vivo uygulamalarda kullanılan düşük konsantrasyonlarda MCF-7 hücreleri üzerinde yapılan çalışmalarda elde edilen biyokonjugatların özellikle düşük dozlarında önemli derecede toksik bir etki göstermediği ortaya konulmuştur. Ayrıca bu biyokonjugatlarla yapılan MTT deneyleri ile hücre canlılık oranları da kontrol edilerek, IC50 değerleri hesaplanmıştır. Tez kapsamında hücre kültürü ile ilgili yapılan bir diğer çalışmada ise, her iki peptid dizisine ait farklı konsantrasyonlarında sentezlenmiş olan fiziksel kompleksler ve biyokonjugatlar, tek başına taşıyıcı makromoleküller ve tek başına peptid dizileri, işaretleme gerektirmeden, 72 saat boyunca gerçek zamanlı (real-time) ölçüm alan yeni bir yöntem olan XCELLienge Sistemi ile İnsan Umbilikal Ven Edotel Hücreleri (HUVEC) hücrelerine uygulanmış ve bu maddelerin hücrelerin çoğalma hızına etkileri ve toksik etkileri incelenmiştir. Biyokonjugat ve fiziksel kompleksin HUVEC üzerindeki etkileri kıyaslandığında ise, özellikle kovalent bağla bağlanmış olan biyokonjugatların hücre çoğalması üzerinde önemli bir negatif etkisinin olmadığı görülmüş ve hem MCF-7 ile hemde HUVEC ile yapılan hücre çalışmaları sonucunda elde edilen veriler ile de biyokonjugatların deney hayvanları üzerinde kullanabilirliği ortaya konulmuştur. Böylece bu tez kapsamında sentezlenen konugatların Aβ'nın Alzheimer hastalığına karşı spesifik antikorlarının elde edilmesi, nanobiyosensörlerinin oluşturulması, tanı kitlerinin ve biyoteknolojik aşılarının geliştirilmesine ışık tutacak bir çalışmadır. Anahtar Kelimeler: Amiloid beta peptidi, Alzheimer, biyoteknolojik aşılar, biyokonjugat, kovalent konjugasyon, adjuvant, karbodiimid, toksisite.

PEM yakıt pilleri için anot ve katot malzemelerinin geliştirilmesi

Gelişen teknoloji, artan nüfus ve refah düzeyi enerji tüketimini arttırmıştır. Bu ihtiyaçtan doğan teknolojilerden biri de PEM yakıt pili teknolojisidir. Bu teknolojinin diğer enerji dönüşüm sistemlerine göre daha verimli ve sürdürülebilir olması bir avantaj oluşturmasına rağmen katot ve anotta kullanılan değerli metal olan platin miktarının yüksek olması yaygınlaşması önündeki en büyük engellerden biri olarak ortaya çıkmaktadır. Platinin miktarını azaltmak üzere çeşitli karbon destek malzemeleri kullanılmıştır. Bu çalışmada tek ve çift değerlikli iyonların ölçümüne karşı iyi sonuç veren modifiye grafitin karbon destek malzemesi olarak kullanımı araştırılmıştır. Platin öncülleri karbon destek malzemesi üzerine farklı tekniklerle indirgenerek tutturulmuştur. Hazırlanan Pt/C malzemesinin elektrokimyasal analizleri yapılarak performans özellikleri araştırılmıştır. Ayrıca yüzey özelliklerini araştırmak üzere SEM, BET ve BJH analizi yapılmıştır.

Çinko proteinlerinin biyosensör uygulamaları için in siliko optimizasyonları

Günümüzde proteinlere yeni bir fonksiyon kazandırmak ve geliştirmek için birçok çalışma yapılmaktadır. Proteinler, metal iyonlarına geniş bağlanma afinitesi aralığında bağlanarak çeşitli fonksiyonlar gösteren potansiyel sensör moleküllerdir. Proteinlerin metallere bağlanma afinitelerini optimize etmek için çeşitli teknikler mevcuttur. Geleneksel yöntemlerden biri olan "site directed mutagenesis" ile metallerin bağlanma afinitelerini istenilen seviyede optimize etmek zaman alıcı ve zordur. Bu yöntemin bir başka dezavantajı da ekspresyon sırasında inklüzyon cisimcikleri oluşabilmesidir. Ayrıca saflaştırma sırasında eklenen tag dizileri FRET sisteminde spesifik olmayan etkileşimlere yol açabilir. Bu bilgiler ışığında sensör molekülün kararlı ve küçük olması sonucuna varabiliriz. Bu doğrultuda hesapsal bir yaklaşımla daha hızlı sonuçlara ulaşacağımızı öngörmekteyiz. Bu öngörüyle bilgisayar ortamında üç boyutlu yapısı bilinen çinko bağlı kısa peptidlerin optimizasyonunu amaçlamaktayız. Yaptığımız çalışmalarda FoldX programıyla çinko civarı 70 aminoasitten kısa peptidlerdeki aminoasitleri değiştirip mutasyondan önceki ve sonraki afiniteleri elde edebilmekteyiz. Autodock programını da FoldX programını doğrulmak amacıyla birkaç proteinde redocking yöntemiyle kullandık. Çalışmamızın sonucuda hem daha stabil hem çinkonun bağlanma afinitesi artmış mutantlar saptadık. Bu mutantlardan en uygununu seçip deneysel olarak doğrulanması amaçlanmaktadır.

Kimyasal buhar çöktürme yöntemi ile biyosilika tabanlıkta karbon nanotüp üretimi ve kompozitlerinin doku mühendisliğinde incelenmesi

Karbon nanotüpler (KNT) nanoteknolojide öne çıkan en önemli malzemelerden biridir. Üstün mekanik ve yüzey özellikleri karbon nanotüplerin doku mühendisliğinde kullanımını mümkün kılmaktadır. Kemik doku mühendisliğinde doku iskelesi yapımında güçlendirici ve ek malzeme olarak kullanın yanı sıra KNT'lerin hücre büyümesini ve farklılaşmayı arttırıcı etkileri de görülmüştür. Bu yüksek lisans tezi kapsamında karbon nanotüplerin kimyasal buhar çöktürme yöntemiyle üretimi ve doku mühendisliğinde kullanımı araştırılmıştır. Deneysel olarak kimyasal buhar çöktürme yöntemi ile 700°C'de Fe(NO3)3.9H2O katalizörü ve metan gazı ile karbon nanotüp üretilmiştir. Katalizör işlevi gören demir(III)nitrat ile pirinç kabuğu külünden elde edilen biyo kaynaklı sodyum silikat çözeltisi kullanılarak iki tip üretim yapılmıştır. Ayrıca Silika başlatıcısı olarak TEOS'ta kullanılarak karbon nanotüp üretilmiştir. Üretilen karbon nanotüplerin SEM ve TEM cihazı ile karakterizasyonu yapılmıştır. Katalizörün sodyum silikat çözeltisiyle kullanıldığı yöntem ile üretilen karbon nanotüplerin poli laktik asit (PLA) ile doku iskelesi olarak kompozit filmleri hazırlanmış ve mekanik dayanım testlerinden çekme gerilme dayanım testi yapılmıştır. Üretilen KNT-PLA filmlerin mekanik dayanımları dört kat artmıştır. Ayrıca karbon allotroplarından grafen ile karşılaştırma yapılmıştır. Grafen ile KNT'ler ile oluşturulan kompozit filmlerin mekanik dayanıklılıklarının yaklaşık olarak aynı olduğu tespit edilmiştir. Üretilen KNT ve grafen filmler doku iskelesi olarak kullanımı için kemik kanser hücreleri seçilmiştir. Hücre kültürü yapılarak hücre çoğalması üzerine etkileri incelenmiştir. PLA doku iskelesinde hücreler sadece çoğalırken KNT kompozit doku iskelelerindeki hücrelerin aynı anda hem çoğaldığı hemde farklılaştığı görülmüştür. Grafen ile kıyaslandığında KNT içeren doku iskeleleri ile daha fazla kemik hücresi elde edilebilmektedir.

İnsan olfaktör kök hücrelerin izolasyonu kültürünün yapılması karakterizasyonu ve hasar görmüş fasiyal sinirin (ratlarda) rejenerasyonuna etkisinin incelenmesi

