Fibroblast büyüme faktörü-2 bloklamasının tavuk embriyosunda kraniyal sütür gelişimine etkileri

Kranial kubbenin normal büyümesi ve morfogenezi, sütürlerdeki hücre proliferasyonu ile kranial kemiklerin kenarlarındaki osteogenez arasındaki dengeyi yansıtmaktadır. Klinik bir durum olan kraniyosinostozda, erken osteojenik farklılaşmadan dolayı sütürler prematür birleşir ve kraniofasiyal malformasyon meydana gelir. Günümüzde, bazı fibroblast büyüme faktör (FGF) reseptör genlerindeki mutasyonlar major kraniyosinostotik sendromlar için sorumlu tutulmuştur. Tavuk embriyosu kranial kubbelerindeki endojen FGF-2 ligandlarının seviyelerini manipüle etmek ve morfogenezi bozmak için antikor bloklama yöntemi kullanılmıştır. FGF-2'nin yüksek ve düşük seviyeleri farklı tepkiler verilmesine neden olmaktadır. Bu farklı seviyeler arasındaki denge normal kranial morfogenezi sağlamaktadır. Bu çalışmada, literatür bilgileri ışığında deneysel model olarak tavuk embriyosu gelişimi kullanılarak FGF-2 bloklaması ile kranial sütür gelişimi, deneysel kraniyosnostoz oluşumuna etkisi ve kemikleşme öncesi ve sonrasında oluşabilecek değişikliklerin morfolojik, histolojik ve protein düzeyinde incelenmesi amaçlandı. Bu süreçte oksidatif stres ile hücre ölümünün ilişkisi araştırıldı. Çalışmamızda Bornova Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü'nden temin edilen spesifik patojen içermeyen (SPF, specific pathogen free) 120 adet tavuk yumurtası kullanıldı. Yumurtalar, 37,5oC sıcaklıkta, yaklaşık %60-80 nem orana sahip etüvde inkübe edildi. Dört deney grubu oluşturuldu. Birinci grup kontrol grubu 20 denek. İkinci grup fosfat tampon solüsyonu (PBS; Posphate buffer solution) verilen, üçüncü grup 0,01 μg/ml anti-bFGF-2 ve dördüncü grupta 0,1 μg/ml anti-bFGF-2 ile bloklama yapılan grup olarak oluşturuldu. İkinci üçüncü ve dördüncü gruplar içinde uygulama yapılan günlere göre E2 (2. gün), E4 (4. gün), E6 (6.gün), E8 (8. gün) olmak üzere 4 alt grup oluşturuldu. PBS verilen 2. grupta her alt grup için 5'er adet toplam 20 adet, anti-FGF-2 ile bloklama yapılan 3. ve 4. gruptada her alt grupta 10'ar adet toplam 80 adet denek kullanıldı. Gelişimin farklı aşamalarında anti-temel fibroblast büyüme faktörü-2 (anti basic fibroblast growth factor 2, anti-bFGF-2) uygulandı. Fertilize yumurtalar inkübatörde 15 gün süresince inkübe edilerek 2., 4., 6. ve 8. günlerde her gruba ameliyat mikroskobu yardımı ile 1 doz olmak üzere umblikal kord etrafına 0,1 ve 0,01µg/ml olacak şekilde PBS içinde antikor ile bloklama uygulandı. E15 günü sakrifiye edildikten sonra alınan örnekler Bouin tespit solüsyonu ile fikse edildi, rutin doku takibine alınarak parafine gömüldü ve 5 μm'lik seri kesitler alındı. Makroskobik gelişim etkilenmesi morfolojik olarak, mikroskobik etkileşim Hematoksilen-Eozin, Mason Trikrom, Vonkossa ve Alizerin Red ile histokimyasal ve oksidatif stres için anti-eNOS, çoğalma için anti-PCNA ve hücre ölümü için TUNEL ile immunositokimyasal yöntemle boyanarak incelendi. Gelişimin makroskobik karşılaştırmaları morfometrik ölçümler ile boyamaların karşılaştırmaları skorlama ile gerçekleştirildi. Farkların ortaya konmasında Graphpad istatistik yazılımı kullanıldı. Tek yönlü ANOVA analizi ile yapılan karşılaştırmalarda p<0,05 anlamlı olarak kabul edildi. E4 ile E8 embriyolarının antikor ile bloklanması sonrasında E15 günü yapılan morfolojik, histolojik ve immunositokimyasal bulgularda beklenen kraniyosnostoz oluşumunun gerçekleşmediği, yerine kıkırdak hâkimiyetinin varlığı saptandı. Örneklerde morfolojik bozukluk, anomali veya gelişme geriliği gibi patolojiler saptanmadı. Antikor bloklaması ile oluşan ancak sistemik yapıyı etkilemeyen FGF-2 için sütürlerdeki eNOS boyaması ile gösterilen oksidatif stres durumunu değiştirerek PCNA ile saptanan çoğalmanın devamına ve apoptoz ile belirlenen hücre ölümüne etki yaptığı gözlendi. Bu etkilerin en belirgin bir biçimde E8 embriyolarında görüldüğü ve oluşan etkinin ve farklılıkların istatiksel olarak anlamlı olduğu saptandı. Bulgularımız FGF-2'nin anlamlı ve tekrarlanabilir bir biçimde kranial gelişimde önemli rol oynadığını, bloklandığı takdirde sütür kapanmasında gecikmeye neden olduğunu gösterdi. FGF'ün normalde kemik gelişimini hızlandırdığı ancak sütürlerde kapanmayı geciktirdiği bilgisine parelel olarak bu faktörü bloklamanın kapanmayı erkenleştirmesini beklerken tam tersi bir etkinin varlığı saptandı. Sütür aralarının bu beklenmedik etki ile daha da genişlediği izlendi. Bu sonuçlar, bloklamaya bağlı başka yan etkiler görülmemesi nedeni ile antikor ile bloklamanın kraniyosnostozlularda tedavi amaçlı kullanılabileceğini düşündürdü. Kraniyosnostoz ve fibroblast büyüme faktörü-2 ilişkisinin ve kullanılan oksidatif stres ve apoptoz ilişkisinin ileri teknikler ile daha ayrıntılı incelenmesi bu hastalıktan mağdur olan insanlara daha kaliteli bir yaşam sunmak için önemli bilgiler oluşmasını sağlayacaktır. Anahtar Kelimeler: Fibroblast Büyüme Faktörü, Tavuk embriyo, kranial sütür, kraniyosinostoz, histoloji, oksidatif stress, apoptoz.