Antimisin-a dirençli Saccharomyces cerevisiae'nin evrimsel mühendisliği ve fizyolojik analizi

Saccharomyces cerevisiae mayası, iyi bilinen genetik ve metabolik altyapısı ve üretim kolaylığı açısından yaygın olarak kullanılan bir ökaryotik model organizmadır. Genomu 1996 yılında sekanslanmıştır ve sekansı bilinen ilk ökaryotik organizmadır. Ayrıca, insan genomu ile karşılaştırıldığında çok sayıda homolog geni vardır. Bazı özellikleri sebebiyle, mitokondriyel fonksiyonları incelemek için de uygun bir model organizmadır. Mitokondria organeli hakkında yapılan birçok keşif S. cerevisiae model organizması kullanılar yapılmıştır. En önemlisi, fakültatif bir organizma olması sebebiyle, mitokondriyal disfonksiyon durumunda dahi yaşayabilen ve mitokondriyel DNA mutasyonlarına karşı çeşitli sağkalım mekanizmalarına sahip olan bir mikroorganizmadır. Mitokondri, temel işlevi oksidatif fosforilasyon ile enerji üretmek olan bir organeldir. Bu fonksiyonun yanı sıra, termojenez, apoptoz, lipit ve sterol sentezi ile kalsiyum depolama gibi farklı görevlere de sahiptir. Mitokondri çift katlı zardan oluşmuş bir organeldir ve kendi mitokondriyel DNAsı (mtDNA) ve sitoplasmik ribosomlardan yapısal farklılıkları bulunan ribosomları bulunmaktadır. Mitokondri organeli yapısal ve fonksiyonel bazı farklılıkları sebebiyle daha çok prokaryotik bir mikroorganizmaya benzemektedir. Mitokondrideki fonksiyonel bozukluklar, başta sinir ve kas sistemi olmak üzere, en çok enerjiye ihtiyaç duyulan sistemlerde görülen mitokondriyal hastalıklara neden olabilir. Bu bozukluklar tipik olarak kardiyovasküler ve nörodejeneratif bozukluklara, görme ve işitme kayıplarına, diyabete, böbrek ve karaciğer bozukluklarına neden olur. Son yirmi yılda mitokondriyal bozuklukların patogenezinde birçok keşif yapılmasına rağmen, bu hastalıkları iyileştirmek için hala etkili tedaviler yoktur. Mitokondri ile ilgili genetik ve fonksiyonel bilgilerin çoğu S. cerevisiae model organizması üzerine yapılan çalışmalarla elde edilmiştir. Günümüzde genetik mutasyonların neden olduğu mitokondriyel hastalıkların çoğu, rekombinant DNA teknolojileri ve rasyonel metabolik mühendislik yaklaşımı kullanılarak S. cerevisiae modelleri üzerinde araştırılmaktadır. Fakat bu tip deneysel tasarımın, detaylı genetik bilgi gerektirmesi, organizma tarafından rekombinasyonun reddedilmesi ve öngörülemeyen fenotipik sonuçların görülebilmesi gibi bazı kısıtlamaları vardır. Bu kısıtlamalar nedeniyle, tersine metabolik mühendislik alternatif bir yaklaşım olarak kullanılmaktadır. Bu bilgilerin ışığında, bir tersine metabolik mühendislik yaklaşımı olan evrimsel mühendislik stratejisi ile, antimisin-A dirençli S. cerevisiae mutantlarının elde edilmesi ve bu direncin moleküler temelinin aydınlatılmasına yönelik ilk adım olan fizyolojik analizlerin gerçekleştirilmesi amaçlanmıştır.Antimisin-A, bc1 kompleksine bağlanan ve elektron transferini engelleyen bir mitokondriyal kompleks inhibitörüdür. Antimisin-A quinone molekülünün analoğudur ve mitokondriyel kompleks III ün bc1 üzerindeki Qi bölgesine bağlanır. Böylece Qo bölgesine bağlanan quinol molekülü üzerinden gelen elektronların transferi engellenir ve kompleks IV e aktarımı durur. Ayrıca antimisin-A mitokondrideki redoks reaksiyonlarının bozulmasına sebep olarak hücre içerisinde reaktif oksijen moleküllerinin (ROS) artışına sebep olur. Sonuç olarak, hücreler