Fasiyal paraliz dünyada ve ülkemizde görülen, popülasyonda 30/100.000 insidansı olan, konjenital, nörolojik, metabolik, toksik, neoplastik, enfeksiyöz, travmatik, iatrojenik ve idiopatik nedenlere bağlı olarak ortaya çıkabilen bir hastalıktır. Bu hastalık, insan sağlığını ciddi olarak etkilemenin yanında estetik ve dolayısıyla psikolojik problemlere de neden olur. Şimdiye kadar hastalığın tedavisine yönelik çeşitli yaklaşımlar uygulanmasına rağmen gerek iyileşme hızı gerekse de iyileşme hızına bağlı sekeller, hastalığın tedavisinin önünde önemli engeller oluşturmaktadır. Bu nedenle hasar görmüş sinire bağlı patolojilerin giderilmesinde yeni yaklaşımların geliştirilmesi oldukça önemlidir. Kök hücre alanındaki gelişmeler ve kök hücreye dayalı tedavi yaklaşımlarındaki ilerlemeler sinir doku hasarlarının tedavisinde de yeni ümitlere yol açmaktadır. Periferik sinir hasarlarında yağ, kemik iliği ve hipokampal nöral kök hücre kullanan deneysel çalışmalarda bazı olumlu sonuçlar elde edilse de problemin çözümü henüz mümkün olmamıştır. Son yıllarda yapılan çalışmalarda kök hücre tedavilerinde başarının sağlanması için hasar görmüş bölgenin sahip olduğu mikroçevre ile uygulanan kök hücre kaynağının uygun olması gerektiği vurgulanmaktadır. Literatürde bu konu ile ilgili çalışmalar az sayıda olsa da giderek önem kazanmaktadır. Ayrıca şimdiye kadar fasiyal sinir hasarlarının rejenerasyonunda bu alanda herhangi bir çalışmaya da rastlanılmamıştır. Buna göre de bu tez çalışmasının amacı; insan olfaktör mukoza biyopsi öneklerinden kök hücrelerin izolasyonu, devamlı kültürünün yapılması, karakterizasyonu ve kriyoprezervasyonunu gerçekleştirilmekle, olfaktör kök hücrelerden yeterli miktarda hücre kitlesi elde edilip ilk kez olarak hasar görmüş fasiyal sinir rejenerasyonunda (ratlarda) niş temellerine dayalı yeni bir yaklaşım geliştirilmesi ayrıca ileride hücresel tedaviler ve doku mühendisliği çalışmalarında kullanılmak üzere olfaktör kök hücre kriyobankının oluşturulması olmuştur. Bu amaçla tez kapsamında İstanbul Eğitim ve Araştırma Hastanesi Kulak Burun Boğaz Baş ve Boyun Cerrahisi Bölümü'nde septoplasti operasyonu öncesi onamları alınan 3 hastadan olfaktör mukoza biyopsi örnekleri alınarak Yıldız Teknik Üniversitesi Biyomühendislik Bölümü Hücre Kültürü ve Doku Mühendisliği Laboratuvarı'nda getirildi ve olfaktör kök hücrelerin izolasyonu, kültürü, karekterizasyonu ve kriyoprezervasyonu gerçekleştirildi. Devamlı kültürü yapılan hücreler morfolojik olarak incelendi. Elde edilen hücrelerin kök hücre karakterizasyonunu yapmak üzere hücreler adipojenik, osteojenik ve nörojenik farklılaşma kitleri ile indüklendi ve akım sitometri yöntemi ile immünfenotipik karakterizasyonları yapıldı ve elde edilen kök hücrelerin kriyoprezervasyonu gerçekleştirildi. Olfaktör kök hücreler, in vivo çalışmalarda kullanılmak üzere CM-DiI ile işaretlendi ve hücrelerin üst üste 9 kez pasajlanmasıyla çok tabakalı hücre kitlesi elde edildi. Elde edilen çok tabakalı hücre kitlesinin canlılığının belirlenmesi için in vitro kültürü yapıldı. CM-DiI ile işaretli olfaktör kök hücre kitlesi ile deneysel fasiyal paraliz oluşturulan ratlarda kök hücrelerin periferik sinir rejenerasyonuna etkisini belirlemek üzere in vivo çalışmalar iki aşamada gerçekleştirildi. Bezm-i Alem Vakıf Üniversitesi Deney Hayvanları Laboratuvarı'nda 7 adet Wistar Hannover (350–380 gr) dişi rat kullanılarak yapılan ön çalışmalarda fasiyal kesi sonrası 4 farklı yöntem kullanılarak kök hücrelerin kesi bölgesine inokülasyonu sağlandı. Çalışmada 1. ratın hasar bölgesine 10µl PBS içinde CM-DiI ile işaretlenen 500.000 olfaktör kök hücre inoküle edildi, 2. ratın hasar bölgesine 10µl PBS içinde CM-DiI ile işaretlenen 500.000 olfaktör kök hücre inoküle edildi ve inokülasyon bölgesi rattan alınan yaklaşık 1mm3 yağ dokusu ile (fasya) ile sarıldı, 3 ve 4. ratın hasar bölgesine 10µl PBS içinde CM-DiI ile işaretlenen 500.000 olfaktör kök hücre inoküle edildi ve inokülasyon bölgesine fibrin glue uygulaması yapıldı, 5 ve 6. ratların hasar bölgesine CM-DiI ile işaretlenen çok tabakalı hücre kitlesi inoküle edildi, kontrol grubu olarak 7. ratın hasar bölgesine 10µl PBS aktarıldı. Deney öncesi fasiyal paralizin ölçümü, deney sonrası ise iyileşmenin belirlenmesi için tam kat kesi öncesi ve sonrası 2., 4., 6., ve 8., haftalarda bıyık hareketleri Wiskers skorlama olarak değerlendirildi. Sonuçlar Mann Whitney U istatistiği kullanılarak hesaplandı. Ön çalışma sonuçları dikkate alınarak in vivo çalışmaların ikinci basamağında 27 adet rat M, T ve K isimleri verilerek 3 gruba ayrıldı her bir grupta ratların sol fasiyal siniri kesildikten ve sinir uçları neurotube poliglikolik asit konduite anastomoz yapıldı. Konduitin içine M grubu için hazırlanan çok tabakalı hücre pelleti, T grubu için PBS eklendi. Kontrol grubu olan K grubuna herhangi bir madde verilmedi. Ratlarda iyileşme 2., 4., 6., 8., ve 10. haftalarda fizyolojik, bıyık hareketleri ve elektrofizyolojik olarak izlendi. 10 hafta sonunda ratlar sakrifiye edilerek hasar bölgesinden histolojik inceleme için preparatlar hazırlandı. Preparatlar hematoksilen, eozin, S100, Toluidin Blue ile boyandı ve florasan mikrokopta incelendi. Sonuçlar Mann-Whitney U ile ve Annova ile yapılan istatistik ile değerlendirildi. Elde edilen sonuçlara göre olfaktör dokudan elde edilen hücrelerin morfolojik, immünfenotipik ve farklılaşma özellikleri bakımından kök hücre karakterine sahip oldukları ayrıca dondurularak saklanan hücrelerin 24 ay sonunda canlılıklarını %91 oranında korudukları belirlendi. Olfaktör kök hücrelerin CM-DiI boyası ile işaretlediği ayrıca hücrelerin 9 kez üst üste pasajlanmasıyla elde edilen çok tabakalı hücre kitlesinin kültür ortamında canlılığını koruduğu belirlendi. Whiskers skorlamalarına göre yapılan ön çalışma sonuçlarına göre, uygulanan 4 farklı yöntem içinde en fazla iyileşmenin görüldüğü grubun olfaktör kök hücreler ile hazırlanan çok tabakalı hücre kitlesi uygulanan grup olduğu belirlendi. 27 rat ile yapılan in vivo çalışmalarda elde edilen fizyolojik ve elektrofizyolojik sonuçlara göre fasiyal sinir rekonstrüksiyonunda olfaktör kök hücreler kullanılan grupta sinir rejenerasyonun daha hızlı gerçekleştiği (p=0,030) ve bıyık hareketlerindeki düzelmenin amplitüd değerlerindeki artış ilişkili olarak daha fazla ve anlamlı olduğu belirlendi (p=0,001). S100 boyama ile yapılan histolojik değerlendirmede gözlenen sonuçlara bakıldığında da M grubunda hasar bölgesine nakledilen kök hücrelerin Schwann benzeri hücrelere dönüştükleri belirlendi. Elde edilen bu sonuçlar olfaktör kök hücrelerin kullanıldığı grupta belirlenen sinir rejenerasyon hızı ve düzeyini destekler niteliktedir (p<0,05). 2012-07-04 KAP02 numaralı proje ile Yıldız Teknik Üniversitesi Bilimsel Araştırmalar Proje Koordinatörlüğü tarafından desteklen bu çalışma ile TÜBİTAK tarafından yayınlanan 2003-2023 Teknoloji Öngörü Çalışmasında vurgulanan "Türkiye'de yapılması gereken bilimsel çalışmalar için kök hücre teknolojilerinin geliştirilmesi ve özellikle rejeneratif tıp uygulamalarında kullanılabilir hale gelmesi" hedefine de uygun olarak ulaşılabilir tek nöral kök hücre olan olfaktör kök hücrelerin ülkemizde ilk kez olarak izolasyonu, karakterizasyonu ve kriyoprezervasyonu gerçekleştirildi, kriyobankı oluşturuldu, doku mühendisliğinde kullanılmak üzere çok tabakalı hücre kitlesi hazırlandı ve fasiyal sinir hasarlarında kullanılmasıyla sinir rejenerasyonunu hızlandıran etkin bir hücresel tedavi yöntemi önerildi.

İnsan adipoz dokusu ve adipoz kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin doku mühendisliği uygulamalarında kullanılmak üzere kriyoprezervasyonunun optimizasyonu

