Çinko oksit ve nisin-yüklü çinko oksit nanopartiküllerinin Bacillus subtilis ZBP4 ile hücre dışı biyosentezi ve karakterizasyonu

Son yıllarda mikroorganizmalar aracılığıyla çinko oksit nanopartiküllerinin (ZnO NP) sentezine olan ilgi, daha güvenli bir yöntem olması nedeniyle artmıştır. Kimyasal ve fiziksel sentez yöntemlerine alternatif olarak ZnO NP'lerin biyosentezi, uygun maliyetli, çevre dostu ve geniş ölçekli üretim olanakları nedeniyle daha avantajlıdır. Bu çalışma, 1 Ocak 2021 - 1 Haziran 2022 tarihleri arasında Sakarya Üniversitesi Gıda Mühendisliği Bölümü laboratuvarlarında gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada, ZnO NP sentezleme yeteneğinde olan Bacillus suşlarının belirlenmesi ve nanopartikül biyosentezinin optimizasyonu ile nanopartiküllerin özellikle potansiyel uygulama alanlarının belirlenmesi amaçlanmıştır. Bunun için, daha önce izole edilmiş olan ve Sakarya Üniversitesi, Gıda Mühendisliği Bölümü, Gıda Biyoteknoloji kültür koleksiyonunda bulunan 45 farklı Bacillus suşunun ZnO NP biyosentez yetenekleri araştırılmıştır. Bakteriler nutrient broth besiyerinde 33 °C'de 24 saat geliştirilmiş ardından hücreler santrifüj yardımıyla uzaklaştırılmış ve elde edilen hücresiz süpernatantta ZnO NP oluşumu UV-VIS spektrofotometre ile absorbans taraması yapılarak belirlenmiştir. Yapılan tarama çalışması sonucuna göre bir toprak örneğinden izole edilmiş olan Bacillus subtilis sp ZBP4 spektrofotometrede 341 nm dalga boyunda yüzey plasmon rezonansından kaynaklanan nanaopartiküllere özgü bir absorbans piki vermiştir. Ayrıca, beyazdan sarıya renk değişimi de nanopartikül oluşumunun bir göstergesi olmuştur. Buna dayanarak Bacillus subtilis spp ZBP4 ZnO NP sentezleme yeteneğinde olduğu anlaşılmış ve sonraki çalışmalara bu bakteri ile devam edilmiştir. Bacillus subtilis ZBP4 ile hücre dışı ZnO NP biyosentezinin optimizasyonu için farklı reaksiyon pH'ları (5-9), sıcaklık (30-40°C), ZnSO4.7H2O konsantrasyonu (2-10 mM) ve reaksiyon sürelerinde (0-72 saat) biyosentezler gerçekleştirilmiştir. Biyosentez oranı reaksiyon ortamından alınan örneklerin absorbanslarının UV-VIS spektrofotometrede 341 nm dalga boyunda ölçülmesi ile belirlenmiştir. Yapılan çalışma sonucunda, Bacillus subtilis ZBP4'ün ZnO NP biyosentezi için optimum koşulların 8 mM ZnSO4.7H2O, pH 7.5 pH, 33°C ve 24 saat olduğu belirlenmiştir. Bir diğer çalışmada da ZnO NP'lerinin etkinliğini artırmak için optimum kuşullarda hazırlanan biyosentez ortamına farklı konsantrasyonlarda (5, 10, 15 mg/mL) nisin eklenerek nisin yüklü ZnO NP (N-ZnO NP) üretimi gerçekleştirilmiştir. Ortama 10 mg/mL nisin eklendiğinde biyosentezin en iyi düzeyde olduğu saptanmıştır. Çalışmanın bir diğer aşamasında optimum koşullarda elde edilen ZnO NP ve nisin-yüklü ZnO NP'lerinin karakterizasyonu yapılmıştır. Bunun için üretilen nanopartiküller santrifüj yardımıyla sıvı ortamda çöktürülüp yıkanmış ve ardından kurutulmuştur. Kurutulmuş nanopartiküllerin morfolojik özellikleri Alan Emisyon Taramalı Elektron Mikroskobu (FESEM) ve Geçirgen elektron mikroskobu (TEM) ile, elemental kompozisyonu Enerji dağılımlı X-ışını spektroskopisi (EDS), kristal yapısı X-ışını kırınımı (XRD) spektrometresi ile belirlenmiştir. Ayrıca, zeta potansiyeli ölçümü ile nanopartiküllerin dispersiyon stabilitesi, ve Fourier Dönüşümü Kızılötesi Spektroskopisi (FTIR) ile de nanopartikül yüzeylerinde kaplama ajanı olarak görev yapan ve stabilizasyonu sağlayan organik maddelerin varlığı incelenmiştir. TEM ile elde edilen görüntülere göre, nanopartiküllerin düzensiz küresel şekilde oldukları ve çaplarının da 50 nm'nin altında