Lipozom enkapsülasyonu, püskürtmeli kurutma ve askorbik asit varlığının kara havuç antosiyaninlerinin renk stabilitesine etkisi

Gıda renklendiricileri, tüketici algısını etkilediği için gıda endüstrisinde önemli bir yere sahiptir. Gıdanın tazeliği, çeşidi, içeriği ve üretim metodu gıdanın rengini belirleyen önemli etmenlerdendir. Çekici bir renk tüketiciler tarafından tercih edilmekte ve tüketicilerin satın alma alışkanlıklarına etki etmektedir. Sentetik renklendiriciler, proses koşullarına dayanıklılıklarının yüksek olmasından ve düşük miktarlarda kullanımlarının iyi sonuç vermesinden dolayı yıllarca tercih edilmişlerdir. Fakat, son yıllarda sentetik renklendiricilerin sağlık üzerindeki olumsuz etkilerinin vurgulandığı çalışmaların çoğalması ve dünyada sağlıklı beslenme eğiliminin artması sonucu üreticiler doğal renklendiricilerin kullanımına yönelmişlerdir. Doğal renklendiricilerin kullanılmasında, üretim ve çevre koşullarına dayanıklılığın düşük olması problem oluşturmaktadır. Sentetik renklendiricilere getirilen yasal sınırlamalar ve kamuoyu etkisi doğal renklendiriciler ile ilgili çalışmaları arttırmıştır. Doğal renklendiriciler arasında kara havuç, antioksidan niteliği yüksek bir tarımsal ürün olarak sağlık açısından her geçen gün önem kazanmaktadır. Ana vatanı Türkiye ve Orta-Uzak Doğu bölgeleri olarak bilinen kara havucun Dünyada en az 3000 yıldan bu yana kültürü yapılmaktadır. Kara havuç (Daucus carota var L.) açillenmiş antosiyanin bakımından zengin bir tür olmasına rağmen halen özellikle reaktif bileşenlerin (örneğin, C vitamini) bulunduğu ortamlarda bozunmaktadır. Enkapsülasyon, gıda matrisi içerisinde korunmak istenen öz madde ve çevre koşulları arasında bariyer oluşturulması işlemidir. Bu nedenle, doğal renklendiricilerin dayanıklılığı enkapsülasyon ile arttırılarak sentetik renklendiricilerin kullanım ihtiyacının ortadan kaldırılması sağlanabilinmektedir. Bu tez çalışması, yukarıda belirtilen bilgiler doğrultusunda kara havuç antosiyaninlerinin karakterizasyonunun gerçekleştirilmesi ve kara havuç antosiyaninlerinin lipozom ile enkapsülasyonunun bu bileşenlerin dayanıklılığına etkisinin araştırılması üzerine kurgulanmıştır. Bu doktora tezinin amaçları sırasıyla; (i) Kara havuç ekstraktının antosiyanin konsantrasyonu, fenolik içeriği, antioksidan aktivitesi ve renk özellikleri dikkate alınarak kara havuç ekstraksiyonu koşullarının Yanıt Yüzey Metodolojisi kullanılarak belirlenmesi, (ii) açillenmiş antosiyanin oranı fazla, dayanıklılığı yüksek kara havuç antosiyaninlerinin askorbik asit varlığında dayanıklılığının incelenmesi ve lipozom ile enkapsülasyonun aynı koşullarda kara havuç antosiyaninlerin dayanıklılığına etkisinin araştırılması, (iii) Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi analizi ile lipozom enkapsülasyonu ve kara havuç antosiyaninlerinin molekül içi kopigmentasyonunun askorbik asit varlığında kara havuç antosiyaninlerinin dayanıklılığına etkisinin belirlenmesi, (iv) lipozomların kara havuç antosiyaninlerinin varlığında ve yokluğundaki fiziksel ve kimyasal dayanıklılığının depolama süresince belirlenmesi, (v) kara havuç ekstraktı içeren lipozomların püskürtmeli kurutma işlemi sırasındaki dayanıklılığının tespit edilmesidir. Tezin ilk bölümünde kara havuç ekstraksiyonu için en uygun koşulların belirlenmesi yanıt yüzey yöntemi kullanılarak belirlenmeye çalışılmıştır. Antosiyaninlerin ekstraksiyonuna etki eden faktörlerden pH, sıcaklık, çözgen/katı madde oranı ve etanol/su oranı ekstraksiyon parametreleri olarak seçilmiştir. İki tekrarlı merkezi kompozit tasarım kullanılarak bu faktörlerden deneme deseni çıkarılmıştır. Faktörlerin minimum ve maksimum değerleri ön çalışmalar ile belirlenmiş olup