Ideonella sakaiensis PETase mutantının fotosentetik mikroalg Chlorella vulgaris'de hücre dışı ekspresyonu

PETaz enzimi polietilen terefitalat (PET) türevi plastiklerin hidrolizinden sorumlu temel enzim olarak 2017 yılında ilk kez tanımlanmıştır. İki farklı çalışmada belirlenmiş ve yüksek oranda aktivite artışı sağlamış en yüksek aktiviteli 3 farklı mutasyon belirlenmiş ve bunların kümülatif aktivite artışı durumları in silico modelleme ve moleküler kenetleme analizleri üzerinden dğrulandıktan sonra tek bir PETaz sekansında birleştirilmiştir. Oluşturulan PETaz nükleotit dizisi, sentetik olarak ticari yollardan sentezlendi ve PETaz3M olarak adlandırıldı. PCR yoluyla çoğaltılarak, pJET1.2 klonlama vektörüne klonlandı. PETaz3M'i kodlayan nükleotit bölgesi, mikroalg ifade vektörü pOPT_cCa_mRuby2_Paromy'e aktarıldı. PETaz3M kodlayıcı DNA fragmanı, HSP70/RBCS2 füzyon promotor'un arkasına yerleştirildi. pOPT_cCa_mRuby2_Paromy vektöründe bulunan Kırmızı Floresan Proteinini (RFP) kodlayan bölge, BglII ve EcoRI enzimleriyle kesilerek çıkarıldı ve PETaz3M kodlayıcı DNA fragmanının bu bölgeye ligasyonu sağlandı. Böylece, PETaz3M kodlayan bölge, HSP70/RBCS2 promotoru ve 3' translasyona uğramayan bölge (3'UTR) arasına entegre edilerek, mikroalg konaklarına transformasyon için hazırlandı. pOpt_cCA_mRuby2_Paro_PETaz3M vektörünün C. vulgaris hücrelerine transformasyonu elektroporasyonla gerçekleştirildi. PETaz3M pozitif transformantlar, 50 µg/ml paromomisin içeren TAP besiyerinde üç ardışık nesil boyunca seçime tabi tutuldu. C. vulgaris transformantları'nın hücre dışı ekspresyonu, SDS-PAGE ile doğrulandı. PETase3M enziminin fonksiyonelliği, saflaştırılmış PETase3M ile muamele edilmiş PET filmlerinin ışık mikroskobu altında yüzey analizleri yapılarak doğrulandı. Sonuç olarak, bu çalışma ile bir PETaz mutantının, ekstrem şartlara toleranslı C. vulgaris konaklarında hücre dışı üretimi ilk kez gerçekleştirildi.