Heterologous expression of mouse alpha klotho protein inphotosynthetic microalgae Chlamydomonas reinhardtii

Klotho (Kl), yaşlanmanın güçlü bir baskılayıcısı ve çok fonksiyonlu düzenleyici bir protein olarak tanımlanmaktadır. Mutant klotho aleline sahip homozigot farelerin, tipik yaşlanma fenotipleri olan ateroskleroz, ektopik kalsifikasyon ve osteoporoz karakteristiklerini gösterdikleri, aşırı Klotho proteini üreten farelerde, yaşam ömrünün %30 uzadığı ve Klotho proteininin farklı kanser türleri üzerindeki antagonistik etkisi bilimsel olarak ispatlanmıştır. Kanserli hastalarda serbest KL (secreted KL: sKL) miktarının azaldığı ve dışardan sKL takviyesinin, kanser türleri dahil olmak üzere, çoğu kronik hastalıklar üzerinde iyileştirici etkiler gösterdiği gözlenmiştir. Gelecek 5-10 yıllık süreçte çoğu kanser dahil, diyabet, Alzheimer, Parkinson, kalp yetmezliği, böbrek yetmezliği vb. hastalıklara karşı, tedavi ve koruma amaçlı sKL takviyesinin yapılması kaçınılmaz görünmektedir. Bu çalışmada, fare α-Klotho proteinini kodlayan ilgili gen, pCAMBIA1301 vektörüne klonlanmış ve ardından Agrobacterium tumefaciensis EHA105 hücrelerine aktarılmıştır. Bakteriyel ajanlar vasıtasıyla ilgili gen Agrobacterium tabanlı transformasyon yöntemi ile Chlamydomonas reinhardtii (CC-124) mikroalg konakçılarına aktarılmıştır. CC-124 hücrelerinin pozitif transformantları, üç ardışık nesil boyunca 30 µg/ml Higromisin antibiyotiği içeren TAP agar ortamlarında seçildi. Transforme edilmiş α-Klotho geninin mikroalglerdeki moleküler varlığı bu hücrelerden genomik DNA izolasyonlarının gerçekleştirilmesinin akabinde, karşılık gelen DNA bölgesinin PCR amplifikasyonu ile doğrulandı. Daha sonra, transforme mikroalg konak hücreleri tarafından fare α-Klotho proteininin hücre dışı üretimi, sıvı TAP ortamlarında indüklendi. αKlotho'nun kültür medyalarındaki varlığı, SDS-PAGE ile doğrulanmıştır. Saflaştırılmış proteinin anti-kanserojenik etkisi, iki farklı memeli kanser hatlarında MTT testleri aracılığıyla teyit edildi. Sonuç olarak, farmasötik α-Klotho proteininin ilk kez model mikroalg C. reinhardtii konaklarında rekombinant üretimi başarıyla gerçekleştirilmiştir. Bu vesileyle, düşük maliyetli αKlotho proteini üretimi için bir temel oluşturulmuştur ve bu, yakın gelecekte insan sağlığına yönelik farklı tıbbi uygulamalarda α-Klotho proteininin erişilebilirliğini büyük ölçüde kolaylaştıracaktır.