pH, sıcaklık, çözgen/katı madde oranı ve etanol/su oranı için sırasıyla 2,5-6,5, 4-72°C, 5:1-25:1, ve 0:100-100:0 değerleri belirlenmiştir. Elde edilen ekstraktlara toplam fenolik madde miktarı, toplam monomerik antosiyanin miktarı, polimerik renk, toplam antioksidan aktivitesi ve yüksek basınçlı sıvı kromatografisi kullanılarak antosiyanin kompozisyon analizleri yapılmıştır. Renk analizleri haricinde, yüksek sıcaklık, çözgen/katı madde oranı ve etanol/ su oranının ekstraksiyon verimini arttırdığı tespit edilmiştir. Ancak, polimerik renk analizlerinin en düşük olduğu noktalar; düşük pH değerleri ve çözgen/katı madde oranı, düşük veya orta dereceli sıcaklıklar ve yüksek etanol oranı olarak belirlenmiştir. Elde edilen sonuçlara göre en uygun ekstraksiyon değerleri; pH 3,5, sıcaklık 50°C, çözgen/katı madde oranı 10:1 (v/w) ve etanol/su oranı 75:25 (v/v) olarak bulunmuştur. Yanıt yüzey yöntemiyle teorik olarak bulunan en uygun koşullar ile ekstraksiyon işlemi tekrarlanmış ve teorik model deneysel sonuçlarla desteklenmiştir. Böylece elde edilen modelin uygulanabilir olduğu belirtilmiştir. Tezin ikinci bölümünde ise kara havuç antosiyaninlerinin farklı koşullarda dayanıklılığı incelenmiştir. Açillenmiş antosiyanin oranı yüksek kara havuç antosiyaninleri diğer antosiyanin kaynaklarına göre göreceli olarak farklı koşullarda daha dayanıklı olabilmektedir. Fakat C vitamini (L-askorbik asit) varlığında antosiyaninlerde zamanla bozunma gözlemlenebilmektedir. Bu nedenle, kara havuç ekstraktının farklı oranlarda askorbik asit varlığında dayanıklılığı UV/VIS spektroskopisiyle farklı zamanlarda alınan örneklerle incelenmiştir. Artan askorbik asit miktarının ekstraktın bozunmasını arttırdığı gözlenmiştir. Bu nedenle, lipozom ile enkapsülasyonun antosiyanin dayanıklılığına etkisi incelenmiştir. Farklı lesitin konsantrasyonları (%1, %2 ve %4) ve farklı antosiyanin miktarları (%0,1, %0,2 ve %0,4) kullanılarak yüksek basınçlı homojenizasyon yöntemi ile kara havuç ekstraktı içeren lipozom üretimi gerçekleştirilmiştir. Elde edilen lipozomların fiziksel karakterizasyonu için partikül boyutu (41-46 nm) ve zeta potansiyel analizleri [(-23)-(-20) mV] gerçekleştirilmiştir. Lipozomların enkapsülasyon etkinliği UV/VIS spektroskopisiyle belirlenmiş olup artan lesitin konsantrasyonlarının enkapsülasyon etkinliğini %50'ye kadar arttırdığı belirlenmiştir. Kara havuç ekstraktının lipozom ile enkapsülasyonu sonucunda, kara havuç ektraktlarının renk özelliklerinin askorbik asit varlığında iyileştiği gözlenmiştir. Bu çalışma ile askorbik asit varlığında antosiyaninlerin bozunmasının lipozom enkapsülasyonu ile azaltılabileceği gösterilmiştir. Tezin üçüncü kısmında ise, çalışmanın daha önceki bölümlerinde lipozom ile enkapsülasyonun antosiyaninleri koruma etkisi gözlendiği için bu bilgiden yola çıkılarak açillenmiş antosiyaninlerin ve açillenmemiş antosiyaninlerin lipozom ile enkapsülasyonundan önce ve sonra askorbik asit varlığında antosiyanin miktarındaki değişim araştırılmıştır. Bu nedenle kara havuç ekstrasktlarının lipozom ile enkapsülasyonu gerçekleştirilmiş ve fiziksel karakterizasyonları yapılmıştır. Elde edilen lipozomların boyutu 50 nm'den az olarak ölçülmüştür. Zeta potansiyeli ise (-23)-(-20) mV olarak bulunmuştur. Enkapsülasyon etkinlikleri yüksek basınçlı sıvı kromatografisi kullanılarak antosiyanin miktarı üzerinden hesaplanmıştır. En yüksek enkapsülasyon etkinliği %60 olarak belirlenmiştir. Farklı miktarlardaki askorbik asit (%0,01, %0,025, %0,05 ve %0,1 w/w), kara havuç ekstraktı (%0,2) içeren lipozom (%1, %2 ve %4 lesitin içeren) örneklerine ve sadece %0,2 ekstrakt çözeltisine uygulanmıştır. Depolama süresince alınan örneklerde yüksek basınçlı sıvı kromatografisi