Amerikan Plastik Cerrahi Derneği verilerine göre, Amerika Birleşik Devletleri'nde (ABD) 2012 yılı içerisinde yaklaşık 300.000 civarında yumuşak doku defekti tamiri amacı ile mastektomi sonrası meme, el ve yüz gençleştirme işlemlerini de kapsayan cerrahi işlem gerçekleştirilmiştir. Bu rakamın her yıl giderek arttığı bilinmektedir. Ülkemizde ise bu alanda çalışmalar yapılsa da rakamsal bir bilgi bulunmamaktadır. Son yıllarda yumuşak doku mühendisliği ve klinik doku tamiri uygulamalarında kök/progenitör hücrelerin kullanılması ve bu yolla elde edilmiş yapay dokuların oluşturulması gibi yeni yaklaşımlar ve çalışmalar, yer almaktadır. Bu bağlamda lipoaspirasyon metodu ile elde edilebilen otolog adipoz doku, içerdiği zengin kök/progenitör hücre popülasyonu sayesinde adı geçen yumuşak doku defektlerinin giderilmesinde ve iyileştirilmesinde yüksek potansiyele sahiptir. Dünya genelinde yılda milyonlarca lipoaspirasyon ve kozmetik amaçlı adipoz doku rezeksiyonu uygulaması yapılmaktadır. Bu uygulamalardan elde edilen adipoz dokuların etkin ve verimli olarak yakın gelecekte yumuşak doku travmaları dışında pek çok farklı doku mühendisliği veya rekonstrüktif cerrahi uygulaması için doğal otolog doku kaynağı olabileceği düşünülmektedir. Elde edilen adipoz dokunun veya içerdiği progenitör hücrelerin daha sonra kullanılmak üzere kriyoprezervasiyonunun yapılması, kriyopbankta uzun sure saklanması ve gerektiğinde biyolojik özelliklerini kaybetmeden kriyobanktan çıkarılarak çözülmesi, ve alıcının ihtiyaç duyulan bölgesine nakli sonrasında iyi sonuçların elde edilmesi oldukça önemli olup, yumuşak doku mühendisliği ve plastik/rekonstrüktif cerrahinin esas hedeflerinden biridir. Ancak kriyobiyolojinin bu alanında hücre ve dokuların dondurulma/çözülmeleri sonrası klinik kullanımlarıyla ilgili varolan ciddi problemler (insan adipoz dokusu ve aynı dokudan elde edilen mezenkimal kök hücrelerin, çözme sonrası düşük viabilite, nakledilen bölgede yüksek re-absorbsiyon vb.) halen giderilememiştir. Şimdiye kadar dünyada bu alanda çeşitli çalışmalar yapılsa da halen verimli bir adipoz doku/adipoz doku kaynaklı-mezenkimal kök hücre kriyoprezervasyon yöntemi geliştirilememiştir. Bunun nedenlerinden biri, şimdiye kadar uygun kriyoprotektanların, kriyoprotektan konsantrasyonlarının, karışımlarının, vitrifikasiyon gibi önemli kriyoprezervasiyon yönteminin adipoz doku/adipoz doku kaynaklı-mezenkimal kök hücrelerde yeterince incelenmemiş olmasıdır. Ayrıca mevcut yaklaşımların doku yenileme ve uygulanan bölgede mevcut hasarın tamirindeki etkinliği konusunda bugüne kadar gerçekleştirilen az sayıda klinik-öncesi ve klinik çalışmada, kök hücre ve içinde bulunduğu niş özellikleri dikkate alınmadığından çalışmalar her zaman olumlu sonuçlar vermemektedir. Mevcut bilgilere dayanarak bu tez çalışmasının amacı, yumuşak doku mühendisliği uygulamalarında kullanılmak üzere insan adipoz dokusu ve aynı dokudan elde edilen mezenkimal kök hücrelerin, mevcut konvansiyonel yöntemler ile kriyoprezervasyonundaki yapısal ve fonksiyonel düzeydeki etkinliklerinin belirlenmesi, adipoz doku ve içerdiği kök hücrelerin kriyoprezervasyonu ile ilgili mevcut problemlerin giderilmesinde vitrifikasyon metodu ile kriyoprezervasyon rejimlerinin ve yaklaşımlarının etkinliğinin incelenmesi, elde edilen verilere dayanarak insan adipoz doku/adipoz doku-kaynaklı mezenkimal kök hücre kriyoprezervasyon protokollerinin optimize edilmesi ile klinik kullanıma uygun doku ve hücre saklama amaçlı kriyobank oluşturulmasıdır. Belirlenen amaç doğrultusunda çalışma genelinde 10 farklı donörden lipoaspirasyon (n=8) ve cerrahi eksizyon (n=2) uygulamaları sonrası elde edilen adipoz doku örnekleri kullanıldı. Örneklerin 6'sına adipoz kaynaklı mezenkimal kök hücre izolasyonu amacı ile enzimatik ayrıştırma tekniği uygulandı. Hücre izolasyonu aşamasında ayrıca manyetik tabanlı hücre ayrıştırılması tekniği de kullanıldı. İzole edilen hücrelerin kök hücre olma özellikleri in vitro kültürdeki morfolojik analiz, akış sitometrisi (CD90, CD105, CD29, CD34, CD45) ve in vitro ekspansiyon/farklılaşma testleri kullanılarak ölçüldü. Doku ve hücre kriyoprezervasyonu için, içerisinde kriyoprotektan olarak DMSO, etilen glikol ve sükroz'un farklı konsantrasyonları veya kokteylleri bulunan aşamalı yavaş dondurma (%10 DMSO; %10DMSO+0,2M sükroz; 0,5M sükroz) ve vitrifikasyon teknikleri (%15 DMSO+%15 etilen glikol+0,5M sükroz; %30DMSO+%30 etilen glikol+0,5M sükroz) kullanıldı. Kriyoprezervasyon sonrası dokuların yapısal durumları immünohistokimya tekniği ile, hücrelerin yapısal ve fonksiyonel durumları ise Tripan mavisi boya dışlama testi, TUNEL testi ile DNA fragmantasyon analizi ve in vitro farklılaşma analizi kullanılarak ölçüldü. Çözme sonrası doğrudan dondurulan veya dondurulmuş dokudan izole edilen hücreler ayrıca morfolojik ve in vitro ekspansiyon özellikleri bakımından incelendi. İncelemeler ve ölçümler sırasında elde edilen kantitatif veriler SPSS versiyon 10.0 for windows programı ile değerlendirildi ve değerlendirme sırasında p<0,05 değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. Deney üç aşamada gerçekleştirildi. İlk aşamada elde edilen örneklerden 6'sında (4 örnek lipoaspirasyon ve 2 örnek cerrahi eksizyon yöntemi) enzimatik ayrıştırma metodu uygulanarak hücre izolasyonu gerçekleştirildi. Elde edilen bu hücrelerin in vitro kültürdeki gelişim ve morfolojik özellikleri, akış sitometrisinde elde edilen kök hücre işaretçikleri sonuçları ve in vitro farklılaşma sonrası mezoderm kaynaklı farklı hücrelere dönüşüm özellikleri gösterildi ve mezenkimal kök hücre oldukları konfirme edildi. İkinci aşamada bu hücreler kullanılarak mevcut konvansiyonel kriyoprezervasyon ve vitrifikasyon protokollerinde kullanılan DMSO ve etilen glikol (EG) kriyoprotektanlarının farklı konsantrasyonları (%1 - %30), farklı kombinasyonları ve hücre ile farklı inkübasyon süreleri (10 – 40 dakika) bakımından sitotoksik ve genotoksik etkileri incelendi. DMSO ve etilen glikolün %10'dan yüksek konsantrasyonlarında ve 20 dakika'dan uzun inkübasyon sürelerinde hücresel canlılık düzeylerinde anlamlı azalma gözlendi (p<0,05). Hücre viabilite incelemesi ile eş zamanlı gerçekleştirilen DNA fragmantasyon testlerinde ise adı geçen parametreler yönünden istatistiksel olarak anlamlı bir artış görülmedi (p>0,05). Çalışmanın üçüncü aşamasında, deney kapsamında elde edilen insan adipoz dokuları (n=4) ve adipoz doku-kaynaklı mezenkimal kök hücreleri (n=4), mevcut konvansiyonel ve vitrifikasyon protokolleri kullanılarak doku ve hücre dondurma programlarına alındı. Her iki grup, ayrı ayrı olarak iki farklı metod (aşamalı yavaş dondurma ve vitrifikasyon), farklı inkübasyon süreleri ve kriyoprezervasyon sonrası farklı saklama sıcaklıkları yönünden test edildi. Hücre düzeyinde gerçekleştirilen kriyoprezervasyon uygulamalarında, aşamalı yavaş dondurma gerçekleştirilen %10 DMSO ve %10DMSO+0,2M sükroz grubu ile, vitrifikasyon uygulanan VS1 ve VS2 gruplarında kontrol grubuna göre anlamlı olarak yüksek canlılık oranları elde edildi (sırasıyla %80,2, %88,9, %85,4, %68,2 ve %12,2; p<0,01). Doku düzeyinde gerçekleştirilen kriyoprezervasyon uygulamalarında ise vitrifikasyon uygulanan VS1 ve VS2 grubunda, aşamalı yavaş dondurma uygulanan %10 DMSO ve %10 DMSO+0,2M sükroz gruplarındaki dokulara ve kontrol grubuna kıyasla daha yüksek canlılık oranları elde edildi (sırasıyla %90,2, %82,0, %50,0, %62,8 ve %10,2; p<0,01). Aşamalı yavaş dondurma grubunda dondurulan doku örneklerinin ve içerdikleri kök hücrelerin +4°C 'de ve -20°C'de uzun süreli saklanmaları sonrası canlılık ve fonksiyonelliklerini kaybettikleri gözlendi. Gerek hücre, gerekse doku düzeyinde gerçekleştirilen dondurma ve çözme işlemleri sonrası canlı olarak tespit edilerek kültüre edilen hücrelerin, yapılan in vitro ekspansiyon ve in vitro farklılaşma testlerinde, hücre gelişim hızlarında ve adipojenik, kondrojenik ve osteojenik farklılaşma potansiyelleri arasında istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık gözlenmedi. Sonuç olarak bu tez çalışması kapsamında, günümüzde kullanılmakta olan farklı konvansiyonel doku ve hücre kriyoprezervasyon protokollerinin ve mevcut literatürde ilk kez olarak farklı vitrfikasyon protokollerinin adipoz doku ve içerdiği mezenkimal kök hücreler üzerindeki etkinlikleri eş zamanlı olarak incelenmiştir. Elde edilen sonuçlar, aşamalı yavaş dondurma ve vitrifikasyon yöntemi kapsamında kullanılan kriyoprotektanların ve uzatılmış inkübasyon sürelerinin insan adipoz dokusu ve içerdiği mezenkimal kök hücrelerinin viabilitesi ve fonksiyonelliği üzerinde ciddi ve olumsuz etkiler oluşturabildiğini göstermiştir. Sonuçlar ayrıca kriyoprezervasyon işlemlerinin klinik etkinliğinin arttırılması amacı ile doku ve hücre dondurma işlemlerinin ayrı ayrı optimize edilmesi ve uygulanması gerektiğini de doğrulamıştır. Bu bulgulara ilave olarak, mevcut güncel çalışmalarda raporlanmış konvansiyonel saklama sıcaklıklarının (+4°, - 20°C ) adipoz doku ve içerdikleri ADK-MKH popülasyonunun uzun vadeli etkin ve verimli saklanması için yeterli olmadığı görülmüştür. Sonuç olarak tez kapsamında bir adipoz doku/adipoz doku kaynaklı-mezenkimal kök hücre kriyoprezervasyonunda en uygun dondurma rejiminin doku için vitrifikasyon, ADK-MKH'ler için ise aşamalı yavaş dondurma olduğu saptanmıştır. Bu bilgiye dayanarak adipoz doku/adipoz doku kaynaklı-mezenkimal kök hücrelerin kriyoprezervasiyon protokolları geliştirilmiş ve optimize edilmiştir. Çalışmamız sırasında elde edilen sonuçlar doğrultusunda ayrıca etkin bir doku ve hücre kriyobankı oluşturulmuştur. Sonuçlarımızın, yakın gelecekte kök hücre ve doku mühendisliği alanında gerçekleştirilecek yeni araştırma, klinik öncesi veya klinik kullanım amaçlı üretim teknikleri, hücre karakterizasyonu ve farklılaştırma çalışmalarında kullanılmak üzere önemli bir kaynak oluşturacağı düşünülmektedir. Anahtar Kelimeler: Adipoz doku, ADK-MKH, Yumuşak doku mühendisliği, Kriyoprezervasyon, Aşamalı yavaş dondurma, Vitrifikasyon.

Amilaz ve asit fosfataz tespit kitinin geliştirilmesi

Amilaz tükürükte bol miktarda bulunan ve tükürük biyomarkerı olarak kullanılan bir enzimdir. Asit fosfataz ise semende yoğun olarak bulunmakta ve semen varlığının tespitinde kullanılmaktadır. Tükürük ve semenin tespiti özellikle adli tıpta cinsel saldırı vakalarında kanıt niteliği taşımaktadır. Tez çalışmasında cinsel saldırı vakalarında biyolojik kanıt olan semen (asit fosfataz) ve tükürüğün (amilaz) tespiti için yeni bir yöntemle tanı kiti geliştirilmiştir. Asit fosfataz tespiti için kullanılan yöntem alfa naftil fosfatın enzim varlığında naftole hidrolize olması ve ortaya çıkan bu ürünün diazonyum tuzu ile birleşerek renk değiştirmesi prensibine dayanmaktadır. Amilaz tespiti için ise nişasta iyot testi kullanılmıştır. Her iki test için hazırlanan reaksiyon çözeltileri özel bir jel matrikse emdirilerek destek ortam oluşturulmuştur. Semen örneklerinde hassasiyet tespiti için 10.000 ila 100.000 arasında, amilaz tespiti için ise 100 ila 1000 arasında seyreltmeler uygulanmıştır. Zamana bağlı aktivite tayini için 5 mm2 çaplı pamuklu kumaşlara semen ve tükürük örneklerinden 10 µl damlatılarak kurumaya bırakılmıştır. 0., 1., 6., 12., 24., 36., 48., 60., 72. saatlerde distile suyla çözülerek analizi yapılmıştır. Semen örneklerinde asit fosfataz tespitinde 1/70.000, tükürük örneklerinde amilaz tespitinde ise 1/900 seyreltme oranlarına varan başarı elde edilmiştir. Zamana bağlı aktivite tayininde literatür de aktivitenin büyük bir çoğunluğunun kaybedildiği bildirilen 72. saatte bile enzim aktivitesi tespit edilmiştir. Çalışmada geliştirilen matriks destekli yöntemin oldukça pratik ve hassas olduğu saptanmıştır.

