Laktik asit bakterilerinin polifenol direncinin evrimsel mühendislik ile geliştirilmesi

Bu çalışmanın amacı zeytin fermantasyonlarında starter kültür olarak kullanılabilecek, oleuropeine dirençli laktik asit bakterilerinin, tercihen Lactobacillus plantarum suşlarının evrimsel mühendislik yaklaşımı ile geliştirilmesidir. Laktik asit bakterilerinin direnç mekanizmaları pek çok gene ve düzenleyiciye bağlı karmaşık süreçler olduğundan, istenilen dirençli fenotiplerin klasik genetik mühendisliği teknikleri, ya da belirli genlerin aşırı ekspresyonu ile eldesi zordur. Bu nedenle evrimsel mühendislik, iyi bir alternatif strateji olabilir. Bu yaklaşımla elde edilen mikroorganizmalar genetik modifiye organizma olarak nitelendirilmediği için, gıda uygulamalarında daha çok kabul görmektedir. Çalışmanın ilk aşamasında; zeytin fermantasyonlarındaki ana stres unsurunun, zeytinde en çok bulunan polifenol olan oleuropein stresi olduğu fikrinden yola çıkıldı. Ancak gerek izole edilen kültürler ile yapılan denemelerde, gerekse de kültür koleksiyonlarından elde edilmiş tip kültür çalışmalarında, oleuropeinin zeytinde bulunabilecek konsantrasyonlarda tek başına bakteri gelişimini inhibe edici etki gösteremeyeceği, ancak tuz (NaCl) varlığında sinerjik bir antimikrobiyal etki gösterebileceği belirlenmiştir. Bu sonuçlara göre, zeytin fermantasyonlarındaki asıl stres kaynağının oleuropein değil tuz olduğu anlaşılmıştır. Yapılan çalışmalar, suşların canlılığının %0-3 NaCl varlığında değişmediğini ancak % 8 NaCl varlığında oldukça azaldığını göstermiştir. Tuza ve zeytindeki oleuropeine dirençli suşların evrimsel mühendislik yaklaşımı ile geliştirilmesi için, T129 ve DSMZ 10492 adlı yabanıl tip L. plantarum seçilmiştir. Bu suşlardan T129 Marmara bölgesindeki zeytin işleyen bir işletmenin zeytin salamura suyundan daha önce izole edilmiş olup, TÜBİTAK MAM Gıda Enstitüsü Koleksiyonundan temin edilmiştir. DSMZ suşu ise, Portekiz'deki bir zeytin işleme tesisindeki salamura suyundan daha önce izole edilmiş ve DSMZ Kültür Koleksiyonundan temin edilmiştir. Her iki suş da farklı konsantrasyonlarda etil metan sülfonata (EMS) maruz bırakılmış ve böylece genetik çeşitlilikleri arttırılmıştır. Sonrasında ise canlılıklarına bakılarak 0.37 M EMS ile 30 dakika muamele edilen mutant popülasyonlar en uygun bulunmuştur. Her iki mutant topluluğu 32 ardışık kesikli kültür işlemi boyunca kademeli olarak artan NaCl konsantrasyonlarına alıştırılmış ve sonunda %10 (w/v) NaCl' ye dirençli mutant popülasyonlar elde edilmiştir. % 10 tuz direnci zeytincilik uzmanları tarafından zeytin işlemek için yeterli görüldüğünden % 10 tuz varlığında direnç kazandırma çalışmaları tamamlanmıştır. Mutant topluluklarından onikişer mutant suş izole edilmiştir. İzole edilen mutantlar MRS, %10 (w/v) NaCl içeren MRS ve %10 (w/v) NaCl ve 4 g/l oleuropein içeren MRS'de üretilip, her 24 saatte bir katı besi yeri ortamına ekilerek sayılmıştır. Yapılan sayımlar sonucu mutant suşların büyük bir bölümünün yaban tiplerine göre hem NaCl, hem de NaCl ve oleuropein dirençlerinin çok arttığı belirlenmiştir Gerek T129, gerekse DSMZ 10492 yaban tip suşlarından elde edilen mutant suşların, büyük çoğunluğunun her iki yaban tipin de üreyemediği %10 (w/v) NaCl ve %0,4 (w/v) oleuropein varlığında rahatlıkla üreyebildikleri ve bu koşullara kayda değer düzeyde direnç kazanmış oldukları dikkat çekmiştir. Mutant popülasyonların her ikisinden de seçilen onikişer mutant suşun, zeytin üretiminde oleuropein dışında karşılaşılabilecek diğer stres koşullarına karşı çapraz direnci de çalışılmıştır. pH 9'da alkali stresi, NaOH ile acılığı giderilen zeytinlerde yetersiz