DUSP1 proteininin meme kanseri üzerindeki etkilerinin araştırılması

Mitogen-activated protein kinase (MAPK) ailesi hedef proteinlerinin serin ve treonin aminoasitlerini fosforile eden bir protein kinaz ailesidir. Bu protein kinazlar ERK, JNK, p38 olmak üzere üç temel alt aile şeklinde sınıflandırılabilir. MAPK ailesi hücre büyümesi, hücre proliferasyonu, mitoz, apoptozis gibi birçok hayati hücresel fonksiyonun düzenlenmesinde görev alır. Dual-specificity phosphatase (DUSP) ailesi MAPK'leri defosforile eden protein fosfataz ailesidir. Hedef proteinlerinin hem tirozin hem de serin/treonin rezidülerini defosforile edebilme yeteneklerinden dolayı bu proteinlere Çift Spesifik fosfataz ismi verilmiştir. Dual-specificity phosphatase 1 (DUSP1) MAPK aktivasyonunu düzenleyerek inflamasyon, apoptozis, hücre büyümesi, hücre proliferasyonu gibi birçok hücresel fonksiyonda rol alır. Çalışmamızda üçlü negatif meme kanseri olan MDA-MB-231 hücreleri kullanılmıştır. CRISPR/Cas9 yöntemi ile bu hücrelerde DUSP1 proteini ifadesi azaltılmıştır. Bu hücrelerde proliferasyon ve motilite deneyleri yapılmış, Western Blot yöntemi ile MAPK proteinlerinin ifadelerinde değişmeler değerlendirilmiştir. Proliferasyon deneyleri Incucyte live-cell analysis' sistemi ile yapılmıştır. Elde edilen proliferasyon eğrileri üzerinden hücrelerin ikiye katlanma zamanları ve maksimum hücre sayıları hesaplanmıştır. Hücre motilitesi 'Transwell migration assay' ve yara iyileşmesi deneyleri ile ölçülmüştür. Proliferasyon deneylerinde DUSP1 ifadesinin azalmasının hücrelerin proliferasyonunu azalttığı görülmüştür. Ek olarak DUSP1 inhibitörü olan BCI, MDA-MB231 hücrelerinde antiproliferatif etki göstermiştir. Bu antiproliferatif etki kontrol hücrelerinde daha fazladır. Bu durumun nedeninin, DUSP1-CRISPR hücrelerinde DUSP1 proteininin azalmasından kaynaklandığı ve azalmış DUSP1 ifadesi nedeniyle BCI'nın bu grupta daha az etkin olduğu düşünülmüştür. Ayrıca DUSP1 ifadesinin azalması bu hücrelerde sisplatinin antiproliferatif etkisinin artmasına neden olmuştur. Aynı sisplatin konsantrasyonunda DUSP1-CRISPR hücrelerinin ikiye katlanma zamanları kontrol hücrelerine göre daha fazla artmıştır. Yukarıdaki sonuçlara benzer şekilde DUSP1 inhibitörü olan BCI'nın kontrol hücrelerinde sisplatinin antiproliferatif etkisini DUSP1- CRİSPR grubuna göre daha fazla artırdığı görülmüştür. Bu sonuç da benzer şekilde bize, DUSP1-CRISPR hücrelerinde BCI'nın daha az etkili olmasının DUSP1 proteininin azalmasından kaynaklandığını düşündürmüştür. DUSP1-CRISPR uygulaması sonrasında hücrelerin migrasyon kapasiteleri yara iyileşme deneyi ve Transwell migrasyon deneyi ile değerlendirilmiştir. Bu deneyler sonucunda DUSP1-CRISPR uygulamasının hücrelerin migrasyon kapasitesini azalttığı görülmüştür. Bu sonuç DUSP1 düzeyinin azalmasının MDA-MB231 hücrelerinin hareketliliği ve metastaz yeteneğini azalttığını göstermektedir. p38 ve JNK inhibitörleri ile yapılan deneylerde, p38 inhibitörü SB202190'ın her iki hücre grubunda benzer düzeylerde proliferasyonu artırdığı görülmüştür. Sisplatin etkinliğinde, tedavisinde ve gelişen dirençte, p38 ve JNK'nın aktivitesinin rol aldığı düşünülmektedir. Sisplatin ve p38 inhibitörünün beraber verilmesi DUSP1-CRISPR hücrelerinde kontrol hücrelerine göre daha büyük bir proliferasyon artışına yol açmıştır. Bu durum DUSP1-CRISPR hücrelerinde görülen sisplatinin antiproliferatif etkisindeki artışın nedeninin, artmış p38 proteini aktivasyonundan kaynaklanabileceğini düşündürmüştür. Bu sonuçlar DUSP1 aktivitesindeki azalmanın dolaylı olarak p38 proteini aktivitesini değiştirerek sisplatine olan duyarlılığı ve tedaviye direnci etkileyebileceğini göstermektedir. Western blot sonuçlarına göre DUSP1-CRISPR hücrelerinde p38 ve JNK proteinlerinin fosforile/total protein oranlarında artış saptanmış bu artış ERK proteininde görülmemiştir. DUSP1 proteininin hedef seçiciliği düşünüldüğünde DUSP1 aktivitesindeki değişikliğin p38 ve JNK proteini üzerinden olabileceğini göstermektedir ve bu sonuç literatür ile uyumludur. Sonuç olarak DUSP1 proteini ifadesinin azalması MDA-MB231 kanser hücrelerinde, hücre hareketliliğini, migrasyonu ve proliferasyonunu azaltarak antikanser etkinlik göstermektedir. Ayrıca sonuçlarımız, sisplatine olan duyarlılıkta ve gelişen dirençte p38 aktivitesinin önemli olduğunu düşündürmüş ve DUSP1 inhibisyonu ile p38 aktivitesinin dolaylı olarak artırılmasıyla, sisplatin duyarlılığının ve antikanser etkinliğin arttırılabileceğini düşündürmüştür.