Sık görülen bakteriyel türlerin tanısını gerçekleştirmek üzere biyoinformatik analizlerin yapılması ve kütle spektroskopisine dayalı bir panelin geliştirilmesi

Gıda güvenliği ve sürdürülebilir hayvancılık, artan dünya nüfusu ile birlikte günümüzde hızla önemini arttırmaktadır. Bu kavramları tehdit eden en önemli unsurlardan biri enfeksiyon hastalıklarıdır. Çiftlik hayvanlarında et ve süt üretiminde verim kaybına ve tedavi edilmediği takdirde ölümlere neden olarak önemli ekonomik kayıplara yol açan enfeksiyonlar, bazı durumlarda insanlarda da ciddi hastalıklara sebep olabilirler. Öngörülen belirtileri taşıyan bireylerden alınan numunelerde bu bakterilerin tespit edilmesi ve tanısının yapılması uygulanacak tedavi yönteminin belirlenmesinde kilit önem taşımaktadır. Günümüzde patojenlerin tanısında kullanılan en yaygın yöntemler kültür, serolojik, biyokimyasal ve moleküler tanı yöntemleridir. Ucuz ve kolay olmasına karşın uzun sürede sonuç vermesi, tür düzeyinde tanıya imkan vermemesi ve düşük hassasiyetleri kültür tabanlı yöntemlerin ve serolojik yöntemlerin en büyük sınırlamasıdır. Moleküler tabanlı metotlar ise çoklu örneğe bir anda bakılmasını son derece sınırlamakta bu durum da iş yükünü ile beraber maliyeti de arttırmaktadır. Bu tez çalışmasında 26 farklı patojenin tanısını, çoklu örnekte ve yüksek doğrulukta gerçekleştirmeyi mümkün kılan bir panel geliştirilmesi hedeflenmiştir. Bu amaçla 26 patojene ait iki farklı gen bölgesinde bulunan ilk kez bu tez çalışmasında belirlenmiş olan 208 SNP (tek nükleotit polimorfizmi) tespit edilmiştir. Patojen olduğu bilinen türler için biyoinformatik araçlarla belirlenen türe özgü SNP'lerden 17 tanesi seçilerek, MALDI-TOF MS/iPLEX genotipleme sistemi ile test edilmesi sonucunda, sistemin uygulanabilirliği gösterilmiştir. Yapılan tez çalışması ile, istenildiği taktirde tür sayısının genişletilmesi veya panele dahil olan türlerin kullanıcı ihtiyacına göre seçilerek kullanımının sağlanması nedeniyle; kaynaktan bağımsız olarak, yüksek doğrulukta çoklu örnekte tanı yapabilen, kullanıcı kolaylığı sunan, bir panel tasarlanmıştır. Tasarlanan panelin, ticari kullanıma sunulmasından önce optimizasyon ve validasyon çalışmalarının yapılması, bu tez kapsamında çalışılan 26 mikroorganizmanın tek panelde ilk kez türe özgü tanısının gerçekleştirilmesine imkan sunarak, benzer mikroorganizmalarla yapılacak olan araştırmalara ışık tutacağı düşünülmektedir.

Kumarin türevlerinin Bacteroides fragilis'in D-LDH enzimi üzerine olan inhibitör etkisinin belirlenmesi

Bacteroides fragilis insan kolon florasında doğal olarak bulunan anaerobik bir bakteridir. B. fragilis'in D-laktat dehidrogenazı (BfD-LDH), D-laktatın piruvata dönüşümünü katalize eden çok önemli bir enzimdir ve anaerobik glikolizi düzenler. B. fragilis ile ilgili yapılan son çalışmalar kolon kanseri ile ilişkisini açığa çıkarmıştır. Dünya genelinde B. fragilis'in enterotoksijenik suşunun sebep olduğu enfeksiyonlara karşı antibiyotik direnç geliştiği bildirilmiştir. Bu nedenle, bu enfeksiyonların tedavisi için yeni yaklaşımlar bulunmasına yönelik çalışmaların yapılması zorunludur. Bu tez çalışmasında, B. fragilis'in kolon florasındaki enfeksiyonunun baskılanması için BfD-LDH'ın inhibe edilmesi hedeflenmiştir. Laboratuvar grubumuz tarafından klonlanmış ve protein ekspresyonu gerçekleştirilmiş olan BfD-LDH'ı saflaştırmak için Ni-NTA agaroz kolonları ile afinite kromatografisi yöntemi uygulanmıştır. SDS-PAGE analizi ile enzimin yüksek miktarda ve %95 üzeri saflıkla elde edildiği gösterilmiştir. Daha önce sentezlenmiş olan ve -hidroksi, -asetoksi ve -metoksi grupları taşıyan 29 adet kumarin türevinin BfD-LDH üzerindeki inhibe edici etkileri spektrofotometrik olarak incelenmiştir. Yapılan taramada 15 kumarin türevinin 10 µM ve altında IC50 değeri ile BfD-LDH'ı yüksek seviyede inhibe ettiği bulunmuştur. En düşük IC50 değerini gösteren 3 kumarin türevi için (K5: 0,47 µM, K21: 0,57 µM ve K23: 0,057 µM) enzim inhibisyonu mekanizması ve enzimli reaksiyonun kinetik parametreleri ayrıntılı olarak incelenmiş ve bu bileşikler ile BfD-LDH inhibisyonu mekanizmasının yarışmasız inhibisyon olduğu bulunmuştur (Ki değerleri sırasıyla; 0.4532, 0.5183 ve 0. 3603 µM). In silico analiz için ChemDraw V10 programı ile kumarin türevlerinin kimyasal yapıları çizilmiş ve MarvinSketch V6.2 programı ile konformasyonları gösterilmiştir. Kumarin türevlerinin docking çalışmaları Molegro Virtual Docker programı ile gerçekleştirilmiştir. Yapılan docking çalışmaları sonucunda kumarin türevlerinin enzimin aktif kalıntıları ile etkileşip etkileşmedikleri gösterilmiştir. Bu çalışma BfD-LDH üzerine yapılan ilk inhibisyon çalışmasıdır. Bulunan yüksek inhibisyon sonuçları ve enzimin insanda eşdeğerinin olmaması daha ileri in vivo çalışmalar için ümit vericidir.

Removal of lead from aqueous solutions by using nanoporous silica materials obtained from wheat husk biosilica

Various technological innovations came into our lives with the rapid development of the industry and serious environmental pollution occurred as a result of industrialization which is incontrovertible. The heavy metal pollution poses a serious problem for health that is a current problem in terms of environmental pollution. The heavy metals in industrial waste water are deposited especially by water and soil, blending by plants and animals and then leads to health problems in people by participating to the food chain. The adsorption method is widely preferred for heavy metal removal due to being inexpensive and easy. The evaluation of wastes is an important issue depending on the sustainable development of the existing strategy on the agenda of European Union countries and many others. The evaluation of waste materilas by reusing or recycling to produce materials is located primarily. The other evaluation methods are using the wastes in energy field and if possible disposal them with the ecologically advantageous methods. In another aspect, gradually increasing ash wastes leads to global warming and environmental pollution. Therefore, evaluation of agricultural waste ashes and investigation the chemistry in order to determine the properties of ashes is one of the current topics to be addressed by the scientific community. Wheat is a major crop product. Dehusking results in large quantities of the wheat husk that is generally burned and produces a solid waste – the wheat husk ash. Most of the times, the ashes are either dumped or left to their fate, thus one way or another it can cause pollution. Ashes consist of amorphous silica that can be used to synthesize the silica-based materials. The current study aimed to utilize agricultural waste, wheat husk to produce nanoporous silica materials as zeolite NaA and silica aerogel for the first time to use for the adsorption of lead ions from aqueous solutions. The silica is extracted from the raw material, wheat husk that was leached by acid. The effect of production conditions on the surface and physical properties of adsorbents obtained from wheat husk silica were investigated and discussed based on the results obtained by means of various techniques including N2 adsorption, Fourier transform infrared, X-ray diffraction, scanning electron microscope and energy dispersive X-ray. The influence of adsorbent dose, initial lead concentration, pH, temperature and time on lead removal from aqueous solutions by use of nano-porous silica materials were evaluated in the batch system. The lead removal by zeolite NaA was evaluated statistically using the Box-Behnken method. The adsorption conditions were optimized, and the mechanisms of adsorption are determined. Equilibrium adsorption data were applied to Langmuir, Freundlich, and Dubinin Radushkevich adsorption model. Regeneration of zeolite NaA and silica aerogel samples were carried out by using different strength of salt and acid solutions, respectively. The pore size and surface area of nanoporous silica materials were ranged between 3.26-45.75 nm and 0.48-328.88 m2 g-1, respectively. Maximum Pb(II) removal was obtained at pH 5.5. The polynomial (quadratic) model provided the best fit to experimental data were for all adsorbents. Consequently, zeolite NaA and silica aerogel were found to be effective adsorbents to remove lead Pb(II).

Yeni tip solar biyoreaktör geliştirilmesi

Doğal aydınlatma, tüm sınırlı ve sınırsız ortamlarda öncelikli olarak iyi görme koşullarının sağlanması için gerekli bir faktördür. Gün ışığı kullanılarak oluşturulan doğal aydınlatma sistemleri, son yıllarda giderek önem kazanmaktadır. Bu tez çalışmasında, fresnel lens ve fiber optik kablodan oluşan entegre bir solar-optik sistemle fotobiyoreaktörün içi aydınlatılmıştır. Öğlen saatlerinde, 12 adet fresnel lensin odağında bulunan fiber optik kablo girişine gelen ve fiber optik kablo çıkışına aktarılan aydınlık şiddeti değerleriteorik olarak hesaplanmıştır. Ayrıca, solar biyoreaktör içindeki toplam aydınlık şiddeti değerleri, fresnel lens kullanılmadan meydana gelen toplam aydınlık şiddeti değerleriyle karşılaştırılmıştır. Elde edilen sonuçlara göre, fresnel lens kullanıldıktan sonra solar biyoreaktör içindeki aydınlanma düzeyinin oldukça arttığı görülmüştür. Ayrıca, belli bir seviyeye kadar mikroalg doldurulan biyoreaktör içinde dört tane fiber optik kablodan elde edilen aydınlık şiddeti değerleri ve fresnel lensin ışığı aktarma yüzdesi hesaplanmıştır. Tek bir fresnel lens ve fiber optik kablo için fiber optik kablonun aydınlık çıkış şiddeti, kritik açı değeri ve konsantrasyon oranı bulunmuştur. Konsantrasyon oranı, fresnel lensin üzerine gelen ışığın büyük kısmını yoğunlaştırdığını göstermektedir.

