CRISPR taraması ile eritropoezde farklılaşma aşamasına özgün epigenetik faktörlerin belirlenmesi

Eritropoez, farklılaşmanın belirli hücresel evreler boyunca ilerlediği ve terminal olgunlaşma ile enükleasyonla sonuçlanan, sıkı biçimde düzenlenen bir süreçtir. Soy belirleyici transkripsiyon faktörleri eritroid gen düzenlenmesi için vazgeçilmez olsa da, epigenetik düzenleyicilerin eritroid olgunlaşma sırasında hücre evresine özgü transkripsiyonel programları nasıl yönlendirdiği hâlâ yeterince anlaşılmamıştır. Bu tez çalışmasında, insan eritropoezinin epigenetik düzenleyici yapısı CRISPR/Cas9 tabanlı fonksiyonel taramalar kullanılarak sistematik biçimde incelenmiştir. Çalışmalar, eritroid farklılaşmada merkezi rol oynayan iki temel kromatin düzenleyici yolak ortaya koymuştur: histon asetiltransferaz EP300 ve SMARCB1 içeren cBAF (SWI/SNF) kromatin yeniden düzenleme kompleksi. BEL-A hücreleri ve primer CD34⁺ progenitörler dahil olmak üzere senkronize insan eritroid farklılaşma modelleri kullanılarak, EP300 ve SMARCB1'in eritropoezi birbirinden farklı ve hücre evresine bağlı mekanizmalarla düzenlediği gösterilmiştir. EP300'ün eritroid farklılaşmanın erken aşamalarında gerekli olduğu gösterilmiştir. EP300 kaybı, erken eritroid evre geçişlerini bozarak eritroid genlerin geniş ölçekte aktive edilememesine ve eritroid soya yönelimin zayıflamasına yol açmaktadır. Buna karşılık, SMARCB1 erken eritroid farklılaşma için daha az kritik olmakla birlikte, terminal olgunlaşma aşamasında vazgeçilmez hâle gelmektedir. Primer CD34⁺ hematopoietik kök/progenitör hücrelerde EP300 kaybı bazofilik–polikromatik geçişte ilerlemeyi durdururken, SMARCB1 eksikliği eritrosit üretimini ve enükleasyon verimliliğini belirgin biçimde azaltmıştır. Ayrıca, tek hücreli ve toplu RNA dizileme analizleri, EP300'ün farklılaşmaya eşlik eden transkripsiyonel programları yönettiğini doğrulamıştır. SMARCB1'in terminal eritropoezdeki rolünü daha iyi anlamak amacıyla genom genelinde kromatin erişilebilirliği incelenmiş ve SMARCB1 kaybının global kromatin erişilebilirliğini değiştirmediği görülmüştür. Benzer şekilde, SMARCB1 perturbasyonunun GATA1 protein düzeylerini etkilemediği saptanmıştır. Bu bulgular, SMARCB1'in eritroid olgunlaşmayı kromatin erişilebilirliği ya da transkripsiyon faktörü ekspresyonundaki değişiklikler yoluyla düzenlemediğini göstermektedir. SMARCB1'e bağlı eritroid transkripsiyonel programların temelindeki protein–DNA etkileşimlerini incelemek için, kromatin üzerinde transkripsiyon faktörü bağlanmasını yüksek çözünürlükte haritalamaya olanak tanıyan, deaminaz temelli bir footprinting yöntemi olan Docking & Deamination-Seq (D&D-Seq) kullanılmıştır. Elde edilen sonuçlar, SMARCB1 knockout'unun eritroid düzenleyici bölgelerin bir kısmında GATA1 bağlanmasını değiştirdiğini; özellikle SNCA lokusunda bağlanmanın azaldığını, TFR2 lokusunda ise arttığını göstermiştir. SNCA'nın normal geç evre eritroid farklılaşma sırasında güçlü biçimde aktive edildiği göz önüne alındığında, bu bulgular SMARCB1'in terminal olgunlaşma gen programlarının GATA1 aracılığıyla doğru şekilde aktive edilmesi için gerekli olduğunu ortaya koymaktadır. Sonuç olarak bu çalışma, EP300'ü erken eritroid farklılaşma için gerekli bir faktör, SMARCB1/cBAF kompleksini ise terminal olgunlaşma ve enükleasyon için kritik bir bağımlılık olarak tanımlamakta ve insan eritropoezinin ardışık evrelerini koordine eden, birbirinden farklı kromatin temelli mekanizmaları ortaya koymaktadır.