Escherichia coli ve Salmonella enteritidis tayinine yönelik yatay akış analiz sistemi geliştirilmesi

Son yıllarda patojen bakterilerin hızlı ve doğru tespiti, halk sağlığı ve gıda güvenliği açısından oldukça güncel bir araştırma alanıdır. Bu amaca yönelik etkin yöntemlerden biriside, Yüzeyde geliştirilmiş Raman saçılması (SERS) olup, duyarlılığı, sinyali çoğaltma yetkinliği, taşınabilirliği ve kâğıt tabanlı yatay akış immünoassay (LFIA) sistem, yüksek analiz hızı, aynı zamanda düşük maliyetli olması nedeniyle patojen mikroorganizma tespitinde güçlü ve etkili bir teknik olarak öne çıkmaktadırlar. Yapılan bu çalışmanın birinci aşamasında, yaygın patojenitesi bilinen ve seçilen E. coli ve S. enteritidis suşları, SERS tabanlı LFIA sistemi oluşturmak için, raman etiketi DTNB; 5,5 ́-Dithiobis(2-Nitrobenzoik asit) kullanıldı, ikinci aşamada da Fe3O4/Au-PEI nanopartikülleri ile ön-zenginleştirme yapıldıktan sonra, seçilen patojen bakterilerin tespiti ve kantitatif analizi gerçekleştirilmiştir. Bu hedefe yönelik olarak, 20 nm boyutunda altın nanopartikül (AuNP) ve 15 nm boyutunda Fe3O4/Au-PEI sentezlenmiştir. Daha sonraki aşamada da kazeini parçalayan rennet enzimi kullanılarak seçilen mikroorganizmaların tespitinde optimize koşullar araştırılmıştır. Araştırmamızın ikinci aşamasında, enzim tabanlı manyetik ekstraksiyon sistemi kullanılarak, seçilen bakteri antikoru ile kaplı Fe3O4/Au-PEI nanopartiküller, 101-107 kob/mL E. coli derişimleri olacak şekilde etkileştirilmiştir. Daha sonra rennet yardımıyla kazein hidroliz edildiğinde, Fe3O4/Au-PEI nanopartiküllerine bağlı bulunan E. coli manyetik alan yardımıyla ayrılmıştır. Serbest bakteriler konjugasyon ped (AuNP+DTNB+antikor kompleksi) üzerinde altın nanopartiküllere bağlı olan raman etiket DTNB ile nitroselüloz membran üzerinde yürütülmüş, ve bakteri derişimi kağıt tabanlı LFIA sistem nitroselüloz membran üzerinde bulunan test çizgisi ile tespit edilmesi sağlanmıştır. DTNB molekülünün SERS sinyallerini takip edilerek bakterinin artan konsantrasyonuna karşı lineer bir kalibrasyon eğrisinden LOD: 0,52 ve R2 değerleri de 0,98 olarak saptanmıştır. Bu değerler farklı bakteri türlerine B. subtilis, M. luteus, S. enteritidis suşlarına karşı sadece E.coli'ye spesifik olarak çalıştığı gösterilmiştir. Çalışmamızın üçüncü aşamasıda, biyolojik örnek olarak sentetik idrar, referans kan ve ticari süt örnekleri kullanılmıştır. Geliştirilen sistem ile seçilen E. coli'yi ne kadar tuttuğumuzun etkinliği %86 ve üzeri olarak saptanmıştır. Yaptığımız bu çalışmada patojen mikroorganizmaların tayininde kullanılan antikorun pahalı olması nedeniyle alternatif bir yöntem düşünülmüştür. Bu amaca uygun olarak, LFIA sistemde kullanılan antikor yerine, doğal afiniteleri ve yüksek özgüllükte konak seçicilikleri nedeniyle bakteriyofajların alternatif yöntem olarak kullanılması hedeflenmiştir. Bunun için S. enteritidis'i konak olarak seçen P22 fajı ve kıyaslamak amacıyla antikoru kullanılmıştır. Yapılan bakteriyofaj çalışması sonucunda S. enteritidis (101-107 kob/mL) SERS kalibrasyon grafiklerinden LOD: 7 kob/mL ve R2: 0,98 olarak saptanırken, antikor çalışmamızda LOD: 6 kob/mL ve R2: 0,98 bulunmuştur. Bu sonuçlar göstermiştir ki patojen mikroorganizmaların tayininde bakteriyofajın antikora kıyasla alternatif ve ucuz bir yöntem olacağı görülmüştür. In vivo çalışmamızda S. enteritidis ile enfekte edilen yumurta ve tavuk eti örnekleri, P22-bakteriyofaj tabanlı yatay akış sistemimiz kullanıldığında, %90 ve üzerinde bakteriyi tuttuğu ve ayırdığı saptanmıştır. Sonuçta yatay akış sistemimizin etkin çalıştığı ayrıca bakteriyofajların alternatif bir yöntem olabileceği görülmüştür.