Leishmania tropica parazitlerinden elde edilen immünojen moleküllere karşı tanıda kullanılmak üzere hibridoma teknolojisine dayalı antikor üretilmesi

Ülkemizin ve dünyanın ciddi halk sağlığı problemlerinden biri olan leishmaniasis zoonotic bir hastalıktır. Dünya Sağlık Örgütü'nün yayınladığı veriler çerçevesinde her yıl yeni 2 milyon vaka ile beraber dünyada 350 milyon kişi bu hastalığın tehditi altında yaşamakta olup, 90 ülkede endemiktir. Leishmaniasisin kutanöz, mukokutanöz ve visseral olmak üzere üç formu mevcuttur. Türkiye'de kutanöz leishmaniasise Leishmania tropica, mukokutanöze Leishmania major, visseral leishmaniasise ise Leishmania infantum sebep olmaktadır. Tedavide kullanılan antimonyal ilaçlara ve vektörlerde ise kullanılan insektisistlere karşı direncin gelişmesi, şuana kadar etkin bir aşının geliştirilememesi ve ayrıca tanıdaki sorunların şimdiye kadar giderilememesi hastalığın geniş yayılım göstermesinin nedenleri arasında yer almaktadır. Leishmaniasisin tanısında mikroskobik, kültür ve mikrokültüre dayalı sistemler, serolojik ve moleküler yöntemler kullanılmaktadır. Mevcut tanı yöntemlerinin hastalığın farklı formlarına ve parazitin türüne karşı gösterdikleri duyarlılıkları birbirinden farklıdır. Bu yöntemler arasında daha yaygın kullanılan klasik mikroskobik yöntemlerin temelini Giemsa boyalı preperatlar oluşturmaktadır. Ucuz ama kısmen uygulanabilir olan mikroskobik yöntemlerin dezavantajı, örneklerin içerdiği parazit sayısına bağlı olarak duyarlılık derecesinin değişimidir. Diğer bir yöntem olan kültür yönteminde, kapalı bir sistem içerisinde parazit gelişimin gözlenmesi mümkün olsa da bu hastalığın tanısının koyulabilmesi için 15-30 günlük uzun sürelere gereksinim duyulmaktadır. Kültür yöntemlerinin bu dezavantajına karşın, sonraki yıllarda geliştirilen mikrokültür yöntemi ile daha kısa sürede (1-5 gün) daha yüksek duyarlılık sağlanmıştır. Bu yöntem sadece leishmaniasisin tanısında değil, donör kanlardan elde edilen örneklerde, aşı geliştirilmesinde, farelerin sakrifiye edilmeden çalışılmasında, kök hücre izolasyonu ve helikobakter tanısında da örnek bir model oluşturmuştur. leishmaniasisin tanısında kullanılmak üzere geliştirilen izoenzim analizleri, polimeraz zincir tepkimesi, gerçek zamanlı polimeraz zincir tepkimesi gibi moleküler tabanlı yöntemler de kullanılmaktadır. Bu yöntemlerinde dezavantajlarının başında, parazite bağlı duyarlılıkla beraber pahalı olması ve uzmanlık gerektirmesi gelmektedir. Leishmaniasis hastalığında, parazitin yüzey antijenlerini hedef alan antikor temelli diagnostik önem teşkil eden serolojik yöntemlerde bulunmaktadır. Erken tanı için avantaj sağlayan bu serolojik yöntemlerin başında immünofloresans boyama tabanlı IFAT, ELİSA ve rK39 kitleri gelmektedir. Mevcut serolojik yöntemlerin temelini serumda bulunan antikorların tespiti oluşturmaktadır. Ticari olarak üretilen ve leishmaniasisin tanısında kullanılan rK39 kiti, visseral leishmaniasisli hastalarda daha yüksek duyarlılığa sahipken; kutanöz leishmaniasisli hastalarda duyarlılığın oranı %20 civarlarında kalmaktadır. Buna göre de kutanöz leishmaniasisde uygulanan serolojik yöntemlerin düşük duyarlılığı ancak lezyon bölgesinde parazite has antijenin bulunmasına dayandırılabilir. Dünya'da ve ülkemizde kutanöz leishmaniasisli hastaların tanısında kullanılmak üzere rK39 kitine benzer herhangi bir çalışmaya rastlamadık. Bu tarz test kitlerlerinin hazırlanmasının temelinde ise; hibridoma teknolojisine dayalı antikorların üretilmesi gelmektedir. Hibrodoma teknolojisi ile bir çok hastalığa karşı yüksek özgüllük ve afiniteyi sağlayan tanı sistemleri oluşturulmaktadır. Dünya'da leishmaniasise karşı hibridoma teknolojisine dayalı çalışmalar daha çok üretilen antikorların çapraz reaksiyonlarını incelemekle kalmış, etkili bir tanı sisteminin geliştirilmesine ait herhangi bir çalışmaya rastlanmamıştır. Daha önce laboratuvarımızda tamamlanan yüksek lisans tez çalışması kapsamında visseral leishmaniasis etkeni L.infantum'a karşı hibridoma teknolojisine dayalı monoklonal antikor üretilmiştir. Bu alandaki çalışmaların yetersiz olmasının nedenlerinden biri de immün yanıt oluşturmada yaşanan zorluklardır. Leishmaniasise karşı yapılan hibridoma çalışmalarının ortak noktalarından biri de immünizasyon aşamasında Freund's adjuvanının kullanılmasıdır. Bu adjuvanın etkili ama toksik olduğu yapılan çeşitli çalışmalar ile belirtilmiştir. Sıklıkla kullanılan bu adjuvanın toksik özellikte olması yeni adjuvan gereksinimlerini beraberinde getirmektedir. Buna göre de bu tez çalışmasının amacı, L.tropica parazitlerinin immünojen moleküllerine karşı kutanöz leishmaniasisin tanısında kullanılmak üzere hibridoma teknolojisine dayalı antikor üretilmesi ve çeşitli adjuvanların antikor üretimi üzerindeki etkinliğinin incelenmesi olmuştur. Amaca ulaşmak için Leishmania tropica parazitlerinden elde edilen yüzey antijen molekülleri ile aşılanan farelerin dalak hücrelerinden izole edilen B-lenfositleri ile kemik iliği kanser hücresi olan myelomaların füzyonu sonucunda oluşturulan hibridoma teknolojisini temel alan antikor üretimi gerçekleştirilmiştir. Bu teknolojinin aşamaları arasında yer alan immünizasyonda, Leismania tropica tüm yüzey antijenleri ile literatürde sıklıkla kullanılan Freund's adjuvan kompleksi ve literatürden farklı olarak polimerik temelli, FDA onaylı ve toksik olmayan polioksidonyum (PO) adjuvanı kullanılarak, farelerde oluşan immün yanıtlar karşılaştırılmıştır. Yeterli yanıtların alındığı fareler servikal dislokasyon yöntemi ile kesilerek B-lenfositleri izole edilmiş ve kemik iliği kanser hücreleri olan myelomalarla füzyona uğratılmıştır. Hibridoma teknolojisi ile üretilen hibrit hücrelerin ürettikleri antikorlar ELİSA sistemi ile test edilmiştir. Ayrıca oluşturulan bu hibridoma hücrelerinin ürettikleri antikorlar yalnızca Leishmania parazitine karşı değil, aynı zamanda immünizasyon aşamasında kullanılan adjuvana karşı da oluşup oluşmadığı da ilk incelenmiştir. Hibridoma hücrelerinin ürettiği bu antikorun aynı zamanda parazitin yüzeyinde yer alan ve en immünojenik molekül olan lipofosfoglikana (LPG) ve Leishmania'nın diğer türleri olan L. major ve L. infantum'a karşı da oluşup oluşmadığı test edilmiştir. Bununla birlikte hibridoma hücrelerinin literatürde yer alan dondurma protokolleri izlenerek, kriyoprezervasyon öncesi ve sonrası ürettikleri antikor dinamiği incelenmiştir. Elde edilen sonuçlar çerçevesinde, Freund's adjuvanı ile immünize edilmiş farelerde 6.İmmünizasyon sonrasında, PO ile immünize edilmiş farelerde ise 8.immünizasyon sonucunda antikor düzeyinin kontrole göre yaklaşık 5.5 kat arttığı saptanmıştır. Ayrıca aynı serum örneklerinde adjuvana karşı yanıt oluşup oluşmadığı da test edilmiştir. Buna göre de 8. İmmunizasyon sonucunda adjuvan olarak Freund's kullanılan farelerin Freund's'a karşı oluşturduğu antikor yanıtının kontrole göre yaklaşık olarak 3 kat arttığı; PO adjuvan olarak kullanıldığı farelerde ise 8.İmmunizasyon sonucunda bu adjuvana karşı oluşan yanıtın kontrole göre anlamlı bir değişme göstermediği saptanmıştır. Sonraki aşama olan füzyon sonucu oluşan hibridomaların seçici besiyeri içerisinde kültürü yapılmış ve ürettikleri poliklonal antikor yanıtları ELİSA yöntemi ile tespit edilmiştir. Bu antikor yanıtlarına göre hibridoma kültürünün 10. ve 20. günlerinde L.tropica'ya karşı poliklonal antikor oluşumu gözlenmiştir. Ayrıca bu antikorların etkinliği sadece antijen kaplamalarla değil; aynı zamanda adjuvan kaplamalar yapılarak da incelenmiştir. Freund's grubu hibridomalarının antijene özgü yanıtları 10. güne kıyasla 20. günde daha da azalmıştır. PO grubu hibridomalarının antijene özgü ürettikleri antikorlar 10. güne göre 20. günde daha yüksek olduğu tespit edilmiştir. Freund's grubu hibrit hücrelerinin ürettikleri antikorun yalnızca antijene spesifik olmadığı, aynı zamanda adjuvanın kendisine de bir yanıt oluşturduğu tespit edilmiştir. PO ile yapılan kaplama sonuçlarında ise hibridomaların ürettikleri antikor yanıtlarının 10. güne karşın 20. günde daha da azaldığı görülmüştür. Üretilen antikorların tüm parazit Leishmania ve Leishmania'nın en immünojenik yüzey molekülü olan LPG'ye karşı oluşturduğu yanıt tespit edilmiştir. Hibridomaların antikor üretme yetenekleri kriyoprezervasyon öncesi ve sonrasında karşılaştırmalı olarak incelenmiş ve üretilen bu antikorların sadece L.tropica'ya özgü değil, L.infantum ve L.major'e karşı da farklı duyarlılıkta etki gösterdiği tespit edilmiştir. Bu çalışmalar ışığında, üretilen antikorların ileride kutanöz leishmaniasisin tanısında kullanılmak üzere tanı kitlerinin geliştirilmesinde mümkün olduğu düşünülmektedir. Ayrıca, deneysel değere de sahip olan bu antikorlar, parazitlerin besiyerleri içerisine eklenerek, üretildikleri antijenlerin, enfektivite özelliklerinin, promastigot-amastigot farklılaşması gibi evrimsel süreçlerinin incelenmesine olanak sağlamaktadırlar. Böylece bu çalışma kapsamında kutanöz leishmaniasise karşı hibridoma teknolojisine dayalı antikor üretiminde L.tropica parazitlerden dondurup-çözme yöntemi ile elde edilen immünojen moleküllere karşı antikor üretilmesinde Freund's adjuvanına karşı ilk kez olarak toksik olmayan FDA onaylı PO daha etkin olduğu ortaya çıkmıştır.