mitokondriyal oksidasyon yoluyla yeterli enerji üretemez ve hayatta kalmak için alternatif metabolik yolaklar bulmaya mecbur kalırlar. Antimisin-A dışında araştırmalarda sıklıkla kullanılan atpenin, oligomisin, stigmatelin veya siyanid gibi birçok farklı mitokondriyel inhibitör bulunmaktadır. Bu inhibitörler içinden, antimisin-A'nın seçilerek bu çalışmada kullanılmasına karar verilirken birçok faktör göz önünde bulundurulmuştur. Bunlar; antimisin-A'nın mitokondriyel kompleks III'e yüksek afinitede bağlanması, çok düşük konsantrasyonlarda bile yüksek inhibisyon etkisi göstermesi ve kullanımının daha güvenli oluşu gibi faktörlerdir. Bu çalışmada, antimisin-A dirençli mutantlar, hem referans suş hem de onun EMS-mutajenize popülasyonu ile yapılan seleksiyonlar ile başarılı bir şekilde seçilmiştir. Seleksiyon yöntemi olarak, hücrelerin mitokondriyal fonksiyona bağımlı hale getirilmesi amacıyla respiratif koşullarda kademeli olarak artan stres düzeyini, kesikli kültürde uygulama protokolü kullanılmıştır. 52. popülasyonda antimisin-A stres düzeyi 6.6 nM'a ulaşmış ve mutant bireyler bu son popülasyondan seçilmiştir. Referans suş seleksiyonundan 12 mutant, EMS-mutajenize edilmiş referans suş popülasyonun seleksiyonundan 15 mutant seçilmiştir. Bu mutantlar farklı antimisin-A konsantrasyonları altında tarandıktan sonra, en yüksek dirence sahip iki mutant suş belirlenmiştir. Referans suş seleksiyonundan elde edilen mutant bireylerin, 15 nM antimisin-A'ya karşı dirençli oldukları ve EMS-mutajenize edilmiş popülasyondan seçilen mutantların ise 50 nM antimisin-A'ya dirençli olduğu gözlemlenmiştir. Bu çalışma, literatür bilgisi dahilinde, evrimsel mühendislik stratejisi ile antimisin-A'ya dirençli S. cerevisiae mutantlarının elde edildiği ilk çalışmadır. Antimisin-A direncinin kalıcı olup olmadığını belirlemek için dirençli mutantlara genetik kararlılık testi uygulanmış ve referans suş seleksiyonundan elde edilen mutant bireylerden biri hariç tüm mutantlar genetik olarak kararlı bulunmuştur. Ek olarak, antimisin-A'ya dirençli bir mutant suşun, EMS mutajenezi yapılmadan doğrudan referans suştan elde edilmiş olması, antimisin-A'nın olası mutajenik etkilerine işaret etmektedir. Fizyolojik karakterizasyon deneyleri kapsamında yapılan çapraz direnç analizleri ile, antimisin-A dirençli mutantların ayrıca kafein, propolis, koniferil aldehit ve etanole karşı çapraz dirençli oldukları ortaya çıkarılmıştır. Benzer şekilde önceki çalışmalarda, etanole dirençli mutant haricindeki belirtilen diğer streslere dirençli mutantlar, aynı zamanda, antimisin-A'ya karşı çapraz dirençli bulunmuşlardır. Bu durum, bu mutantlar arasındaki benzer bir moleküler direnç mekanizmasına işaret etmektedir. Ayrıca etanol çapraz direnci de beklenen bir sonuçtur, çünkü seleksiyon prosedürü tek karbon kaynağı olarak etanol kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Dolayısıyla hücrelerin etanolü kullanacak şekilde metabolik değişikliklere gitmiş olamaları beklenen bir durumdur.Bu çalışmada antimisin-A dirençli S. cerevisiae mutantları evrimsel mühendislik stratejisi ile elde edilmiş ve fizyolojik karakterizasyon deneyleri gerçekleştirilmiştir. Daha ileri çalışmalar için, genomik ve transkriptomik analizler yapılarak, işlevsel olmayan mitokondriyel kompleksin etkilerini ortadan kaldıran alternatif yolaklar bulunabilir ve olası farmasötik hedefler belirlenebilir.