olduğu saptanmıştır. TEM analiziyle ZnO NP ve N-ZnO NP'lerin ortalama çapları sırasıyla 26 ve 23 nm olarak belirlenmiştir. N-ZnO NP'lerinin FESEM görüntülerinde nisinin nanopartikül yüzeylerini ağ şeklinde kapladığı gözlenmiştir. Bu nedenle, ZnO NP'lerinin morfolojik yapısı FESEM ile net olarak görüntülenebilmesine karşın N-ZnO NP'lerinin morfolojisi incelenememiştir. ZnO NP'lerinin FESEM görüntülerinde, TEM görüntülerine benzer şekilde düzensiz küresel şekillerde nanopartiküller gözlenebilmiştir. Bu analiz ile nanopartikül boyutlarının 21-59 nm arasında olduğu ve ortalama partikül çapının da 35 nm olduğu belirlenmiştir. Enerji dağılımlı X-ışını spektroskopisi (EDS) ile elde edilen nanopartikül örneklerinin elemental dağılımı incelenmiş ve ortamda elemental Zn ile birlikte C, O, N, P gibi elementlere de rastlanmıştır. Bu çalışma ile hem nanaprtiküllerin varlığı doğrulanmış hem de ortamda nanopartiküller için kaplama ajanı görevi gören ve stabilitenin artmasını sağlayan organik moleküllerin olduğu tespit edilmiştir. Yapılan ölçümlere göre, ZnO NP ve N-ZnO NP'lerinin zeta potansiyeli -19 ve -17,7 mV olarak belirlenmiş olup nanopartiküllerin dispersiyon stabilitelerinin orta seviyede olduğu anlaşılmıştır. FTIR sonuçları organik maddelerin varlığı göstermiştir. Nanopartiküllerin enerji band aralığı UV-VIS spektrumlarından yararlanılarak Tauc eşitliğinden hesaplanmış ve 3.36 eV olarak belirlenmiş olup elde edilen sonuç nanopartiküllerin yarı-iletken özellikte olduğunu göstermiştir. Elde edilen nanopartiküllerin Gram-pozitif (Bacillus cereus, Staphylococcus aureus ATCC 25923 ve Listeria monocytogenes ATCC 7644) ve Gram-negatif (Escherichia coli Tip 1, Escherichia coli O157:H7 NCTC 12900, Pseudomonas aeruginosa)'a gıda patojenlerine karşı antimikrobiyal etkileri disk difüzyon yöntemiyle belirlenmiştir. Yapılan çalışma sonucunda hem ZnO NP hem de N-ZnO NP'lerinin tüm bakterilere karşı antimikrobiyal etkisinin olduğu, minimum inhibisyon konsantrasyonlarının da 1-2 mg/mL arasında olduğu belirlenmiştir. Ayrica, N-ZnO NP'ler, tek başına ZnO NP'lerin ve serbest nisinin etkisine kıyasla patojen bakterilere karşı yüksek etkinlik gösterdiği gözlenmiştir. Bir diğer çalışmada da nanopartiküllerin sıvı besiyerinde antimikrobiyal etkileri belirlenmiştir. Bunun için, belli konsantrasyonlarda (0, 30, 75, 150 µg/mL) nisin, ZnO NP ve N-ZnONP'leri içeren Tryptic Soy Broth'ta Listeria monocytogenes ATCC 7644 ve Staphylococcus aureus ATCC 25923 geliştirilmiş ve belli aralıklarla bakteri gelişimi Mcfarland densitometresi ile ölçülmüştür. Serbest nisin ve ZnO NP içeren ortamlara kıyasla, N-ZnO NP içeren ortamlarda bakteri gelişmesinin önemli oranlarda inhibe edildiği, 150 µg/mL ZnO NP içeren ortamın bacterisidal etki gösterdiği belirlenmiştir. Bu çalışma ile ZnO NP'lerinin nisin yüklemesiyle yüksek oranda antimikrobiyal özellik kazandığı anlaşılmıştır. Ayrıca, ZnO NP ve N-ZnO NP'lerinin antioksidan aktiviteleri de 2.2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radikalini süpürme aktivitesi analizi ile belirlenmiştir. ZnO NP'lerinin antioksidan aktivitesi düşük olmakla beraber N-ZnO NP'leri ile antioksidan aktivite iki katına çıkmıştır. Bu çalışma sonucunda, yerel bir izolat olan Bacillus subtilis ZBP4'ün ZnO NP biyosentezi için kullanılabilecek özellikte bir mikroorganizma olduğu ve bununla üretilen ZnO NP'lerin iyi bir antimikrobiyal ajan olabileceği belirlenmiştir. Ayrıca biyosentez ortamına nisin eklendiğinde üretilen nanopartiküllerin hem antibakterial hem de antioksidan özelliklerinin önemli oranda iyileştirilebileceği ortaya konmuştur.