Bitki hastalıklarının tespiti için kalsiyum seçici sensörlerin kullanılabilirliğinin araştırılması

Bitkilerde olumsuz çevre koşulları ve çeşitli organizmalara bağlı olarak ortaya çıkan stres, her yıl büyük miktarda ürünün kaybedilmesine sebep olmaktadır. Bu durum, bitki hastalıklarının erken tespit edilerek gerekli tedbirlerin zamanında alınmasını zaruri hale getirmektedir. Bu çalışmada, bitkilerin stres faktörlerine verdiği yanıtlar ve bu yanıtların ardındaki olaylar birbirleriyle ilişkili olarak incelenmiştir. Deneysel çalışmalarda grafit, sertleştirici ve epoksi karışımı ile kaplanan ince bakır tellerin membran çözeltisine daldırılmasıyla kalsiyum seçici sensörler elde edilmiştir. Birer adet kalsiyum seçici elektrot ve referans elektrot, kaktüs gövdesinde ksilemle ilişkili olacak şekilde yerleştirilmiştir. Bu sensörler, aynı koşullarda tutulmakta olan bitkilerde soğuk şoku veya yüksek konsantrasyonda NaCl çözeltisi kullanılarak ortaya çıkarılan stresin potansiyometrik yöntemle tespit edilmesinde kullanılmıştır. Bitkilerin ksilemlerindeki kalsiyum seviyeleri 27-50 saat boyunca sürekli olarak potansiyometre aracılığı ile takip edilmiştir. Çalışma sonucunda elde edilen verilere göre, kalsiyum seçici sensörler ksilemde strese bağlı olarak meydana geldiği değerlendirilen kalsiyum değişimlerini tespit etmiştir. Bununla birlikte, potansiyometrik yöntemin ve kalsiyum seçici sensörlerin bu amaçla en uygun şekilde nasıl kullanılabileceğine dair yeni çalışmalar yapılması gerekliliği anlaşılmıştır.

Proteinlerin poliakrilik asit ile suda çözünmyen kompleksleri

Bugüne kadar yapılmış çalışmalarda polielektrolit ve proteinler arasında suda çözünen veçözünmeyen kompleks oluşumu prosesi, yapısı ve morfolojisi ile bu sistemlerde fazlar arasıgeçişlerin varlığı, mevcut fiziksel kimya yöntemleri ile incelenmiştir.Bu tez çalışmamızda PAA'in BSA ile etkileşimini türbidimetrik titrasyon yöntemi ileincelenmiştir. Türbidimetrik titrasyon yönteminin, suda çözünmeyen interpolimerkompleksinin oluşumu ve bu tür komplekslerin suda çözünür hale geçişini belirlemek için eniyi yöntemlerden biri olduğu bilinmektedir. Bu tez çalışmasında gerek PAA gerekse de BSApH değerlerine bağlı olarak farklı elektrik yükleri taşıdığından, sistem pH'a bağlı olarak;etkileşim mekanizmasının bileşenlerine de bağlı olduğu bilindiğinden dolayı orana bağlıetkileşimi incelenmiştir. Nötral pH ortamlarında tümüyle suda çözünen polimer-proteinkarışımı, pH değeri azaldıkça suda çözünmeyen hale geçmekte ve pH'ın değerinin izoelektriknoktasına yakın değerlerinden başlayarak düşük değerlerinde suda çözünmeyen bir karışımoluşmakta olduğu belirlenmiştir.İlk kez tarafımızca BSA/PAA oranının sabit değerinde pH değerinin artırılması ya daazaltılmasıyla elde edilen titrasyon eğrilerinin çakışmadığı görülmüş ve sistemde bu ikieğrinin histeriziz gösterdiği belirlenmiştir.Anahtar kelimeler: polielektrolit, poliakrilik asit, bovin serum albumin, türbidimetri

Bovine serum albumin ile poliakrilik asidin suda çözünen komplekslerinin ve kovalent konjugatlarının HPLC yöntemiyle incelenmesi

Proteinler ile sentetik polianyonların kompleksleri ve kovalent konjugatları biyomühendislik,tıp ve temel bilimlerde büyük öneme sahiptir. Bu sistemler antijen-antikor etkileşimi, spesifiknükleoprotein kompleksleri ve nükleotid-protein kompleksleşmesi için taklitçi modeloluştururken, aynı zamanda sentetik aşı geliştirilmesi amacıyla immunojenik bileşenlerhakkında yeni bilgilerin elde edilmesini sağlar.Poliiyon zincirleri ve protein molekülünün zıt yüklü grupları arasındaki elektrostatiketkileşimler, polimer-protein komplekslerinin oluşmasını sağlar. Kompleks oluşumumekanizması ve çözünebilen-çözünemeyen fazların transformasyonu sırasında oluşanparçacıkların yapısının anlaşılması için matriks çözeltiler pH titrasyonu, spektrometrik veHPLC yöntemleriyle incelenmiştir. Kompleks oluşumunun ve sistemdeki faz geçişlerinin,çözeltilerin pH'ına ve bileşenlerin oranına bağlı olduğu gösterilmiştir. Poliakrilik asit (PAA)ve bovine serum albumin (BSA), farklı pH değerlerine (pH=4,0-7,0) ve geniş bir aralıktakiprotein/polimer oranlarına (nBSA/nPAA=0,05-50) bağlı olarak, suda çözünebilen veçözünemeyen polimer-protein kompleksleri oluştururlar. pH > pI olduğu zaman, PAA-BSAkomplekslerinin kararlılığı ihmal edielebilecek kadar zayıftır (pH 7,0). Polielektrolitkomplekslerinin oluşumu ve serbest bileşenlerin varlığı ilk kez pH 6,0 değerinde gözlenmeyebaşlanmıştır. Fakat pH < pI durumunda kararlı polikompleks oluşumları artmıştır ve geniş biraralıktaki nBSA/nPAA oranlarında, farklı fizikokimyasal ve konformasyonel özelliklere sahippolikompleks oluşumları incelenmiştir (pH 5,0). Suda çözünemeyen PAA-BSAkomplekslerinin varlığı pH 4,0 değerinde gözlenmiştir. Bu çalışmada suda çözünebilen PAA-BSA komplekslerinin çözünemeyen hale faz geçişleri ilk defa incelenmiş ve proteinlerlepolielektrotların bağlanma mekanizmasının bileşenlerin oranına da bağlı olduğugösterilmiştir; sonuçta çözünebilir, kompleks kooservasyon veya amorf çökelti oluşumlarınınvarlığı gösterilmiştir.Anahtar kelimeler: polielektrolit, poliakrilik asit, bovine serum albumin, faz ayrılması, jelfiltrasyon kromatografisi

Poliakrilik asidin bovine serum albumin ile etkileşiminin dinamik ve elektroforetik ışık saçılması yöntemleri ile araştırılması

Bir fonksiyonel biyopolimer sistem olan suda çözünen ve çözünmeyen protein-polielektrolitkompleksleri; protein saflaştırılması, enzim immobilizasyonu ve sentetik aşı geliştirilmesi gibiçalışmalara konu olan özel bir sınıf polimer-protein bileşikleridir. PPK oluşumunda baskınkuvvet elektrostatik etkileşim olup, bununla birlikte hidrofobik etkilerin ve hidrojenbağlarının katkısı da mümkündür. Sulu çözeltilerde polielektrolit ile protein arasındakietkileşimler; pH, iyonik şiddet ve protein/polielektrolit miktarına bağlıdır.Bu tez çalışmasında, globular bir protein olan bovine serum albumin (BSA) ile zayıf birpolielektrolit olan poli(akrilik asit) (PAA) arasındaki etkileşimler, dinamik ve elektroforetikışık saçılması yöntemleri ile incelenmiştir. BSA-PAA sistemleri, farklı pH ve protein/polimeroranlarında araştırılmıştır. Dinamik ışık saçılması sonuçları, pH 7,0'da kompleksoluşmadığını ve pH 5,0'da suda çözünür kompleksler oluştuğunu göstermiştir. pH 4,0'dahazırlanan BSA-PAA karışımlarında suda çözünmeyen kompleksler oluşmuş, santrifüjsonrasında süpernatantlara bakıldığında ise suda çözünen ve bileşenlerden daha büyükboyutlu olan polikomplekslerin yanı sıra serbest BSA olduğu görülmüştür. Elektroforetik ışıksaçılması sonuçlarına göre, pH 5,0'daki kompleks moleküllerinin hep (-) yüklü olduğu fakatpH 4,0'da belli bir orandan sonra (+) yüklendiği bulunmuştur.Anahtar kelimeler: dinamik ışık saçılması, elektroforetik ışık saçılması, poliakrilik asit,bovine serum albumin, protein-polielektrolit kompleksi.

Anyonik polielektrolitlerin sığır serum albuminle etkileşiminin floresans yöntemi ile incelenmesi

Polielektrolitler ve proteinler arasında suda çözünen ve çözünmeyen kompleks oluşumuprosesi, oluşan polikompleks partiküllerinin yapısı ve morfolojisi ile bu sistemlerde fazlararası geçişlerin varlığı, farklı fizikokimyasal yöntemler ile incelenmiştir.Floresans spektrometre yöntemi ile floresans, fosforesans, düşük konsantrasyonda miktartayini, biyolüminesans, protein miktar tayini, proteinlerin üç boyutlu yapıları hakkında vb.bilgi veren analizler yapılmaktadır. Protein ile polielektrolitlerin etkileşimlerininaraştırılmasında floresans yönteminin çok önemli bilgiler verebilmesine rağmen polielektrolit-protein karışımlarında olabilecek etkileşimlerin floresans yöntemiyle incelenmesi çok azsayıda sistemde gerçekleştirilebilmiştir.Bu çalışmada Sığır Serum Albuminin anyonik yapılı poliakrilik asit (PAA) ile etkileşimifloresans yöntemi ile incelenmiş ve protein molekülünde var olan Triptofan amino asitininfloresans özelliklerinin değişimine dayalı olarak interpolimer-protein kompleksinin oluşumuaraştırılmıştır. Bileşenlerin oranına ve ortamın pH değerine bağlı olarak suda çözünen veçözünmeyen polimer-protein komplekslerinin oluştuğu, sistemde faz geçişinin meydanageldiği ve bu sırada kararlı yapılı polikompleks partiküllerinde protein moleküllerinin üçboyutlu yapılarının şartlara uygun olarak önemli değişiklikler gösterdiği saptanmıştır.İntrapolimer komplekslerinin orana ve pH'a bağlı olarak interpolimer komplekslereagregasyonu bulunmuştur. Protein molekülünün yapısındaki Triptofan'ın λmax ve Imaxdeğerleri orana ve pH'a bağlı olarak değişmektedir. Bu değişimlerin gerek proteinin gereksepolikomplekslerin yapılarına bağlı olduğu tartışılmaktadır.Floresans yöntemi suda çözünen PAA-protein karışımlarına uygulandığından dolayıpolimer/protein oranına ve karışımın pH değerlerine bağlı olarak sistemin suda çözünürlüğüöncelikle türbidimetrik yöntemle araştırılmış ve suda çözünmemiş sistemler belirlenmiştir.Nötral pH ortamlarında tümüyle suda çözünen polimer-protein karışımı, pH değeri azaldıkçasuda çözünmeyen hale geçmekte ve pH'ın değerinin izoelektrik noktasına yakın değerlerindenbaşlayarak düşük değerlerinde suda çözünmeyen bir karışım oluşmakta olduğu belirlenmiştir.Bu sistemler detaylı olarak floresans yöntemi ile araştırılmış ve literatürde bulunmayan yenibilgiler elde edilmiştir. Polikompleksin yapısında bileşenlerin (polimer ve protein) oranı,aralarındaki kimyasal bağlar veya etkileşimin doğasının yanısıra, gerek tüm polikomplekspartiküllerinin ve gerekse de içerdikleri protein molekülünün üç boyutlu yapısı hakkındagünümüzde detaylı bilgi varolmamaktadır.Anahtar kelimeler: polielektrolit, poliakrilik asit, bovin serum albumin, floresans

Polianyonların bovin serum albumin ile karışımlarının dört detektörlü moleküler eleme kromatografisi yöntemiyle analizi