ile her bir antosiyaninin miktarındaki değişim gözlenmiş olup lipozom ile enkapsülasyonun sinapik, ferülik ve kumarik asit ile açillenmiş siyanidin türevlerine pozitif bir etkisi olduğu belirlenmiştir. Tezin dördüncü aşamasında ise, kara havuç ekstraktı içeren ve içermeyen lipozomların fiziksel ve kimyasal dayanıklılığı depolama süresince ölçülmüştür. Bu çalışmada %0,1, %0,2 ve %0,4 w/w kara havuç ektraktı içeren farklı lesitin konsantrasyonlarında (%1, %2 ve %4) lipozomlar üretilmiştir. Ayrıca, hiç ekstrakt içermeyen %1, %2 ve %4 konsantrasyonlarında lesitin içeren lipozomlar üretilmiştir. Üretilen lipozomların fiziksel karakterizasyon analizleri yapılmıştır. Başlangıç örnekleri ve 21. güne ait örneklerde partikül boyutu ve zeta potansiyeli özellikleri karşılaştırılmıştır. Partikül boyutları 50 nm'nin altında bulunmuş olup depolama süresince istatistiksel olarak bir değişim gözlenmemiştir (p<0,05). Lipozomlara antosiyanin miktarı, fenolik madde miktarı ve antioksidan aktivitesi analizleri uygulanarak lipozomların biyokimyasal dayanıklılığı tespit edilmiştir. Lipozom üretiminde fosfolipidler kullanılmaktadır. Lipozomların kimyasal stabilitesi oksidasyon analizleri ile belirlenmiştir. Bu doğrultuda gaz kromatografisi kullanılarak ekstrakt içeren ve içermeyen lipozomlara hekzanal analizleri uygulanmıştır. Sonuçlar incelendiğinde, çoklu doymamış yağ asiti içeren lesitinlerin oksidasyonunun kara havuç antosiyaninleri ile önlenebileceği görülmüştür. Ayrıca, lipid konsantrasyonunun kara havuç antosiyaninleri ile oksidasyonun önlenmesine etkisi belirlenmiştir. Bu çalışma ile lipozomlara antosiyanin eklenmesinin doymamış yağ asitlerin oksidasyonunun önlenmesi üzerinde etkili olduğu belirlenmiş ve önemli veriler elde edilmiştir. Tezin son kısmında ise kara havuç antosiyaninlerinin farklı sistemler (sadece ekstrakt, ekstrakt içeren lipozom, kitosan ile kaplanmış lipozom içerisinde ekstrakt ve kitosan ile ekstrakt karışımı) içerisinde püskürtmeli kurutucu ile enkapsülasyonu çalışılmıştır. Kara havuç antosiyaninlerini içeren birincil ve ikincil lipozom örnekleri fiziksel olarak başarılı bir şekilde püskürtmeli kurutma işlemi sonrasında elde edilmiştir. Taramalı elektron mikroskobu (SEM) analizleri sonucunda tozların morfolojik özellikleri belirlenmiştir. Lipozom içeren ürünlerde herhangi bir çatlak gözlenmemiştir. Fakat biyokimyasal analizlerde lipozom içeren örnekler, sadece kara havuç ekstraktı ve kara havuç-kitosan karışımı örneklerinden daha düşük dayanıklılık göstermiştir. Bu tez çalışmasında kara havuç antosiyaninlerinin gıda renklendiricisi olma potansiyeli hem enkapsülasyon aşamasından sonra hem de askorbik asit varlığında değerlendirilmiştir. Kısa dönem depolama sonuçlarına göre, askorbik asitin kara havuç antosiyaninleri üzerindeki olumsuz etkisi lipozom enkapsülasyon metodu ile azaltılmıştır. Ayrıca, uygulanan lipozom sisteminin şeffaf ve berrak olmasından dolayı içecek sektörü için uygun olduğu görülmüştür. Fakat uzun dönem depolama sırasında lipozom ile enkapsülasyonu sağlanan antosiyaninlerde renk kaybı olduğu tespit edilmiştir. Tezin içinde de belirtildiği gibi kopigmentasyonun enkapsülasyona etkisi farklı fenolik bileşikler kullanılarak, lipozomlara ikincil bir kaplama yapılarak veya doymuş yağ asitleri içeren lesitin kaynağı kullanılarak ileriki çalışmalarda engellenebilir. Diğer yandan, uzun dönem depolama sonuçlarında öne çıkan bir başka sonuç ise antosiyaninlerin lipozomların oksidasyonunu engellediği veya ertelediğidir. Bu şekilde lipozomal sistemlerde kopigmentasyon arttırılarak iki yönlü koruma sağlanabilir. Böylece, enkapsüle edilmiş kara havuç antosiyaninleri zorlu proses koşullarında bile dayanıklılığını koruyabilir