yıkama nedeni ile sıklıkla NaOH kalıntıları kaldığından seçilmiş; mutantların canlılığı pH'sı 9'a ayarlanmış olan, %50 seyreltilmiş MRS besi yerinde incelenmiştir. Zeytinlerde istenmeyen mikroorganizmaların üremesini engellemek için zeytin işleme sularına laktik asit ve asetik asit ilave edilmektedir. Bu stres koşullarına direncin de araştırılması için, mutant kültürlerin pH değerleri asetik asit ve laktik asit ile 4'e ayarlanmış, iki farklı %50 seyreltilmiş MRS besiyeri ortamındaki canlılıkları incelenmiştir. Siyah zeytinlere renk vermek amacı ile, %0.1 (w/v)'lik demir glükanat uygulaması yapılabilmektedir. Bu nedenle mutantların %0.1(w/v)'lik demir glükanat varlığındaki gelişmeleri incelenmiştir. Son olarak ise, çoğu starter kültür liyofilize toz formda satışa sunulduğu için suşların liyofilizasyon ile kurutmaya karşı dirençleri incelenmiştir. Yapılan çalışmalar sonrası bütün suşlar %0.1 (w/v)'lik demir glükonat varlığında yüksek gelişme göstermişlerdir. T129 suşu ve mutantlarının neredeyse tamamı pH 9 daki NaOH'a dayanırken, bu direnç DSMZ 10492'nin bazı mutantlarında kaybolmuştur. pH 4'te asetik asit veya laktik asit stresi bütün suşları zorlamıştır. Liyofilizasyon stresine direnç ise bazı mutantlarda artmış, bazılarında ise azalmıştır. Sonuç olarak tuz direnci ile ciddi ölçüde birlikte gözlenen bir direnç belirlenememiştir. Yapılan çapraz direnç çalışmaları sonrasında T129 suşunun T8 kodlu mutantı ile DSMZ 10492 suşunun D2 kodlu mutantı fizyolojik çalışmalar için seçilmiştir. Seçilen suşlar tuzsuz ve %6,5 (w/v) tuz içeren seyreltilmiş MRS besiyerinde geliştirilmiş ve gelişimleri, glukoz tüketimleri ve laktik asit üretimleri incelenmiştir. Yapılan fizyolojik çalışmalar her iki mutantın yüksek tuz konsantrasyonlarına adapte olmak için muhtemelen farklı moleküler mekanizmalardan yararlandıklarına işaret etmektedir. T8 suşunda yüksek tuz konsantrasyonuna direnç muhtemel olarak hücre duvarında meydana gelen değişiklikler kaynaklı olabilecekken, D2 suşunda ise tuz direnci, çözünen karşıt maddelerin hücrede depolanması ile gelişmiş olabilir. Tez çalışmasının üçüncü aşamasında ise, zeytinde starter olarak kullanılabilecek probiyotik bir suşun geliştirilmesine çalışılmıştır. Böyle bir suş; hem zeytin fermantasyonunun kontrollü bir biçimde ilerlemesini, hem de zeytinlerin probiyotik kaynağı olarak tüketilebilmesini sağlayabilir. Bu amaçla zeytin işleme sularından izole edilmiş olan T129 suşundan, üst sindirim sisteminden yüksek canlılıkta geçen bir suş geliştirilmesine çalışılmıştır. Ağız yolu ile alınan bir suş, sindirim sisteminden geçişi sırasında pek çok stres koşulu ile karşılaşır. Yutulan suş, mide ortamında giderek düşen pH ve mide enzimlerine maruz kalırken, mideden sonra kolonize olması da peristaltik hareket ile engellenir. Bir yandan da zayıflamış suş, ince bağırsağın farklı bölgelerinde pankreatik enzimler, safra tuzları ve besin eksikliğine maruz kalır. Bu nedenle, elde edilen EMS mutajenine maruz kalmış ve rifampisin dirençli mutant popülasyonu in vitro bir sindirim sistemine verilerek bu sistemden canlı kalanların tekrar sisteme verilmesi ile, sindirim sistemindeki bütün streslere dayanan bir mutant bulunabileceği hipotezi kurulmuştur. Bu amaçla, bilgisayar kontrolü ile insan üst sindirim sistemini dinamik bir biçimde doğru olarak taklit edebilen TIM-1 model sisteminin kullanılmasına karar verilmiştir. Sistemde bulunan dört bölme mide, onikiparmak bağırsağı, boş bağırsak ve kıvrım bağırsağı temsil etmektedir. Bu bölmelerde vücut sıcaklığı, peristaltik hareket, besin boşaltım hızı ve pH, enzim ve elektrolit seviyeleri gerçek fizyolojik koşullara mümkün