Suda çözünen ve çözünmeyen protein-polielektrolit kompleksleri fonksiyonel biyopolimersistemleri olarak çeşitli alanlarda önemli uygulamaları bulunmaktadır ve polimer-proteinbileşiklerinin spesifik bir sınıfını oluşturmaktadırlar. Polielektrolitlerin proteinlerle suluçözeltilerdeki etkileşimi, pH ve iyonik şiddete duyarlıdır ve proteinlerin izoelektrik noktasınabağlıdır. Polimer-protein kompleksleri poliiyon zincirleriyle protein molekülünün zıt yüklügrupları arasındaki elektrostatik etkileşimin bir sonucu olarak meydana gelmektedir.Bu tez çalışmasında, bileşenlerin farklı oranlarında (nBSA/nPAA=0,5-50) ve farklı pH'larda(pH=4,0; 4,3; 5,0; 6,0; 7,0) sığır serum albuminin poliakrilik asit ile etkileşimi ve çözünürpolikomplekslerin moleküler özellikleri dört detektörlü (UV, kırılma indisi, ışık saçılması veviskometri) moleküler eleme kromatografisi kullanılarak incelenmiştir.Nötral pH'larda polianyon ile protein arasında etkileşim gözlenmezken, proteinin izoelektriknoktasına yakın pH değerinde suda çözünür PAA-BSA kompleksleri oluşmaktadır.Fizikokimyasal özellikleri dört detektörlü kromatografi sistemi kullanılarak incelenen bukomplekslerin belli bir oran aralığında molkül kütleleri ve boyutlarının bir maksimumdangeçtikten sonra sabit kaldığı gösterilmiştir. Proteinin izoelektrik noktasından daha düşük pHdeğerlerinde suda çözünmeyen kompleksler oluşmuş, bu çözeltilerin santrifüj sonrasısüpernatantları incelenmiştir. Bileşenlerin molar oranlarının çok küçük ve çok büyükdeğerlerinde suda çözünen kompleksler olduğu bulunmuş, suda çözünen ve çözünmeyenpolikomplekslerin bir arada bulunduğu gösterilmiştir. Ön aşamada, çökmeden öncepolielektrolit-protein kompleksleri arasında agregasyon olduğu belirtilmiştir.Anahtar kelimeler: polielektrolit-protein kompleksleri, moleküler eleme kromatografisi, ışıksaçılması, viskometri.

Peptid protein kovalent konjugasyonu

Peptidlerin taşıyıcı proteinlere bağlanması, zayıf immunojenik özellikteki peptidlere karşı antikoroluşturmak için gerekmektedir. Sulu çözeltideki moleküllerin karboksil gruplarının aktivasyonu veaktive olmuş karboksil gruplarına amino gruplarının kovalent bağlanması, bu tez çalışmamızın konusuolan globular yapıdaki protein ile sentetik peptidlerin konjugasyon reaksiyonunun temelinioluşturmaktadır.Karbodiimidler heterobifonksiyonel özellikteki direkt (zero-length) çapraz bağlama reaktifleridir vekarboksil gruplarının amino gruplarına bağlanmasında kullanılırlar. Bu tez çalışmamızda karbodiimidyöntemi ile suda çözünen 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) karbodiimid hidroklorid (EDC) kullanılarak,Peptid-Protein konjugatları hazırlandı. Konjugasyonda bir protein molekülü için peptidin farklıoranları (npeptid/nBSA) ile çalışıldı ve bu orantılara ait biyokonjugatlar sentezlendi. Sentezlenmişbiyokonjugatlar farklı kolonlardan geçirilerek saflaştırıldı.Saflaştırılan biyokonjugatların; sentetik peptid, BSA ve BSA-sentetik peptid fiziki karışımları ilekarşılaştırmalı olarak karakterizasyonu ve bağlanma mekanizmasının incelenmesi, HPLC, GPC-VISCOTEK (Gel Permeation Chromatography; UV, Refraktif ndeks, Vizkozite ve Işık SaçılmasıDetektörlerine Sahip Kromatografik Sistem), Fluoresans Spektrofotometre ve Zetasizer (Partikülboyutu ve Zeta Potansiyel ölçümü için) cihazları kullanılarak gerçekleştirildi. Fiziko-kimyasal analizsonuçlarına dayanarak globular BSA moleküllerinin lineer yapılı peptid molekülleri ile kovalentbağlanması sonucu elde edilen biyokonjugatların oluşum mekanizması, elektrik yükü ve üç boyutluyapısı incelenmiştir.Anahtar kelimeler: Peptid, Protein, BSA, Kovalent Bağlanma, Karbodiimid, EDC

İnsülinin polimerlerle (Örn: polietilen glikol) olan konjugatlarının diyabetik hastalarda uygulanması

Diabetes Mellitus, günümüzde en sık rastlanan hastalıklardan biridir. İstatistiksel sonuçlar,diyabet hastalığına yakalanan hastaların sayısının arttığını göstermektedir. Ancak tedavimetodları, tedavi yolu ve insülin molekülünün tipi ilaç firmaları tarafından geliştirilmektedir.Günümüzde artık immunojen olmayan insülin çeşidi kullanılmaktadır. Bugün pazarda,diyabet hastaları tarafından kullanılan çok çeşitli insülin formülasyonları bulunmaktadır. Buinsülinler rekombinant DNA teknolojisiyle üretilmektedir.Bu araştırmada; Tip 1 ve tip II diyabet, mevcut insülin tedavileri, insülinin hücredeki etkimekanizması, insülin konjugatlarının sentezi, PEG konjugasyonunun insülinin özelliklerineetkisi, PEG-insülin konjugatlarının hazırlanması ve bunların immünojenik özellikleri,hümoral ve hücresel antijenliği, alerjenliği, biyolojik etkinlikleri, farmakokinetik vefarmakodinamik parametreleri incelenmiştir.

Poli(1-azobisiklo[4.2.0]oktan) ve türevlerinin sentezi ve karakterizasyonu

Son yıllarda fonksiyonel biyopolimer sistemlerin gelistirilmesine yönelik çok fazla sayıda çalısmalar yapılmıstır. Bugüne kadar yapılmıs çalısmalarda biyolojik özellikli polielektrolitlerin sentezi, karakterizasyonu ve kullanım çesitliliği üzerinde durulmustur. Bu tez çalısmasında yapısında heteroatom bulunduran biyobozunur bir polielektrolit olan poli(1-azobisiklo[4.2.0]oktan) (polikonidin) sentezi ve karakterizasyonu anlatılmaktadır. Poli(1-azobisiklo[4.2.0]oktan) eldesi için öncelikle bu polimerin monomeri olan 1- azobisiklo[4.2.0]oktan (konidin) monomerinin sentezi organik yöntemlerle gerçeklestirilmistir. Daha sonra değisik molekül ağırlıklarına sahip polimerler sentezlenmis ve bu polimerlerin karakterizasyonu farklı yöntemlerle (UV, FT-IR, SEC, Ultrasantrifüj) yapılmıstır. Elde edilen polimerlerin bir kısmı bromoasetik asit ile modifiye edilerek polimere uygun fizikokimyasal özellikler kazandırılmaya çalısılmıstır. Konidin sentezinin her asamasında olusan maddelerin FT-IR ve UV spektrumları alınmıs ve sentezin izlediği yol sürekli kontrol edilmistir. Sentezlenen konidin, monomer olarak kullanılmıs ve farklı baslatıcılar varlığında (metil iyodür, etil bromür, heksadesil bromür, tbutil bromür, benzoil klorür ve trimetilsilan bromür) katyonik halka açılması polimerizasyonu ile poli(1-azobisiklo[4.2.0]oktan) elde edilmistir. Baslatıcı/monomer oranı değistirilerek bunun polimerlerin karakteristiğine olan etkisi incelenmistir. Poli(1-azobisiklo[4.2.0]oktan)'ın kimyasal modifikasyonu için bromoasetik asit kullanılmıs ve polimerin kuarternlesmesi ile poliamfolit sentezi gerçeklestirilmistir. Polielektrolitlerin fizikokimyasal özelliklerinin yapı ile doğrudan iliskili olduğu bilinmektedir. Bu nedenle sentezlenen polimerin karakterizasyonunun yapılması amaçlanmıstır. Poli(1- azobisiklo[4.2.0]oktan)'in FT-IR spektrumları alınmıs ve dört dedektörlü (ısık saçılması, refraktif indeks, viskozite ve UV) moleküler eleme kromatografisi ile polimerlerin molekül ağırlıkları, polidispersite değerleri (Mw/Mn), Mark-Houwink sabitleri ve partikül yarıçapları ölçülmüstür. Zeta Sizer ile polimer zincirlerinin boyut analizi yapılmıs ve zeta potansiyelleri ölçülmüstür. Sentezlenen polimerlerin sedimentasyon katsayıları Ultrasantrifüj ile belirlenmistir. Polimerlerin molekül ağırlıklarının baslatıcı miktarı ve türündeki değisimler ile polimerizasyon ortamından etkilendiği belirlenmistir. Polimerin bromoasetik asit türevinin hücre canlılığına etkisi meme kanseri hücreleri (MCF 7) üzerinde in vitro ortamda incelenmis ve polimer konsantrasyonu değisikliğinin hücre canlılığına etkisi arastırılmıstır. Anahtar kelimeler: polielektrolit, polikonidin, katyonik halka açılması polimerizasyonu

Miyeloperoksidaz enziminin meme kanseri tedavisinde kullanılan tamoksifene etkisinin incelenmesi

?Miyeloperoksidaz-H202-Cl-? sistemi lökositlerde güçlü antibakteriyel ve sitotoksik etkiye sahiptir. Fizyolojik pH'da Cl- iyonlarının Cl+ iyonlarına yükseltgenmesi ile birlikte miyeloperoksidaz bazı tehlikeli reaktif oksijen türlerinin oluşumuna yol açmaktadır. Fizyolojik koşullarda ROS'ların üretilme ile yok edilme mekanizmaları arasındaki denge bozulursa, vücutta hasar oluşabilir. Hücrede ROS birikimi radikal ilgili DNA, protein, lipid hasarı oluşturarak kanser ve nörodejeneratif bozukluklar gibi yaşa bağlı hastalıkların gelişmesinde önemli olur.Bu tez çalışmasında Tamoksifene miyeloperoksidaz -H2O2-Cl- sisteminin etkisi ile oluşan reaksiyon ürünleri incelendi. Bu maksatla alınan insan kan örneklerinin içerdiği lökositler izole edildi. Liziz işlemiyle parçalanan lökositlerden izole edilip saflaştırılan miyeloperoksidazın 37°C'da ve fizyolojik pH'da (pH 7.2-7.3) Tamoksifene etkisi UV-Vis. spektrofotometre ve LC-MS, FT-IR spektrometre sistemleri ile değerlendirildi.Daha önce yapılan çalışmalarda Tamoksifene karaciğer mikrozomlarının etkisi ile metabolitlerin oluşması ve ?Horseradish? peroksidaz katalizi incelenmişti. Yapılan çalışmada ilk defa yeterli miktarda saf halde elde edilen miyeloperoksidazın daha yüksek konsantrasyonda kullanılması, bu enzimin Tamoksifene etkisinde oluşan ürünlerin çok daha belirgin olarak izlenmesini sağladı. Tamoksifenin yapısında bulunan C-O-C eterik bağının, C=C çiftli bağının ve C-N bağının parçalanması sonucu serbest radikallerin oluştuğu kanaatine varıldı.

