Enterococcus faecium'a karşı rekombinant antibiyotik geliştirilmesi

Amaç: E. faecium'un sahip olduğu beta laktamlara düşük afinite gösteren PBP5 proteinine karşı recombinant antibiyotik geliştirilmesi amaçlandı. Gereç ve Yöntem: PBP5 proteininin çözünür formunu kodlayan gen pET-30a(+) ekspresyon vektörüne klonlandı, rekombinant olarak üretildi ve IMAC ile saflaştırıldı. Cd-1 fareleri saf sol-PBP5 proteini ile immunize edildi ve ELISA ile doğrulandı. İmmünize farelerden RNA izolasyonu, cDNA sentezi ve VH amplifikasyonu yapıldı. VH amplikonları pComb3-hy fajmidine klonlanarak VH gösteren faj kütüphanesi oluşturuldu. Sol-PBP5'e bağlanan fajlar biopanning yöntemiyle seçildi ve VH sekansları belirlendi. VH43'ün 3 boyutlu yapısı ve sol-PBP5 ile interaksiyonu modellendi. VH43 klonlandı ve rekombinant olarak üretildi. BOCILLIN-FL kullanılarak karşılaştırmalı bağlanma testi yapıldı. VH43'ün antibakteriyel etkisi tek başına ve sefalosporin ile kombine edilerek test edildi. İstatistiksel analizde bağımsız örneklemler için t-testi, tek yönlü varyans analizi ve Tukey's HSD testleri kullanıldı. Bulgular: sol-PBP5'in pET-30a(+) vektörüne klonlandığı koloni PCR ve sekans analizi ile doğrulandı. sol-PBP5 proteininin ekspresyonu ve saflaştırıldığı SDS-PAGE analizinde yaklaşık 75 kDa boyutunda bant görülmesiyle doğrulandı. Proteinin BOCILLIN-FL ile muamelesi sonucunda SDS-PAGE analizinde parlama görüldü. Saf sol-PBP5 ve PBS ile enjeksiyon sonrasında, sol-PBP5 ile kontrol grubu arasında anlamlı antikor yanıtı görülmesi ile doğrulandı (p-değeri = 9.02e-05). İmmünize farelerden izole edilen izole edilen total RNA'dan izole edilen cDNA agaroz jelde yaklaşık 500-600 boyunda bant verdi. cDNA'den çoğaltılan VH amplikonları fajmid vektörüne klonlandı ve koloni PCR ile doğrulandı. Faj kütüphanesinden sol-PBP5'e afinite gösterenler biopanning ile seçildi ve biopanning öncesi ve sonrası arasında faj sayısında beklenen düşüş gözlendi. 3. Biopanning döngüsü sonrasında afinite gösteren fajın kodladığı VH sekanslandı. VH43'e ait amino asit sekansı ve bulundurduğu CDR sekansları belirlendi. Keşfedilen VH43'ün moleküler ağırlığı 10.3 kDa ve proteinin yapısında 12 alfa heliks ve 61 beta zincir bulunduğu ortaya kondu. VH43 ve sol-PBP5 arasında 7 hidrojen bağı oluştuğu ve bağların lokasyonları belirlendi. VH43 rekombinant protein olarak ekspresyonunda üretildi ve N ve C terminalindeki Histag ile birlikte toplamda 20.3 kDa olduğu SDS-PAGE analizi ile gösterildi. VH43 ve VH kodlayan fajların sol-PBP5'e bağlandığı BOCILLIN FL ile yapılan karşılaştırılmalı bağlanma deneyinde parlaklığın azalması ile kanıtlandı. VH43 tek başına antibakteriyel etki göstermemiştir, ancak ceftazidime/cefazoline ile kombinlendiğinde, ceftazidime/cefazoline tek başına uygulandığında göre önemli bir inhibitör etkiye sahip olmuştur. Bu, VH43 ve ceftazidime'nin sinerjik etkisini doğrulamaktadır. Sonuç: Antibiyotik dirençli E. faecium suşlarının artışı, yeni moleküllerin geliştirilmesini gerektirmektedir. Bu tez çalışmasında keşfedilen VH43 E. faecium'a karşı geliştirilen ve sekansı tespit edilen ilk antikor/antikor fragmentidir. VH43'ün sefazolin/seftazidim ile kombine halde uygulandığında E. faecium'un büyümesini önlemesi onun recombinant antibiyotik potansiyelini ortaya koymuştur.