olduğunca uygun olarak bölmeye özgü bir biçimde taklit edilmektedir. TIM-1 pek çok potansiyel probiyotiğin mide ve ince bağırsaktan geçişinde canlı kalma yüzdelerinin belirlenmesinde ve canlılığı sınırlayıcı faktörlerin ortaya konulmasında kullanılmış ve valide edilmiş bir sistemdir. Bu nedenle mutant T129 topluluğu sisteme beslenmiş ve sistemden çıkan popülasyonlar sisteme beş kez tekrar beslenerek sistemde yüksek oranda canlı kalan suşların seçimi yapılmıştır. Yapılan çalışmalar sonucu elde edilen mutant popülasyondan koloniler elde edilmiş ve tüp bazlı denemeler ile içlerinden J1 suşu seçilmiştir. J1 suşunun canlılığı TIM-1 sisteminde denenmiş ve suşun canlılığının yaban suşta %59,7 iken J1 mutantında %100'e yakın olduğu belirlenmiştir. J1 suşunun genetik kararlılığının belirlenmesi için J1 suşu seçici olmayan stressiz koşullarda art arda 3 kesikli kültürde toplam 88 saat büyütülmüş ve canlılığı TIM-1 sisteminde tekrar ölçülerek, suşun üst sindirim sisteminde canlı kalma yeteneğini koruduğu tespit edilmiştir. J1 suşunun üst sindirim sisteminde artan canlılığının genetik temellerinin araştırılabilmesi için J1 suşu ve T129 yabanıl tip suşunun genom dizileri yeni nesil dizileme yöntemi ile belirlenmiştir. Elde edilen dizilerin karşılaştırılmasının ardından iki genom arasında 32 nokta mutasyonu farkı olduğu görülmüştür. Mutasyonların hepsinin ya C'den T'ye ya da G'den A'ya nokta mutasyonları olduğu belirlenmiştir. Bu sonuç, oluşan mutasyonların, uygulanmış olan EMS mutajenez işlemi ile ilişkili olduğunu göstermektedir. Ayrıca; oluşan mutasyonlardan C'den T'ye 15, G'den A'ya ise 17 mutasyon saplanmış olması ve bakteri genomu ile kıyaslandığında oluşan mutasyon frekansı (10-5 olan literatür değeri ile uyumlu olduğu için), uygulanan mutasyon işleminin başarılı olduğunu göstermektedir. Nokta mutasyonların gen düzeyindeki etkilerinin belirlenebilmesi için genom anlamlandırması (annotation) yapılmıştır. Anlamlandırma çalışmaları sonrası nokta mutasyonların; genomda phosphoribosylformylglycinamidine synthase subunit PurL, glutamine ABC transporter, permease protein, DNA repair protein RecN, ribosome small subunit-dependent GTPase A, molecular chaperone DnaK, DNA-directed DNA polymerase III, alpha chain PolC-type, phosphatidate cytidylyltransferase, cell surface protein, cardiolipin synthetase ve ATP-dependent zinc metalloprotease FtsH genlerini etkilediği belirlenmiştir. Bu genlerde oluşan nokta mutasyonların protein düzeyindeki etkileri biyoinformatik incelemeler ile yorumlanmış ve J1 suşunun direnç kazanmak için muhtemelen hem hücre duvarı yapısını değiştirdiği, hem de DNA tamiri ve stres tepkisindeki önemli mutasyonların, hücrenin stres cevabını düzenleyerek üst sindirim sisteminde daha iyi adapte olacak şekilde geliştirdiği belirlenmiştir. J1 suşunun bir diğer ilginç özelliği de hücre duvarı yapısında değişiklik olsa da hücre duvarındaki yapı değişikliğinin normal dışı hücre topaklanması gibi yapılara yol açmaması ve J1 suşunun stres cevabı ve DNA tamir sistemlerinde farklılıklar olsa da üreme hızının yabanıl tipten fark göstermemesidir. Sonuç olarak, bu çalışmada; strese dirençli, genel anlamda dayanıklı ve probiyotik özellikleri de iyileştirilmiş L. plantarum suşlarının eldesi için, yeni seleksiyon stratejileri başarıyla uygulanmıştır. Elde edilen dayanıklı ve probiyotik özellikleri iyileştirilmiş suşlar, zeytin fermentasyonlarında potansiyel olarak kullanılabilir. Stres direnci veya dayanıklılık gibi istenilen özelliklerin karmaşık moleküler mekanizmalarının anlaşılabilmesi için, transkriptomik ve proteomik düzeyde de kapsamlı çalışmaların yapılması gerekecektir.