Miyeloperoksidaz enziminin lösemi tedavinde kullanılan doksorubisine etkisinin incelenmesi

Miyeloperoksidaz (MPO, EC 1.11.1.7) başlıca polimorfonükleer nötrofillerde, monositlerde ve doku makrofajlarının belirli popülasyonlarında bulunmaktadır. Bu enzim ?miyeloperoksidaz-H2O2-Cl-? reaksiyon sistemi vasıtasıyla zararlı mikroorganizmaları ve belirli tümörleri yok edici etkisi nedeniyle savunma sisteminde önemli bir yere sahiptir. Miyeloperoksidaz ayrıca peroksidasyon yoluyla fenol, anilin ve türevleri ile ß-diketonlar gibi birçok maddeyi yükseltgeyerek serbest radikal meydana gelmesine sebep olmaktadır. Bu durum genel olarak belirli ilaçların toksik metabolitlerinin oluşmasını da açıklamaktadır.Kanser tedavisinde kullanılan bazı ilaçlara karaciğer mikrozomların etkisi ile metabolitlerin oluşması ve ayrıca ?Horseradish Peroxidase? etkisi daha önce incelenmiştir. Bu çalışmada ilk defa insan lökositlerinden izole edilip saflaştırılan miyeloperoksidazın lösemi tedavisinde kullanılan Doksorubisine olan etkisi incelendi. Ayrıca miyeloperoksidaz ilk defa laboratuvar koşullarında reaksiyon gerçekleştirmek üzere yeterli miktarda ve aktivitesi korunarak elde edildi. Fizyolojik sıcaklıkta ve pH'da (37°C; pH 7.2-7.3) gerçekleştirilen bu reaksiyonda oluşan ürünler UV-Vis. spektrofotometre, FT-IR ve LC-MS spektrometre sistemleri kullanılarak değerlendirildi. Reaksiyon sonucu Doksorubisinin yapısında bulunan karbonil grubunun kaybolduğu, C-O-C eterik bağının parçalandığı ve serbest radikallerin oluştuğu belirlendi.

Polianyonların human serum albumin ile etkileşim mekanizmasının araştırılması

Yağ asidi, amino asit, biliburin gibi metaboliklere ve Cu2+- Zn2+ gibi metal içeren birçok etkin maddeye karşı yüksek ilgi gösteren HSA, araştırmacılar tarafından ilaç salınım sistemlerinde spesifik hedeflere taşıyıcı olarak kullanılmaktadır. Bu çalışmada HSA'nın polianyonlar ile etkileşim mekanizması araştırılarak tıp, eczacılık ve temel bilim çalışmaları için mühendislik yaklaşımı geliştirilmiş ve etkileşimin fiziko-kimyasal yapısı HPLC, dört detektörlü GPC, dinamik ve elektroforetik ışık saçılması ve flüoresans yöntemleri kullanılarak açığa çıkarılmıştır. Protein-polianyon etkileşimlerinde baskın kuvvet elektrostatik etkileşim olup, hidrofobik etkilerin ve hidrojen bağlarının katkısının da olduğu düşünülmektedir. Sulu çözeltilerde polianyon ile protein arasındaki etkileşimler; pH, iyonik şiddet ve nHSA/nPAA miktarına bağlıdır. Kompleks oluşumunun ve sistemdeki faz geçişlerinin, çözeltilerin pH'ına ve bileşenlerin oranına bağlı olduğu, poliakrilik asit (PAA) ve human serum albumin (HSA), CPAA=1mg/mL için farklı pH değerlerine (pH=4,0-7,0) ve nprotein/npolimer oranlarına (nHSA/nPAA=0,1-10) bağlı olarak, suda çözünebilen ve çözünemeyen polimer-protein kompleksleri oluşturduğu gösterilmiştir. pH (7,0-6,0) > pIHSA (4,9) koşulunda, HSA-PAA komplekslerinin kararlılığı ihmal edilebilecek kadar zayıf olup, polielektrolit komplekslerinin oluşumu ve serbest bileşenlerin varlığı ilk kez pH 5,0 değerinde gözlenmeye başlanmıştır. pH5,0'da polikompleks parçacıklarının sulu çözeltilerinin molekül ağırlığı(Mw, Mn), molekül ağırlığı dağılımı, Mark-Houwink (a), bağlanma (k) ve doyma (?m?) sabitleri gibi moleküler özelliklerinin ve yapısal değişikliklerin nHSA/nPAA oranına bağlılığı araştırtmıştır. pH < pI durumunda kararlı polikompleks oluşumları artmış ve suda çözünemeyen HSA-PAA komplekslerinin varlığı pH 4,0 değerinde gözlenmiştir. Ayrıca, CPAA=0,1mg/mL için pH4,0 ve pH4,5'de türbidimetrik titrasyon yöntemi kullanılarak, suda çözünmeyen interpolimer kompleksinin oluşumunun ve suda çözünür hale geçişin pH değişiminden etkilenme mekanizması aydınlatılmıştır. Anahtar kelimeler: HPLC, dört detektörlü GPC, dinamik ışık saçılması, elektroforetik ışık saçılması, poliakrilik asit, human serum albumin, protein-polielektrolit kompleksi.

Alfa amilaz-dekstran konjugatlarının sentezi ve karakterizasyonu

Amilazlar endüstride nişastadaki glikozid bağlarının hidrolizinde yaygın olarak kullanılan enzimlerdir. Alfa amilazlar (1,4-?-D-glukan glukanohidrolaz; EC 3.2.1.1) nişastadaki amiloz ve amilopektinin ?-1,4 bağlarının hidrolizinden sorumlu endohidrolazlardır. ß-Amilaz nişastanın sadece indirgenmeyen uçlarındaki ?-1,4 bağlarına saldırabilir. Alfa amilazlar yapılarında 5 alt ünite bulundururlar ve 478 amino asit artığı içermektedirler. Molekül ağırlıkları 50 000 dolayındadır. Özellikle Aspergillus oryzae'den elde edilen alfa amilaz (TAKA-amilaz), başlıca gıda, tekstil, deterjan endüstrilerinde kullanılmaktadır. Bu gibi endüstriyel uygulamalarda çalışma ortamlarının sıcaklık, pH v.b. değerleri ya da mevcut kimyasallar enzimin aktivitesini olumsuz etkileyebilir. Endüstriyel proseslerde enzimlerin çalışma ortamının olumsuzluklarına karşı dirençli kılınması önemli araştırma alanlarını oluşturmaktadır. Bu maksatla uygulanan genetik çalışmalar ve kimyasal modifikasyonlar enzimlerin stabilitelerini arttırmaktadır. Bu çalışmada, Aspergillus oryzae alfa amilaz (TAKA) ?Sephadex G 50? kolon dolgu maddesi kullanılarak jel filtrasyon yöntemi ile saflaştırıldı. 75 000 ve 188 000 mol ağırlıklı dekstranlar sodyum periyodat ile aldehit türevlerine yükseltgendikten sonra saf enzime kovalent olarak bağlandı. Sentezlenen konjugatlar ultrafiltrasyon sisteminde konsantre edildi ve yıkandı. Elde edilen konjugatlar HPLC ve GPC cihazlarında incelendi. Enzim ve konjugatların pH 7 ve farklı sıcaklıklarda aktiviteleri tayin edildi ve alınan sonuçlar kıyaslandı. Sonuç olarak, pH 7'de konjugatlar saf enzime kıyasla daha geniş bir sıcaklık aralığı ve yüksek termal stabilite gösterdiler. Anahtar kelimeler: Aspergillus oryzae ?-Amilaz, Dekstran, ?-Amilaz-Dekstran konjugatları, aktivite, enzim stabilitesi, GPC, HPLC.

İnsan meme kanseri (MCF 7) ve fare fibroblast (L-929) hücre kültürlerinde poliakrilik asidin toksisitesinin incelenmesi

Son yıllarda biyopolimerler tıbbın çeşitli alanlarında; ortopedide, kemoterapide, immünojide, dişçilikte olmak üzere geniş şekilde kullanılmaktadır. Herhangi bir polimerin praktikte uygulanabilmesi için biyouyumluluğunun incelenmesi gerekmektedir. Bir polielektrolit olan poliakrilik asidin (PAA) immünolojide adjuvant etkisi, tıbbi deneylerde antitrombojenik etkisi ve ilaç salınım sistemlerinde taşıyıcı olarak kullanıldığı bilinmektedir. Literatürde PAA'nın çeşitli konjugatlarıyla ilgili çalışmalar olmasına rağmen, tek başına toksisitesine ait çalışmalar bulunmamaktadır. Biyopolimer çalışmalarında toksisitenin belirlenmesi son derece önemlidir. Bu amaçla çeşitli hücrelerin kültürleri kullanılmaktadır. Ancak PAA'nın ve konjugatlarının toksisitesinin tayin edilmesinde kullanılan hücre kültürlerinden hangisinin daha duyarlı olduğu konusunda bilgiler bulunmamaktadır. Tezin amacı; insan meme kanseri (MCF 7) ve fare fibroblast (L-929) hücrelerinin kültürlerinin yapılması ve bu hücre kültürlerinde PAA'nın toksisitesinin çeşitli yöntemlerle incelenmesidir. Çalışmada hücre kültürü, kriyoprezervasyon, 3-(4,5-dimetiltriazol-2-il)-2,5- difeniltetrazolium bromid (MTT), tripan mavisi ve 4,6-diamidino 2 phenylindole (DAPI) yöntemleri kullanılmıştır. Birinci aşamada ilk kez olarak Y.T.Ü Biyomühendislik Bölümü Hücre Kültürü Laboratuvarında MCF 7 ve L-929 hücrelerinin adaptasyonluğu sağlanmış ve devamlı kültürü elde edilmiştir. Bu hücrelerin kriyoprezervasyonunun sağlanmasında optimal şartlar belirlenmiş ve laboratuvarda hücrelerin yeterli miktardaki kriyobankı oluşturulmuştur. Çalışmamızda ilk kez MCF 7 hücre kültürünün PAA'nın toksisitesinin incelenmesinde uygun bir model olduğu ortaya konmuştur. Yapılan kültür çalışmalarının sonraki aşamalarında PAA'nın pH'a ve konsantrasyona bağlı olarak toksik etkisinin incelenmesi sonucunda farklı hücrelerde farklı olduğu belirlenmiştir. PAA'nın EC50 değeri MCF 7 hücrelerinde 6.6 iken L- 929 hücrelerinde 1,8 olduğu tespit edilmiştir. Elde edilen bu sonuçlar polimerlerin hücre kültüründe toksisitesinin belirlenmesinde uygun hücre kültürü seçilmesinin dikkate alınmasını göstermektedir. Anahtar kelimeler: Hücre Kültürü, MCF 7, L-929, Poliakrilik Asit, Toksisite, MTT, DAPI

Restoratif dental malzemelerde yüzey-polimer etkileşimlerinin moleküler modellenmesi